本发明属于遗传检测领域，特别涉及一种用于检测鼻咽癌易感性的试剂盒及其SNP标志物。
背景技术：
鼻咽癌(NPC)是一种特发性头颈部的恶性肿瘤。统计学资料分析表明，鼻咽癌病人有种族性和家族集聚现象，高发区人群移居其它地区后，仍保持高发病率，并且10％的鼻咽癌患者有癌家族史等，提示遗传易感性/遗传倾向可能是鼻咽癌发病的一个重要因素。
采用单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphsm，SNP)作为基因组标志的关联分析方法是目前最常用的疾病的遗传易感基因检测方法之一。SNP是指基因组水平上由单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的发生频率大于1％，它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP遗传稳定性强，易于检测，位于基因内部的SNP能直接影响到蛋白质的结构或表达水平，进而影响到组织、器官乃至生理功能。
对常见疾病相关多种遗传标识进行早期检测和系统评估将有助于对疾病的早期预防、诊断和治疗。目前，研究已经发现大量与各种常见疾病相关的遗传学标识，然而，由于缺乏有足够的灵敏度和可以对多种疾病相关标识进行广泛(高通量检测位点、高通量检测样本)筛查和检验的方法，使得这些常见疾病的遗传学标识无法广泛应用。此外，目前常见疾病遗传标识缺乏系统、有效的整合，大大制约了常见疾病早期预防、诊断和治疗方面的发展。现有检测只有单一种疾病或一类疾病的遗传标识检测，检测范围有限，且某些常见疾病尚无早期检测的方法。
目前，一些传统医学手段，如组织细胞检测存在着其固有的缺陷，取材位置不当、组织细胞标本材料不足或认为经验不足等都将导致鼻咽癌误诊。其他技术例如影像学虽然已被广泛应用于鼻咽癌的检查和诊断，但其在疾病鼻咽癌程度的定性上仍存在着很大的局限性。
综上所述，研发一种用于通过多个易感位点检测鼻咽癌易感性的试剂盒对鼻咽癌发病风险的预测、预防、诊断提供依据具有重要意义。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种用于检测鼻咽癌易感性的SNP标志物、SNP标志物的PCR扩增引物和单碱基延伸引物及其试剂盒，本发明的21个SNP位点为鼻咽癌的患病风险评估、诊断提供重要依据。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
一种用于检测鼻咽癌易感性的SNP标志物，所述标志物包括21个SNP位点，所述21个SNP位点为rs9344、rs13347、rs1412829、rs9418990、rs915906、rs8192780、rs3827688、rs3813865、rs2249695、rs1536826、rs29232、rs2517713、rs2975042、rs3129055、rs3131866、rs11556218、rs10889677、rs6774494、rs243865、rs2285053和rs9510787。
上述的SNP标志物的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，
所述检测rs603965的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：3；
所述检测rs13347的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：6；
所述检测rs1412829的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：9；
所述检测rs9418990的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：12；
所述检测rs915906的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：15；
所述检测rs8192780的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：18；
所述检测rs3827688的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：21；
所述检测rs3813865的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：24；
所述检测rs2249695的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：27；
所述检测rs1536826的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：30；
所述检测rs29232的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：33；
所述检测rs2517713的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：36；
所述检测rs2975042的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：39；
所述检测rs3129055的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：42；
所述检测rs3131866的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：45；
所述检测rs11556218的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：48；
所述检测rs10889677的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：51；
所述检测rs6774494的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：54；
所述检测rs243865的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：57；
所述检测rs2285053的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：60；
所述检测rs9510787的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：63。
一种用于检测鼻咽癌易感性的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2所述SNP标志物的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，用于检测外周血DNA中21个SNP位点为rs603965、rs13347、rs1412829、rs9418990、rs915906、rs8192780、rs3827688、rs3813865、rs2249695、rs1536826、rs29232、rs2517713、rs2975042、rs3129055、rs3131866、rs11556218、rs10889677、rs6774494、rs243865、rs2285053和rs9510787。
一种用于检测鼻咽癌易感性的试剂盒，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、酶切反应缓冲液、去离子水。
本发明所述的试剂盒是以本发明人基于多个国际和国内大样本量的鼻咽癌人群和正常人群鼻咽癌易感基因筛查结果的前期研究为基础，通过本发明人自主设计的鼻咽癌SNP筛选流程，从NCBI-pubmed数据库中筛选符合条件的SNP位点：1)查找与鼻咽癌相关的文献，通过影响因子和发表年限进行过滤；2)查看候选文献的摘要，进一步排除与鼻咽癌SNP研究无关的文献；3)阅读文献，找到鼻咽癌对应的SNP位点；4)以选取的SNP位点和鼻咽癌为关键词再一次查阅文献；5)判断选取的SNP位点是否与鼻咽癌密切相关，选取与鼻咽癌最密切相关的SNP位点、对应OR值以及突变碱基；6)将上一步骤获得的SNP位点，通过Sequenom公司软件Typer 4.0进行在线评估，获得最终的21个SNP位点列表。
与现有技术相比，本发明提供了一种用于检测鼻咽癌易感性的检测方法与试剂盒，达到了以下效果：本发明的21个SNP位点经过文献论证，具有较高的实用性，可用于鼻咽癌的早期评估和大规模筛查，并且该21个位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高，为鼻咽癌的患病风险评估、诊断参考提供重要依据，以实现对鼻咽癌疾病的早期评估。
以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。
实施例1 用于检测鼻咽癌易感性相关的SNP位点
其中rs9344位于基因CCND1区域；rs13347位于基因CD44区域；rs1412829位于基因CDKN2A区域；rs9418990、rs915906、rs8192780、rs3827688、rs3813865、rs2249695和rs1536826位于基因CYP2E1区域；rs29232位于基因GABBR1区域；rs2517713和rs2975042位于基因HLA-A区域；rs3129055和rs3131866位于基因HLA-F区域；rs11556218位于基因IL16区域；rs10889677位于基因IL23R区域；rs6774494位于基因MDS1-EVI1区域；rs243865和rs2285053位于基因MMP2区域；rs9510787位于基因TNFRSF19区域。
