一种绿侧花海葵抗肿瘤寡肽及其用途的制作方法

本发明涉及一种海洋活性物质，特别涉及一种绿侧花海葵抗肿瘤寡肽及其用途。
背景技术：
：海葵(Seaanemone)属于原始海洋生物，六放珊瑚亚纲的一目，有六科三十七种，分布广泛，常见于热带和温带海底岩石和泥沙中。目前，各国科学家对海葵毒素钾离子通道和钠离子通道活性做了大量的研究；另外，其降血压、抗真菌和抗肿瘤的研究也有大量报道。但是由于海葵毒素含量极少、提取困难，严重制约其生理学和病理学方面的研究。参考海洋生物活性肽的研究进展发现用酶解法制备生物活性肽已经成为新的研究热点，提取得到的活性肽既能补充机体营养成分，又具有抗氧化、抗凝血、降血压、抗肿瘤等活性。前列腺癌(ProstatecancerPCa)是一种早期难被发现、却高危性的疾病，对比欧美国家，目前我国前列腺癌发病率要低得多，但是近年来由于人们饮食不均衡和环境污染，其发病率也有明显的上升趋势，成为威胁我国男性健康的重要因素。前列腺癌的发生发展与宿主免疫系统对肿瘤失去调控有关。如果得不到及时有效的治疗将发展成为雄性激素非依赖性前列腺癌，前列腺癌晚期加上骨转移将给治疗带来极大地难度。因此，寻找既能提高人体免疫能力又能有效诱导癌细胞凋亡的活性物就显得尤其重要。技术实现要素：本发明的目的在于一种绿侧花海葵抗肿瘤寡肽，既能提高人体免疫能力，又对前列腺癌细胞DU-145有明显的增殖抑制作用，具有较好的医学应用价值。本发明还提供了上述绿侧花海葵抗肿瘤寡肽的用途。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种绿侧花海葵抗肿瘤寡肽，其氨基酸序列为：Tyr-Val-Pro-Gly-Pro。本发明从绿侧花海葵肉中提取获得活性肽，并进行了分离纯化，首次报道了所提取的寡肽具有抗前列腺癌作用。Tyr：酪氨酸(Y)，Val：缬氨酸(V)，Pro：脯氨酸(P)，Gly：甘氨酸(G)。一种绿侧花海葵抗肿瘤寡肽的用途，绿侧花海葵抗肿瘤寡肽作为原料制备抗肿瘤药物的应用。作为优选，绿侧花海葵抗肿瘤寡肽作为原料制备抗前列腺癌药物的应用。一种绿侧花海葵抗肿瘤寡肽的用途绿侧花海葵抗肿瘤寡肽作为原料制备抗前列腺癌保健食品的应用。本发明的有益效果是：既能提高人体免疫能力，又对前列腺癌细胞DU-145有明显的增殖抑制作用，具有较好的医学应用价值。附图说明图1四种不同酶解产物对DU145细胞增殖抑制效果。图2不同分子量产物对DU-145细胞增殖抑制。图3AAP-I的DEAE-SepharoseFastFlow快速阴离子交换层析曲线图。图4阴离子交换柱洗脱后三个峰产物对DU-145细胞增殖抑制。图5AAP-I-1经葡聚糖凝胶G-25柱层析曲图。图6G-25各洗脱峰产物DU-145细胞增殖活性示意图。图7AAP-I-1-2的C18-HPLC图。图8AAP-H的C18-HPLC图。具体实施方式下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例：1、材料1.1原料绿侧花海葵：采集舟山海域野生海葵，经浙江海洋大学赵盛龙教授鉴定为绿侧花海葵(Anthopleuraanjunae)。1.2试剂和仪器碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶：亚太恒信生物科技有限公司；甲醇、乙腈：色谱纯，德国默克公司；聚凝胺：上海博普生物技术有限公司；F12培养基：美国Gibco公司；无支原体胎牛血清(FBS)：杭州四季青生物制品有限公司。人前列腺癌细胞DU-145购自中国科学院上海细胞生物学研究所。CF16RN型高速冷冻离心机、L8900氨基酸自动分析仪：日立仪器有限公司；Agilent-1260型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；ALPHA1-4/LDplus超滤系统：德国默克密理博公司；Forma3111型CO2培养箱：美国Thermo公司；倒置显微镜：日本OLYMPUS公司；WRO-70型超纯水机：杭州万洁水处理设备公司；酶标仪：美国BioRad科技公司。2、方法2.1材料预处理取新鲜野生绿侧花海葵置于室温干净海水中饲养一天，清洗除去杂质。用剪刀从中间剖开，置于大烧杯中，并加水覆盖，置于-20℃冰箱中冷冻12h，再置于室温自然解冻，反复三次，挤出触手毒液，然后用自来冲洗至得到白色海葵肉。