本发明属于基因工程领域，涉及利用蓝光诱导的外源基因表达系统及其在衣藻基因表达调控和转基因衣藻生物反应器中的应用。
背景技术：
：：转基因技术是二十世纪七十年代在大肠杆菌中最早发展起来的，随着分子生物学的快速发展，外源基因的高效表达已经能为基因工程药物及工农业原料等重要的生产途径。藻类由于既具有微生物快速生长的特性又能通过光合作用合成目标产物，非常适合构建转基因藻类生物反应器。莱茵衣藻是少数三套基因组均能进行遗传转化的生物【Lumbreras,V.,Purton,S.,1998.RecentadvancesinChlamydomonastransgenics.Protist149,23–27】，其生长周期短，光合效率高，具有“光合酵母”之称，能在短时间内获得大量遗传稳定的转基因后代。然而，由于莱茵衣藻核基因组具有GC含量高（约62％）、密码子高度偏爱等特点[HarrisEH(1989).TheChlamydomonasSourceBook:AComprehensiveGuidetoBiologyandLaboratoryUse.AcademicPress,SanDiego,California],尽管大量的莱茵衣藻外源基因表达系统已经报道，但这些系统均还存在一定的局限性。最早利用莱茵衣藻核遗传系统进行转化是利用nit1基因来修复nit1基因突变株，（KindleKL,SchnellRA,FernandezE,LefebvrePA.1989.StablenucleartransformationofChlamydomonasusingtheChlamydomonasgenefornitratereductase.JCellBioi109:2589-2601），随后使用SV40和CaMV35S启动子在衣藻中表达基因的效率较低，甚至是出现“基因沉默”现象。采用内源的启动子如RBCS2、NIT可以使基因的表达水平得到大大的改善。VictoriaLumbreras等（1998）实验表明，删减RBCS2启动子上游序列约440bp后可使ble化效率提高3倍，但不能提高ble基因的表达效率，可能是被删除的序列里有负调节元件，影响了ble基因在基因组的插入和稳定【LumbrerasV.,StevensD.andPurtonS.1998.EfficientforeigngeneexpressioninChlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron.PlantJ.14,441-448】。RBCS2-HSP70是目前应用比较广泛的启动子，它是1,5-二磷酸羧化酶小亚基启动子与热激蛋白70的嵌合型启动子，在强光和热激诱导的情况下，能高效诱导外源基因的表达【ChaogangWang,ZhangliHu,AnpingLei,BaohuiJin.Biosynthesisofpoly-3-hydroxybutyrate(PHB)intransgenicgreenalgaeChlamydomonasreinhardtii.JournalofPhycology,2010,46:396-402.】，但无论是强光照射还是热激处理都会严重影响藻细胞的生长状态，且热激处理不适宜大规模培养藻类的诱导处理。蓝光是指波长在475-495nm的光，利用植物中的蓝光受体及相互作用蛋白可以构建基于蓝光诱导的基因表达系统，该系统已经在动植物细胞中广泛使用[SilvanaKonermann,MarkD.Brigham,AlexandroE.Trevinoetal.Nature,2013,50(22):472-476]，但在藻类细胞中还没有开发基于蓝光诱导调控的转基因系统。技术实现要素：本发明创造性地将酵母双杂交技术手段与蓝光受体及相互作用蛋白整合在一起，发明了一种基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统。本发明采用的技术方案为：一种基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统，该系统的元件包括光受体隐花色素CRY2基因及其相互作用蛋白CIB1基因、GAL4的DNA结合结构域BD和具有转录激活活性单纯疱疹病毒的激活域VP64、核定位序列NLS、能与GAL4转录因子DNA结合结构域BD结合的UAS序列、外源基因，其中CRY2-BD、CIB1-VP64-NLS、UAS-外源基因分别连接在一起，并通过遗传转化整合到衣藻的核基因组中。