实施例2 检测鼻咽癌易感性的试剂盒
一、试剂盒的制备：
1、设计和合成所述21个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物详见表1
表1 待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物
2、试剂盒还包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、酶切反应缓冲液、去离子水。
二、试剂盒的检测方法：
1、DNA的提取
1.1 口腔拭子DNA提取
1)将口腔拭子放在2ml离心管中，加入400μl PBS。
2)加入20μl QIAGEN Protease和400μlBuffer AL。立即涡旋15s混匀。为了保证有效的裂解，样品和Buffer AL必须立即并充分混合。
3)56℃孵育10min。短暂离心。
4)加入400μl乙醇(96-100％)到样品中，涡旋混匀。短暂离心以使管盖上无液体。
5)将液体转移至离心柱，8000rpm(6000×g)离心1min。
6)柱子放入新的2ml EP管，加500μl Buffer AW1，8000rpm离心1min，弃EP管和废液。
7)柱子放入新的2mlEP管，加500μl Buffer AW2，14000rpm(20,000×g)离心3min，丢弃EP管和废液。
8)将柱子放入新的2mlEP管，14000rpm空管离心1min，丢弃EP管。
9)将柱子放入新的1.5mlEP管，加120μl Buffer AE，室温孵育5min，8000rpm离心1min，-20℃保存。
1.2 全血DNA提取
1)向1.5ml EP管中加入20μl QIAGEN Protease。
2)向管中加200μl全血样品。注：先加入酶的目的是保证酶与血液的混匀。
3)加200μl Buffer AL，涡旋混匀15s。
4)56℃孵育10min，短暂离心。注：延长孵育时间不能增加产量或提高质量。
5)加入200μl无水乙醇，涡旋15s后，短暂离心以使管盖上无液体。
6)继续口腔拭子5～10步骤。
2、PCR扩增
2.1 在一个新的1.5mlEP管中配制PCR扩增反应体系，见表2
表2 PCR扩增反应体系
以上试剂混匀后每孔各加2μl。
2.2 每孔依次加入DNA 10ng/ul 1μl，0.25uM Primer Mix 2μl，总体积5μl。
2.3 在兼容96孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为：94℃ 4min，94℃ 20s，56℃ 30min，72℃ 1min，45个循环；72℃ 3min；4℃保持。将96孔PCR反应板放置于PCR仪上，启动PCR反应。
3、PCR产物碱性磷酸酶处理
3.1 在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
3.2 配制碱性磷酸酶处理反应体系，见表3
表3 碱性磷酸酶处理反应体系
以上试剂混匀后每孔加2μl。
3.3 在兼容96孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃ 40min；85℃ 5min；4℃保持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
4 单碱基延伸
4.1 在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应。
4.2 配制单碱基延伸反应体系，见表4
表4 单碱基延伸反应体系
以上试剂混匀后每孔加1.06μl
4.3 每孔加入iPLEX Extend Primer Mix 0.94μl，总体积9μl。
4.4 在兼容96孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：94℃ 30s，94℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s；52℃ 5s，80℃ 5s 4个循环；94℃ 5s，52℃ 5s，80℃ 5s 39个循环；72℃ 3min；4℃维持。启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
5、树脂纯化
5.1 将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；
5.2 加16μl水到延伸产物的对应孔内；
5.3 将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转15min，使树脂与反应物充分接触；
5.4 3000rpm 5min离心使树脂沉入孔底部。
6、芯片点样
启动MassARRAY NanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至96孔固体支持物上，制作出芯片。
7、质谱检测
将芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization-time offlight)，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER4.0软件(Sequenom)分型并输出结果，分析受试者鼻咽癌发生风险，以实现对疾病的早期评估。
实施例3 与鼻咽癌密切相关的21个SNP位点引用的文献，见表5
表5 与鼻咽癌密切相关的21个SNP位点引用的文献
实施例4根据实施例3中引用的文献得出21个SNP位点与鼻咽癌的关联，见表6
表6 21个SNP位点与鼻咽癌的关联分析结果
实施例5 21个SNP位点的验证
采用上述实施例2中试剂盒的质谱检测方法分析21个SNP位点，检测结果使用TYPER4.0软件(Sequenom)分型并输出结果，其OR值与实施例4中表6的21个SNP位点与鼻咽癌的关联分析结果相同，说明该21个位点具有较高的实用性，可用于鼻咽癌的早期评估和大规模筛查，由于质谱分析技术具有检出成功率高、技术重现性好、性价比高，因此本发明采用的是质谱检测分析该21个位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高，为鼻咽癌的患病风险评估、诊断参考提供重要依据，以实现对鼻咽癌疾病的早期评估。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市核子基因科技有限公司
<120> 一种用于检测鼻咽癌易感性的试剂盒及其SNP标志物
<130>
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg taggtgtctc cccctgtaag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg tcctctccag agtgatcaag 30
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacatcacgc tcacttac 18
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgttggatg cttgatctca agggcgtaac 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acgttggatg aatgacttag cccaggtcac 30
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcacagcttg actaca 16
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgttggatg ccattgctat ggttactatc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgttggatg tgctttagga aactctaccc 30
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttcttttgc cattcttca 19
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgttggatg tatggaagct gcctttgtag 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgttggatg gcaaacaaca caaaagtggg 30
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gggtgaattt gggact 16
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgttggatg gcccttaagg gacaatgatg 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acgttggatg atgtctgcag ttcccttgac 30