高速匀浆机匀浆(10000r/min，5min)，将匀浆浸泡于异丙醇中去脂，每4h更换一次，连续换3次，去脂结束后用纯水将异丙醇冲洗干净，将海葵肉匀浆置于通风橱风中风干至无水滴，分装置于-20℃保存备用。2.2绿侧花海葵相关指标测定2.2.1基础成分测定参考GB5009.3-2010测定水分；参考GB/T5009.4-2010测灰分；参考GB50095-2010测粗蛋白含量；参考GB/T5009.6-2003测定海葵肉的粗脂肪含量。2.2.2绿侧花海葵蛋白质的氨基酸组成及含量分析参考GB/T5009.124-2003，称取海葵肉匀浆样品经6mol/L盐酸水解后，用日立L8900氨基酸自动分析仪测定氨基酸的组成及含量。2.3酶种的筛选2.3.1酶解分别取10g经过预处理的海葵肉匀浆加50mL纯净水，加酶量为1000u/g根据各种酶试剂盒上的最佳pH和温度进行调节，如表1条件进行酶解。酶解前用0.5mol/L的氢氧化钠和0.5mol/L的盐酸调节至所需pH，将样品置于恒温水浴锅中酶解，酶解时匀速缓慢搅拌。酶解结束后在水浴锅中煮沸灭活15min，然后用三层纱布过滤除去粗杂质，滤液在4℃转速为12000rpm条件下离心10min，连续离心两次。收集上清液用0.45μm针式滤膜过滤、调节pH＝7、旋蒸浓缩、冷冻干燥、产物分装置于-20℃冰箱保存备用。表1酶解条件2.3.2MTT法检测产物对DU-145细胞增殖抑制活性细胞培养：前列腺癌细胞DU-145用含10％太牛血清的F12培养液于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁生长至70％～80％汇合度时进行传代或实验。将DU-145细胞接种于96孔板中。设置对照组及药物组，药物组每孔加入浓度为5mg/mL的含酶解产物的培养液，每组设3个复孔，培养24h后加入200uL含有10％MTT的PBS缓冲液，并孵育4h。吸弃MTT培养液，加入DMSO震荡反应，酶标仪检测吸光度A值，计算抑制率(IR),计算公式为：IR＝[(对照组A值-药物组A值)/对照组A值]×100％。2.4正交实验优化绿侧花海葵抗前列腺癌寡肽的制备工艺通过2.3确定最佳的蛋白酶后，以L16(45)正交实验优化绿侧花海葵抗前列腺癌寡肽的制备工艺，以确定最佳的温度、时间、pH、加酶量和料液比，产物经浓缩冷冻干燥并采用MTT法检测对DU-145增殖抑制活性，正交实验的因素和水平如表2。表2正交实验中酶解条件的因素和水平2.5酶解液超滤按照2.4确定的最佳酶解条件进行酶解，制备绿侧花海葵抗肿瘤肽(AnthopleuraanjunaeAnti-tumorPeptide---AAP)，用ALPHA1-4/LDplus超滤系统8KD和20KD的滤膜分级，并按分子量由小到大命名为AAP-I(MW＜8KD)、AAP-II(8KD≤MW＜20KD)、AAP-III(MW≥20KD)。MTT法同2.3筛选活性最好组分。2.6DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析提前活化、平衡交换柱(2cm×35cm)，样品浓度为30mg/mL溶液，超声5min，然后用0.45μm针式滤膜过滤，每次上样3mL，分别以纯净水、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，各梯度分别洗脱30min，流速为1mL/min，用DBS-100-LCD电脑全自动部分收集器每4min收集一管，于280nm检测吸光度，并根据吸光度曲线合并洗脱峰，发现有三个峰。产物浓缩冷冻干燥，并命名为AAP-I-1、AAP-I-2、AAP-I-3。分装保存于-20℃冰箱中备用。MTT法同2.3筛选活性最好组分。2.7SephadexG25凝胶层析法分离纯化将对DU-145增殖抑制率最高的AAP-I-1采用G-25凝胶层析继续分离纯化，将样品配制成30mg/mL溶液，超声5min，然后用0.45μm针式滤膜过滤，每次加3mL到处理好的SephadexG-25层析柱(2cm×50cm)，用超纯水洗脱，流速为1.0mL/min，用DBS-100-LCD电脑全自动部分收集器每4min收集一管，于280nm检测吸光度，并根据吸光度曲线合并洗脱峰发现有三个峰。产物浓缩冷冻干燥，并命名为AAP-I-1-1、AAP-I-1-2、AAP-I-1-3。