一种4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体及其制备方法和应用与流程

文档序号：19194013发布日期：2019-11-25 21:27阅读：667来源：国知局

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术：

定点突变(site-directedmutagenesis)是指通过聚合酶链反应(pcr)等方法向目的dna片段中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效地提高dna所表达的目的蛋白的性状及表征，是改造、优化基因的便捷方案，是探索启动子调节位点的有效手段，是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，也是改造基因工程菌用于工业化生产的有力工具。

1,4-二羟基-2-萘甲酸-聚异戊二烯转移酶(mena)是细菌体内一种用来催化1,4-二羟基-2-萘甲酸(dhna)和侧链聚异戊二烯生成去甲基维生素k2的关键酶，有研究表明，mena基因的过表达能将大肠杆菌合成维生素k2的能力提高2倍，远远高于单独过表达men家族的其它基因。因此，该酶活力的调节对于细菌合成维生素k2至关重要。4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶(ubia)是细菌体内一种用来催化4-羟基-萘甲酸和侧链聚异戊二烯生成3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸的酶，该酶与mena竞争同一侧链底物聚异戊二烯。因此，通过定点突变减弱ubia活力，对于提高mena表达以及维生素k2的合成具有非常重要的意义。

技术实现要素：

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体及其制备方法和应用，目的是提高维生素k2生物的合成能力。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体，其酶活性中心附近的氨基酸突变为丙氨酸，

所述4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体为第56位天冬酰胺突变为丙氨酸，核苷酸序列如seqidno.1，其氨基酸序列如seqidno.2；

所述4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体为第60位天冬氨酸突变为丙氨酸，核苷酸序列如seqidno.3，其氨基酸序列如seqidno.4；

所述4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体为第64位天冬氨酸突变为丙氨酸，核苷酸序列如seqidno.5，其氨基酸序列如seqidno.6；

所述4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体为第73位精氨酸突变为丙氨酸，核苷酸序列如seqidno.7，其氨基酸序列如seqidno.8。

本发明在ncbi公布的ubia基因(accession：eor29048)序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，氨基酸取代点分别为第56位天冬酰胺、第60位天冬氨酸、第64位天冬氨酸或第73位精氨酸。

本发明还提供含有所述4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体基因的表达载体、工程菌。

优选的，工程菌的出发菌为elizabethkingiameningoseptica。

本发明将seqidno.1，seqidno.3，seqidno.5或者seqidno.7所示的核苷酸序列以pet28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以elizabethkingiameningoseptica或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因ubia^n56a、ubia^d60a、ubia^d64a或ubia^r73a的高效表达。

所述4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，pcr扩增编码所述4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体的基因；将所得pcr产物连接表达载体pet28a，经转化后转入elizabethkingiameningoseptica细胞，得到em/pet28a-ubia工程菌；

步骤二，采用dpni法点突变质粒构建重组质粒转入elizabethkingiameningoseptica，得到待表达的突变株。

步骤一中包括重组质粒的构建步骤，其构建步骤包括：

将elizabethkingiameningoseptica原始菌培养至指数生长中期，之后提取基因组dna；

设计如下引物用于ubia的扩增：

ubia-f:5’–gaccgctcatatgatgaaaaagtattt

ubia-r:5’–cgtgaattcttatttttttaaat

其中上游引物酶切位点为ndei(ubia-f中下划线部分)，下游引物酶切位点为ecori(ubia-r中下划线部分)。

扩增产物纯化后，用ndei和ecori对pcr产物和载体pet28a进行双酶切，两者的回收产物，用t4连接酶22℃下连接4h，化学转化到dh5α细胞中，待平板上长出转化子之后，挑取转化子液体培养，提取质粒，通过酶切和pcr验证获得重组质粒pet28a-ubia，然后将重组质粒转到elizabethkingiameningoseptica细胞，得到em/pet28a-ubia工程菌。

步骤二的定点突变原理：点突变质粒的构建采用dpni法。根据待突变的氨基酸位点来设计pcr点突变引物，以pet28a-ubia质粒为模板，以设计的相关的正向引物及其互补引物(反向引物)，通过pcr扩增出产物。

n56a-f：accaccatttatattctggctgattatatggatatagagctg

n56a-r：cagctctatatccatataatcagccagaatataaatggtggt

d60a-f：ctgctgaatgattatatggctatagagctggatagaaaacatccg

d60a-r：cggatgttttctatccagctctatagccatataatcattcagcag

d64a-f：atggatatagagctggctagaaaacatccggaa

d64a-r：ttccggatgttttctagccagctctatatccat

r73a-f：ccggaaaagtgtaaagcgcctttggccagtgga

r73a-r：tccactggccaaaggcgctttacacttttccgg

其中下划线部分分别代表突变体基因编码的56位天冬酰胺、第60位天冬氨酸、第64位天冬氨酸和第73位精氨酸分别突变为丙氨酸所对应的密码子。

pcr产物用dpni酶在37℃处理3h，去除模板dna，消化产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，得到相关突变株的转化子，提取质粒，经过ecori单酶切和突变基因pcr扩增、测序，得到正确突变株，将构建成功的重组质粒转入elizabethkingiameningoseptica，得到待表达的突变株