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccttattagc acaatactga g 21
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acgttggatg gcaaagttga cagctttccc 30
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acgttggatg gaaagaggaa gtttgaacat c 31
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agctttccca aaacggt 17
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acgttggatg ttcctcaaac agctgcctgc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
acgttggatg acagtgtaag atgtggaggg 30
<210> 21
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
accactccct cctc 14
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
acgttggatg ctgatgcttc ctgttctcac 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
acgttggatg cttctagtgc ttgagagcag 30
<210> 24
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cccaccaaag ccaa 14
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acgttggatg ctgttaacag tgagactagg 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acgttggatg aataggcaga gaagggtgag 30
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
caaacggcca tcaca 15
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acgttggatg tccaggttat ctaaatgggc 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acgttggatg gaaatggctt tggaactggg 30
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tttctagcag gaacctta 18
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
acgttggatg attagacctg gcaagacctc 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
acgttggatg gcagaatttg tgcatgcacc 30
<210> 33
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
cccaccaaag ccaa 14
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
acgttggatg cttgcatcat tgtctgccac 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
acgttggatg tctgtggcat cttatgaggg 30
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ggatttctgg ctcgc 15
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
acgttggatg gtaaaggcat tattatacgg c 31
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acgttggatg gagttgcaag aaagttgagg 30
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ttatacggca ccagtc 16
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
acgttggatg atgagcccca gatatgatcc 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
acgttggatg acactgatgt ttcctcccac 30
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ggaggtatct cttccct 17
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
acgttggatg tgtcagttgg ctggatgaag 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
acgttggatg ccttgcaagg taggttcatc 30
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
aaagattttt gctgggg 17
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
acgttggatg gatttctggt actgacttcc 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
acgttggatg ccttctgaat agtcccttcc 30
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
tcacagagtg tttccaaa 18
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
acgttggatg atgtaagaat tcccgggagc 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
acgttggatg ccttcgggac cttaattctc 30
<210> 51
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gccattcttc tgcct 15
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
acgttggatg cccactcaaa attgatgatg 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
acgttggatg tgccattaag gaaaacagtc 30
<210> 54
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
acaggccatg gctt 14
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
acgttggatg ctgggccatt gtcaatgttc 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
acgttggatg ttctgagctg agacctgaag 30
<210> 57
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
cccacccagc actc 14
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
acgttggatg gtagtaaacc agtcttgccc 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
acgttggatg ggtaaaatga ggctgagacc 30
<210> 60
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ccgagaatgc ggac 14
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
acgttggatg attacttatt ggtgcaaac 29
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
acgttggatg aaagcctgag atgggctgac 30
<210> 63
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
ggtgcaaaca actgct 16