MTT法同2.3筛选活性最好组分。2.8反相高效液相色谱分离纯化将对DU-145增殖抑制率最高的AAP-I-1-2配制成5mg/mL溶液经0.22μm针式滤膜过滤后用反相高效液相色谱分离纯化。进样前平衡Agilent1260ZORBAXSB-C18(9.4mm×250mm)柱，柱温30℃；实验室时样品按300μg/mL每次进样100μL，洗脱液用乙腈超纯水混合液按1mL/min洗脱，0min～15min乙腈(20％)～(50％)，15min～30min：乙腈(50％)；检测波长为280nm。纯品采用PPSQ-31A蛋白质测序仪测定肽链氨基酸序列。2.9统计学分析实验结果采用SPASS19.0统计软件分析，并采用表示。3结果与分析3.1绿侧花海葵基础成份检测结果绿侧花海葵的基础成份如表3，从表3中可以看出，绿侧花海葵肉中含有丰富的粗蛋白，占19.76％，粗脂肪含量较低，仅为0.89％，表明绿侧花海葵是一种高蛋白，低脂肪的海产品。表3绿侧花海葵基础成分(g/100g,湿重)绿侧花海葵的氨基酸组成及含量如表4。从表4可以看出，绿侧花海葵的氨基酸种类比较齐全，必须氨基酸含量占总氨基酸含量的24.31％；鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)占总氨基酸含量高达50.58％，这也是绿侧花海葵味道鲜美的原因之一。根据表5，根据FAO/WHO对氨基酸评价的标准来说，绿侧花海葵必须氨基酸之间比值不太符合人体的氨基酸平衡要求。但有研究表明，亲水性多肽(含有Asp、Thr、Ser、Glu、Arg、Lys、His、Gln等亲水性氨基酸)可通过静电吸引方式，特异性作用于肿瘤细胞，导致其细胞膜迅速破裂，细胞内容物渗漏，最终引起肿瘤细胞死亡。绿侧花海葵肉酶解产物的亲水性氨基酸占总氨基酸含量的49.3％，亲水性氨基酸的高比例可能与其功能有关。综上所述，海葵酶解产物可以用于与抗肿瘤相关的药品、食品或者食品添加剂的开发。表4绿侧花海葵的氨基酸组成及含量(g/100g，干重)氨基酸Aminoacid含量Content氨基酸Aminoacid含量Content天门冬氨酸Asp＊7.067酪氨酸Tyr1.004苏氨酸Thr#2.700苯丙氨酸Phe#1.643丝氨酸Ser3.198赖氨酸Lys#3.099谷氨酸Glu＊8.988组氨酸His0.675甘氨酸Gly＊13.084精氨酸Arg6.693丙氨酸Ala＊4.111脯氨酸Pro4.649胱氨酸Cys0.263总氨基酸TAA65.74缬氨酸Val#2.572鲜味氨基酸FTAA33.25蛋氨酸Met#1.176必需氨基酸EAA16.01异亮氨酸Ile#1.868F/T(％)50.58％亮氨酸Leu#2.951E/T(％)24.35％注：“＊”表示鲜味氨基酸；“#”表示必须氨基酸。表5绿侧花海葵蛋白质营养评价3.2四种不同蛋白酶解产物MTT活性测试结果结果如图1所示，胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解产物对DU-145细胞增殖抑制率分别是24.98±6.04％、28.55±5.29％、31.66±4.04％和73.7±4.31％，对DU-145细胞增殖抑制活性顺序由大到小分别是：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，所以碱性蛋白酶为所需要的酶种。3.3Alcalase正交实验结果采用正交实验设计以料液比、温度、pH值、加酶量和时间5个因素，以IR值才参考指标，考察Alcalase蛋白酶最不同条件下产物对前列腺癌细胞DU-145增殖抑制活性。实验结果如表6：表6碱性蛋白酶酶解法正交实验结果采用极差分析法对上表进行分析，从Rj值大小可以看出，A(料液比)>E(时间)>D(温度)>C(加酶量)>B(pH值)。而IR值最大时的水解条件为A4B4C3D1E3.即料液比为1:5、pH为11、加酶量为2000U/g、温度为35℃、时间为6h。3.4绿侧花海葵抗前列腺癌寡肽初步分离结果将碱性蛋白酶酶解液超滤后初步分离得到的AAP-I、AAP-II、AAP-III三个组分经MTT法活性筛选后，如图2所示：三个组分对DU-145细胞的增殖抑制率分别是87.18±1.41％、74.36±2.30％、83.05±2.03％。说明组分AAP-I对DU-145增殖抑制效果最好，所以将AAP-I进行阴离子交换层析。