本发明所述的基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统的元件包括光受体隐花色素CRY2基因及其相互作用蛋白CIB1基因、GAL4转录因子的DNA结合结构域BD和具有转录激活活性单纯疱疹病毒的激活域VP64、能与GAL4转录因子DNA结合结构域BD结合的UAS序列、外源基因，其中CRY2-BD、CIB1-VP64、UAS-外源基因分别连接在一起，并通过遗传转化整合到衣藻的核基因组中。莱茵衣藻表达的CRY2-BD融合蛋白结合在转基因藻核基因组DNA的UAS序列上，形成包括CRY2-BD融合蛋白和UAS-外源基因序列组成的复合体)，而CIB1-VP64-NLS融合蛋白则游离于核质中；当蓝光照射时，由于CRY2与CIB1发生相互作用，使游离于核质中的CIB1-AD也结合在UAS上，形成VP64-CIB1与CRY2-BD及UAS-外源基因组成的复合物,VP64能激活UAS下游的外源基因表达。当停止蓝光照射时，CIB1与CRY2分离，VP64就不能激活UAS下游的外源基因表达。利用该系统表达的外源基因可以是功能基因，也可以是调控基因，该系统能有效地应用于衣藻细胞基因的表达调控。本发明专利的有益效果包括：(1)以单色光-蓝光作为诱导外源基因表达的诱导因素，克服了热激诱导对藻细胞的伤害,也克服了各种化学诱导剂对藻细胞代谢的影响;(2)藻细胞对蓝光的响应时间短,当蓝光诱导终止,外源基因表达很快停止,有利于进行衣藻基因表达的可逆调控;(3)蓝光诱导操作简单,不需要对诱导物质进行分离纯化,大大降低转基因衣藻生物反应器的生产成本。附图说明图1为基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统构建示意图；图中：5’RBCS2是载体抗性基因的启动子；ble和Hyg分别代表博来霉素（zeocin）和潮霉素（Hygromycin）的抗性筛选标记基因。图中展示了载体改造，抗性替换，及最终所需两个载体的构建过程。箭头指向带字母的框表示通过酶切和连接的步骤将箭头平端连接的片断替换为箭头所指的片断。箭头指向横线表示将所示片断插入箭头所指示的位置。图2为基于蓝光诱导表达荧光素酶基因的转基因衣藻的转化与筛选流程示意图；图中：抗性筛选步骤中培养皿上所示圆形绿点为单克隆藻株。“筛选到的转基因藻株实例”一图为筛选到含有两个质粒抗性的转基因藻株的培养皿，图中最后一个培养皿箭头指示了部分阳性单克隆。图3为报告基因在莱茵衣藻中蓝光诱导表达效果示意图；图中：对在红光下生长到对数生长期的藻液进行连续两天的蓝光诱导：第一天在纯蓝光下诱导8小时，然后放回红光下恢复16小时；第二天在白光下再次持续诱导12小时。柱形图以作为报告基因的外源表达调控序列的调控效果作为报告基因表达水平的标志，将CC-849未经蓝光诱导的样本设定为1，则纵坐标为相对表达效果，横坐标为处理时间，单位为小时，虚线为表达水平趋势折线图；下方的示意图展示了绿藻外源基因表达系统蓝光开关的调控机理。具体实施方式下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。实施例1基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统及构建基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统所需的两个载体骨架均在本实验室保存的载体pH124（参照ZL201110070784.1）基础上改造而成。载体的改造过程如下。首先，将热激启动的载体pH124改造为组成型表达的载体pDb124。衣藻PsaD具有组成型高表达的特点，因此选用该基因的5’端和3’端序列用于介导光调控蛋白的组成型表达。经PCR在5’PsaD序列中引入NotⅠ和PmaCⅠ酶切位点，通过NotⅠ和PmaCⅠ位点的酶切和连接将载体pH124启动子的HSP70-RBCS2序列替换为822bp的5’PsaD序列。经PCR在3’PsaD序列中引入NheⅠ和EcoRⅠ酶切位点，通过NheⅠ和EcoRⅠ位点的酶切和连接将载体pH124的3’RBCS2序列替换为624bp的5’PsaD序列。由此得到的组成型表达的载体命名为pDb124。第二，对载体进行抗性改造，分别得到具有博来霉素抗性的载体和具有潮霉素抗性的载体。由于光控组件分布于两个载体上，在构建转基因藻株的时候需要两个载体分别具有不同的抗性，便于筛选双抗性转化子。载体pDb124具有Ble基因，使用zeocin筛选。利用酶切位点EcoRⅤ和XbaⅠ切下pDb124中的5’RBCS2-ble片段，再接入利用PCR得到的5’RBCS2片段和Hyg片段，得到的载体称为pDh124。Hyg代表潮霉素（Hygromycin）的抗性筛选标记基因，可利用HygromycinB筛选衣藻转化子。