本发明有益效果是:本发明提供的突变体酶，蛋白表达水平有明显的降低，而维生素k2生物合成能力有所提高，ubia合成量的减少，促进了mena的合成，从而最终促进了维生素k2的生物合成。本发明通过比较野生型和突变型菌株维生素k2合成能力，结果发现突变体酶菌株ubia^n56a、ubia^d60a、ubia^d64a或ubia^r73a维生素k2合成能力分别为野生型的3.42，3.51，3.21和3.63倍。

附图说明

下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：

图1是重组质粒pet28a(+)-ubia的构建图谱；

图2是定点突变的原理示意图；

图3是野生型菌株、空载菌株及突变菌株ubia蛋白表达水平比较图；

图4是野生型菌株、空载菌株及突变菌株维生素k2合成量比较图。

具体实施方式

下面对照附图，通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

所用的限制性内切酶、t4dna连接酶、pcr试剂等均购于上海生工生物工程股份有限公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、大肠杆菌dh5α菌株购于天根生物公司；引物购于英潍捷基(上海)贸易有限公司；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂。

实施例1：重组质粒的构建

将elizabethkingiameningoseptica原始菌em1-1培养至指数生长中期，取3ml菌液10,000rpm离心5min弃去上清，按照试剂盒说明提取基因组dna。

设计如下引物用于ubia的扩增：

ubia-f:5’–gaccgctcatatgatgaaaaagtattt

ubia-r:5’–cgtgaattcttatttttttaaat

其中上游引物酶切位点为ndei(ubia-f中下划线部分)，下游引物酶切位点为ecori(ubia-r中下划线部分)。

pcr扩增条件：94℃变性5min，30个循环(95℃30s，58℃30s，72℃90s)，最后72℃延伸10min。

实施例二：定点突变

定点突变原理(如图2所示)：点突变质粒的构建采用dpni法。根据待突变的氨基酸位点来设计pcr点突变引物，以pet28a-ubia质粒为模板，以设计的相关的正向引物及其互补引物(反向引物)，通过pcr扩增出产物。

n56a-f：accaccatttatattctggctgattatatggatatagagctg

n56a-r：cagctctatatccatataatcagccagaatataaatggtggt

d60a-f：ctgctgaatgattatatggctatagagctggatagaaaacatccg

d60a-r：cggatgttttctatccagctctatagccatataatcattcagcag

d64a-f：atggatatagagctggctagaaaacatccggaa

d64a-r：ttccggatgttttctagccagctctatatccat

r73a-f：ccggaaaagtgtaaagcgcctttggccagtgga

r73a-r：tccactggccaaaggcgctttacacttttccgg

其中下划线部分分别代表突变体基因编码的56位天冬酰胺、第60位天冬氨酸、第64位天冬氨酸和第73位精氨酸分别突变为丙氨酸所对应的密码子。pcr扩增体系为：质粒dna0.5ul，5×primerstarbuffer5ul，引物各0.5ul，dntp2ul，primerstar0.25ul，ddh2o补至25ul，pcr扩增条件95℃变性1min，循环18次(95℃40s，50℃15s，66℃390s)，72℃10min。

pcr产物用dpni酶在37℃处理3h，去除模板dna，消化产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，得到相关突变株的转化子，提取质粒，经过ecori单酶切和突变基因pcr扩增、测序，得到正确突变株，将构建成功的重组质粒转入elizabethkingiameningoseptica，得到待表达的突变株。

实施例三：空载菌株及突变菌株ubia蛋白表达水平和维生素k2生产能力检测表达：

挑取带有空载质粒的大肠肝菌和重组菌bl21(de3)，接种于有amp(100ug/ml)抗性的5ml的lb液体培养基(蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl1％，ph7.0)中，37℃200rpm，振荡培养至od600为0.8左右；加入1mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，18℃200rpm诱导表达6h。