3.5DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析结果将超滤得到的AAP-I用DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析得到三个峰产物，分别命名为AAP-I-1、AAP-I-2、AAP-I-3，如图3。将各峰产物浓缩冷冻干燥，并采用MTT法检测其对DU-145的增殖抑制活性。图4结果显示，当浓度为5mg/mL时，AAP-I-1、AAP-I-2、AAP-I-3三个峰产物对DU-145增殖抑制率分别为：37.12±1.70％、34.78±2.20％、24.21±1.6％，证明AAP-I-1对DU-145细胞增殖抑制率最高，所以将AAP-I-1进一步分离纯化。3.6SephadexG-25凝胶层析分离结果将2.5中分离的AAP-I-1采用SephadexG-25凝胶层析分离，结果得到如图5的三个峰，分别命名为AAP-I-1-1、AAP-I-1-2、AAP-I-1-3，收集后冷冻干燥，分装于-20℃冰箱保存。SephadexG-25凝胶层析的各个峰示意图将三个峰产物采用MTT法检测对DU-145增殖活性，图6结果显示，三个峰产物5mg/mL，24h对DU-145的增值抑制率分别是：30.01±2.16％、46.14±2.29％、40.53±1.76％，说明SAAP-I--1-2对DU-145增殖抑制最好。3.7AAP-I-1-2经高效液相分离结果将AAP-I-1-2经HPLC纯化后结果如图7所示，收集主峰浓缩冷冻干燥并命名为AAP-H，进行MTT活性测试，结果对DU-145增殖抑制率为49.14±2.29％，表明主峰AAP-H应该是AAP-I-1-2的主要活性物，AAP-H经高效液相检测基本单一样品，纯度大于95％，符合氨基酸序列测定要求，AAP-H高效液相检测如图8。3.8氨基酸序列测定结果氨基酸测序结果为：Tyr-Val-Pro-Gly-Pro(SEQIDNo：1)。4结论通过筛选确定碱性蛋白酶为最佳酶种，采用正交实验进一步优化酶解法提取海葵抗肿瘤肽的最佳工艺条件为:按照料液比为1:5(W/V)、pH＝11、加酶量为2000u/g、35℃条件下酶解6小时。通过超滤、阴离子交换层析、G-25凝胶层析以及反向高效液相等方法分离纯化，以产物对DU-145增殖抑制率为指标，最终纯化得到序列为Tyr-Val-Pro-Gly-Pro的肽链。当前制备生物活性肽比较常用的方法有三种：一是化学合成方法制备生物活性肽；二是以生物体或者组织为原料通过各种分离手段直接分离提取；三是采用酶解法降解生物组织或者大分子产物制备生物活性肽。由于蛋白酶酶解法生产生物活性肽具有安全性高、反应条件温和、产率相对比较高的优点，因此该方法已经成为近年来制备活性肽的研究热点。由于海洋生物生长环境独特于陆生生物，有的甚至是生长在极高压或极低温等环境中，造成海洋生物在生长过程中形成结构独特，功能新颖的活性肽。这种活性肽部分以天然状态存在，部分作为蛋白质大分子的结构域，蛋白酶通过对特定的点位剪切，可以得到活性比蛋白质更好的肽链，这些生物活性肽在调节免疫系统、抗菌、抗血栓、抗高血压、调节胃肠道运动、清除自由基、抗病毒、促进矿物元素吸收和抗癌方面发挥重要的作用。现有研究表明：肽链的生物活性主要受氨基酸组分和肽链分子量大小影响，活性肽比蛋白质、多聚肽和单纯的氨基酸具有更强的生物活性。另外肽链中的Trp、Tyr、Met、Gly、Lys、His和Pro等芳香族氨基酸或者疏水性氨基酸能很好地增强肽链的生物活性。本发明制备得到的肽链中含有Tyr、Pro和Gly，认为这种结构可能是其具有抗肿瘤活性的重要原因之一。综上所述，绿侧花海葵肉是一种蛋白含量很高的自然资源，通过酶解法制备的肽，可以用于抗前列腺癌相关的药品开发或研制成保健食品。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。SEQUENCELISTING<110>浙江海洋大学<120>一种绿侧花海葵抗肿瘤寡肽及其用途<130>2016.11<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>5<212>PRT<213>绿侧花海葵<400>1TyrValProGlyPro15当前第1页1 2 3