第三，构建GAL4BD-CIB1片段。GAL4BD是DNA结合域，CIB1是蓝光受体的互作蛋白，该步骤目的在于构建GAL4BD-CIB1融合蛋白的表达序列。利用PCR在GAL4转录因子的BD序列两端分别引入PmaCⅠ和NheⅠ酶切位点，连入克隆用中间载体。GAL4BD的3’端序列中本身具有NdeⅠ和PstⅠ酶切位点。利用PCR在CIB1的CDS序列两端分别引入NdeⅠ和PstⅠ酶切位点，通过这两个酶切位点把CIB1连入GAL4BD的3’端。第四，构建VP64-CRY2-UAS序列。VP64是转录激活域，CRY2是拟南芥蓝光受体，UAS（UpstreamActivateSequence）是与BD特异结合的序列。用全基因合成的方法合成VP64-UAS序列，并在VP64序列和UAS序列之间设计了NdeⅠ和ClaⅠ酶切位点，再将CRY2的CDS序列通过酶切插入VP64和UAS之间。考虑到该序列本身具有PmaCⅠ和NheⅠ酶切位点，在VP64-UAS序列两端分别引入PmaCⅠ的同尾酶SmaⅠ和NheⅠ的同尾酶XbaⅠ酶切位点。该序列合成后连接在克隆用中间载体中。经PCR在CRY2的CDS序列两端分别引入NdeⅠ和ClaⅠ酶切位点，通过这两个位点的酶切和连接将CRY2序列连接在VP64序列和UAS序列之间，与VP64序列形成融合蛋白。第五，构建pDb124-BD-CIB1载体。将构建好的GAL4BD-CIB1片段用PmaCⅠ和NheⅠ酶切位点从中间载体上切下，连入已经用PmaCⅠ和NheⅠ双酶切线性化的pDb124载体，得到pDb124-BD-CIB1载体。第六，构建pDh124-VP64-CRY2-UAS载体。将构建好的VP64-CRY2-UAS片段用SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点从中间载体上切下，连入已经用PmaCⅠ和NheⅠ双酶切线性化的pDh124载体，得到pDh124-VP64-CRY2-UAS载体。第七，构建pDh124-VP64-CRY2-UAS-reporter载体。本发明使用一段长141个碱基的表达调控序列作为报告基因，将该序列连同酶切位点全序列合成，连入pDh124-VP64-CRY2-UAS载体的UAS序列之后，得到pDh124-VP64-CRY2-UAS-reporter载体。最终具有zeocin抗性的pDb124-BD-CIB1载体和具有HygromycinB抗性的pDh124-VP64-CRY2-UAS-reporter载体将用于莱茵衣藻的转化。实施例2衣藻荧光素酶基因表达载体的转化与转基因藻筛选莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1×106cells/mL，收集离心后用TAP培养液重悬，调整细胞浓度至1×108cells/mL；吸取300μL悬浮液到5mL的两个试管里（内含已灭菌的石英砂），将pDb124-BD-CIB1表达载体酶切成线状，取1μg-2μg加入试管，CC-849/石英砂/载体DNA混合物快速振荡15秒后；把混合液转移到25mL的带螺旋帽的离心管中，加入10mL灭菌TAP培养液，在室温度下40rpm振荡摇床过夜培养（光照条件为90μE/m2/s）；室温离心收集细胞，去上清，用0.5mLTAP重悬，加入3.5mL0.5％TAP培养基，混匀后倒在TAP平板上（含博来霉素（zeocin），22℃光照培养箱里培养10－15天，平板全部退去绿色后再长出的绿色单克隆为筛选到的转化子。通过分子检测确定BD-CIB1已经在转化子中高效表达后进行二次转化，按上述方法将pDh124-VP64-CRY2-UAS-Luc转入含潮霉素（Hygromycin）抗性的TAP平板，22℃光照培养箱里培养10－15天，平板全部退去绿色后再长出的绿色单克隆为筛选到的转化子。对转化子进行分子检测，确定获得转基因藻株。实施例3外源报告基因在莱茵衣藻种蓝光诱导表达转基因藻及CC-849在培养瓶中等量接种，以保证含有相同藻类生物量；然后在持续红光下培养转基因藻及CC-849到对数生长期，检测报告基因的表达水平，作为参照；之后放入持续蓝光照射下培养，24小时后对两个基因型的藻细胞进行收集，检测外源报告序列的表达水平，结果发现转基因藻株有外源报告序列的转录，且显著受到蓝光的诱导，而蓝光诱导对CC-849则没有影响。说明基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统构建成功，可以用于外源功能及调控序列的高效表达，且蓝光去除后再次开启蓝光可反复诱导靶序列表达。白光中含有蓝光波段的光，因此也具有诱导目标序列表达的效果，且实验证明白光和蓝光一样可以产生诱导效果。序列表<110>深圳大学<120>一种基于蓝光诱导的衣藻外源基因表达系统<160>7<210>1<211>261<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)...(261)<223><400>1>VP64ATGGGCCCCAAGAAGAAGCGCAAGGTGGCCCCCCCCACCGACGTGAGCCTGGGCGACGAGCTGCACCTGGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCCCACGCCGACGCCCTGGACGACTTCGACCTGGACATGCTGGGCGACGGCGACAGCCCCGGCCCCGGCTTCACCCCCCACGACAGCGCCCCCTACGGCGCCCTGGACATGGCCGACTTCGAGTTCGAGCAGATGTTCACCGACGCCCTGGGCATCGACGAGTACGGCGGC<210>2<211>155<212>DNA<213>人工序列<400>2>UASCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGACTCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGATCGGAGTACTGTCCTCCGCGAATTCCGGAGTACTGTCCTCCGAAGACGCTAGCGGGGGGCTATAAAAGGGGGTGGGGGCGTTCGTCCTCACTCT<210>3<211>1839<212>DNA<213>拟南芥种（Arabidopsisthaliana）<400>3>CRY2（AT1G04400）ATGAAGATGGACAAAAAGACTATAGTTTGGTTTAGAAGAGACCTAAGGATTGAGGATAATCCTGCATTAGCAGCAGCTGCTCACGAAGGATCTGTTTTTCCTGTCTTCATTTGGTGTCCTGAAGAAGAAGGACAGTTTTATCCTGGAAGAGCTTCAAGATGGTGGATGAAACAATCACTTGCTCACTTATCTCAATCCTTGAAGGCTCTTGGATCTGACCTCACTTTAATCAAAACCCACAACACGATTTCAGCGATCTTGGATTGTATCCGCGTTACCGGTGCTACAAAAGTCGTCTTTAACCACCTCTATGATCCTGTTTCGTTAGTTCGGGACCATACCGTAAAGGAGAAGCTGGTGGAACGTGGGATCTCTGTGCAAAGCTACAATGGAGATCTATTGTATGAACCGTGGGAGATATACTGCGAAAAGGGCAAACCTTTTACGAGTTTCAATTCTTACTGGAAGAAATGCTTAGATATGTCGATTGAATCCGTTATGCTTCCTCCTCCTTGGCGGTTGATGCCAATAACTGCAGCGGCTGAAGCGATTTGGGCGTGTTCGATTGAAGAACTAGGGCTGGAGAATGAGGCCGAGAAACCGAGCAATGCGTTGTTAACTAGAGCTTGGTCTCCAGGATGGAGCAATGCTGATAAGTTACTAAATGAGTTCATCGAGAAGCAGTTGATAGATTATGCAAAGAACAGCAAGAAAGTTGTTGGGAATTCTACTTCACTACTTTCTCCGTATCTCCATTTCGGGGAAATAAGCGTCAGACACGTTTTCCAGTGTGCCCGGATGAAACAAATTATATGGGCAAGAGATAAGAACAGTGAAGGAGAAGAAAGTGCAGATCTTTTTCTTAGGGGAATCGGTTTAAGAGAGTATTCTCGGTATATATGTTTCAACTTCCCGTTTACTCACGAGCAATCGTTGTTGAGTCATCTTCGGTTTTTCCCTTGGGATGCTGATGTTGATAAGTTCAAGGCCTGGAGACAAGGCAGGACCGGTTATCCGTTGGTGGATGCCGGAATGAGAGAGCTTTGGGCTACCGGATGGATGCATAACAGAATAAGAGTGATTGTTTCAAGCTTTGCTGTGAAGTTTCTTCTCCTTCCATGGAAATGGGGAATGAAGTATTTCTGGGATACACTTTTGGATGCTGATTTGGAATGTGACATCCTTGGCTGGCAGTATATCTCTGGGAGTATCCCCGATGGCCACGAGCTTGATCGCTTGGACAATCCCGCGTTACAAGGCGCCAAATATGACCCAGAAGGTGAGTACATAAGGCAATGGCTTCCCGAGCTTGCGAGATTGCCAACTGAATGGATCCATCATCCATGGGACGCTCCTTTAACCGTACTCAAAGCTTCTGGTGTGGAACTCGGAACAAACTATGCGAAACCCATTGTAGACATCGACACAGCTCGTGAGCTACTAGCTAAAGCTATTTCAAGAACCCGTGAAGCACAGATCATGATCGGAGCAGCACCTGATGAGATTGTAGCAGATAGCTTCGAGGCCTTAGGGGCTAATACCATTAAAGAACCTGGTCTTTGCCCATCTGTGTCTTCTAATGACCAACAAGTACCTTCGGCTGTTCGTTACAACGGGTCAAAGAGAGTGAAACCTGAGGAAGAAGAAGAGAGAGACATGAAGAAATCTAGGGGATTCGATGAAAGGGAGTTGTTTTCGACTGCTGAATCTTCTTCTTCTTCGAGTGTGTTTTTCGTTTCGCAGTCTTGCTCGTTGGCATCAGAAGGGAAGAATCTGGAAGGTATTCAAGATTCATCTGATCAGATTACTACAAGTTTGGGAAAAAATGGTTGCAAATGA<210>4<211>1008<212>DNA<213>拟南芥种（Arabidopsisthaliana）<400>4>CIB1（AT4G34530）ATGAATGGAGCTATAGGAGGTGACCTTTTGCTCAATTTTCCTGACATGTCGGTCCTAGAGCGCCAAAGGGCTCACCTCAAGTACCTCAATCCCACCTTTGATTCTCCTCTCGCCGGCTTCTTTGCCGATTCTTCAATGATTACCGGCGGCGAGATGGACAGCTATCTTTCGACTGCCGGTTTGAATCTTCCGATGATGTACGGTGAGACGACGGTGGAAGGTGATTCAAGACTCTCAATTTCGCCGGAAACGACGCTTGGGACTGGAAATTTCAAGAAACGGAAGTTTGATACAGAGACTAAGGATTGTAATGAGAAGAAGAAGAAGATGACGATGAACAGAGATGACCTAGTAGAAGAAGGAGAAGAAGAGAAGTCGAAAATAACAGAGCAAAACAATGGGAGCACAAAAAGCATCAAGAAGATGAAACACAAAGCCAAGAAAGAAGAGAACAATTTCTCTAATGATTCATCTAAAGTGACGAAGGAATTGGAGAAAACGGATTATATTCATGTTCGTGCACGACGAGGCCAAGCCACTGATAGTCACAGCATAGCAGAACGAGTTAGAAGAGAAAAGATCAGTGAGAGAATGAAGTTTCTACAAGATTTGGTTCCTGGATGCGACAAGATCACAGGCAAAGCAGGGATGCTTGATGAAATCATTAACTATGTTCAGTCTCTTCAGAGACAAATCGAGTTCTTATCGATGAAACTAGCAATTGTGAATCCAAGGCCGGATTTTGATATGGATGACATTTTTGCCAAAGAGGTTGCCTCAACTCCAATGACTGTGGTGCCATCTCCTGAAATGGTTCTTTCCGGTTATTCTCATGAGATGGTTCACTCTGGTTATTCTAGTGAGATGGTTAACTCCGGTTACCTTCATGTCAATCCAATGCAGCAAGTGAATACCAGTTCTGATCCATTGTCATGCTTCAACAATGGCGAAGCTCCTTCGATGTGGGACTCTCATGTGCAGAATCTCTATGGCAATTTAGGAGTTTGA<210>5<211>153<212>DNA<213>人工序列<400>5>reporter-AMD1ACTAGTGCGGGGCCCTGACACCACTGCGGCCGCCTACTCGGTGGTTCATTAACGCCGCGCCTGGACCCGAGGGAGGACCCCTCGGGACCCGGTACGTCGTTAATGAACCACCGAATACGCGGTCGCGGTGGGGTCAGGTCCTTCCGCTTTAAA当前第1页1 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