提取：菌液在8000rpm、4℃离心10min，弃上清。加入40ml、ph8.0裂解缓冲液(10mmol/ltris·hcl，10mmol/lnacl，0.2％np-40)吹打混匀菌体，之后在8000rpm、4℃离心10min，弃上清，重复2次。收集菌体，取出部分用于维生素k2含量检测，其余冰上放置，加入netn裂解液，ck和pmsf(蛋白酶抑制剂)，取出一部分利用bradford法检测其蛋白含量，剩余用于检测蛋白表达水平。

westernblot检测ubia表达水平：在另外的干净管中分别加入相同蛋白质量(约50ug)的待测液，加入loadingbuffer后100℃煮沸10min，sdspage凝胶电泳分离，分离胶浓度为10％。sdspage蛋白电泳后得到的resolving胶切除杂边，转至pvdf膜(用前甲醇浸泡10min)上，冰浴加有20％甲醇的transbuffer完成转膜(100v，2h)。转膜完成后，5％脱脂牛奶封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜。tbst清洗三次后加入二抗室温避光孵育2h，暗室显影，具体如图3所示。

野生菌和突变菌维生素k2生产能力测定：原始菌、空载菌及elizabethkingiameningosepticaem/pet28a-ubia经发酵培养后，离心得到湿菌体，冷冻破碎后，甲醇提取，提取液高效液相248nm检测维生素k2含量，具体测定结果如图4所示。

上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

sequencelisting

<110>安徽工程大学

<120>一种4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体及其制备方法和应用

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>888

<212>dna

<213>elizabethkingiameningosepticaubia突变株

<400>1

atgaaaaagtatttaaaacttttacgggttgagcagtgggtgaagaatttatttgtgttt60

ttacctgtatttttttcagggaaaatagtagatgcagacctgttcagtaaaagctgtctg120

gcctttattatattttcttttaccgccagcaccatttatattctggctgattatatggat180

atagagctggatagaaaacatccggaaaagtgtaaaaggcctttggccagtggagcaata240

gcaaaaggaaccgcaataggtatatttgtttttttattacttctggtatcggggttaacc300

ggttatcttggaattgtaaaaggtatggatctggagggatttagtgtagtaattatcact360

tactttatcattaatatcctgtatacattcaaattaaaacatattgcaatagtagatatt420

tgtattatcgcaacaggttttgtcctgcgtgtgcttgccggaggttttattaccggaatt480

atggtgtcgcagtgggctatattactgactttcgtactggcactggtacttgctatagga540

aaaaggagaggggagctgattaatgcccagataaatggtaagacaagaaaagctctggat600

ggctacaatgttcagtttgcggatattgctttatcgataagctgtacactcgctattata660

tgttatctgatgtttacgctttctccggaggttcagcagaagtttcatccgaggattttt720

tataccgtaatttttgttgtttttgcattcttacgttatctgcagcaaacgcttgtatac780

aataagacagaatctccgacaaaaattatttataaagaccattatatacaggttacgatg840

ctgctttggctgtttgcatttttattaactatttatttaaaaaaataa888

<210>2

<211>295

<212>prt

<213>elizabethkingiameningosepticaubia突变株

<400>2

metlyslystyrleulysleuleuargvalgluglntrpvallysasn

151015

leuphevalpheleuprovalphepheserglylysilevalaspala

202530

aspleupheserlyssercysleualapheileilepheserphethr

354045

alaserthriletyrileleualaasptyrmetaspilegluleuasp

505560

arglyshisproglulyscyslysargproleualaserglyalaile

65707580

alalysglythralaileglyilephevalpheleuleuleuleuval

859095

serglyleuthrglytyrleuglyilevallysglymetaspleuglu

100105110

glypheservalvalileilethrtyrpheileileasnileleutyr

115120125

thrphelysleulyshisilealailevalaspilecysileileala

130135140

thrglyphevalleuargvalleualaglyglypheilethrglyile

145150155160

metvalserglntrpalaileleuleuthrphevalleualaleuval

165170175

leualaileglylysargargglygluleuileasnalaglnasngly

180185190

lysthrarglysalaleuaspglytyrasnvalglnphealaaspile

195200205

alaleuserilesercysthrleualaileileilecystyrleumet

210215220

phethrleuserprogluvalglnglnlysphehisproargilephe

225230235240

tyrthrvalilephevalvalphealapheleuargtyrleuglngln

245250255

thrleuvaltyrasnlysthrgluserprothrlysileiletyrlys

260265270

asphistyrileglnvalthrmetleuleutrpleuphealapheleu

275280285

leuthriletyrleulyslys

290295

<210>3

<211>888

<212>dna

<213>elizabethkingiameningosepticaubia突变株

<400>3

atgaaaaagtatttaaaacttttacgggttgagcagtgggtgaagaatttatttgtgttt60

ttacctgtatttttttcagggaaaatagtagatgcagacctgttcagtaaaagctgtctg120

gcctttattatattttcttttaccgccagcaccatttatattctgaatgattatatggct180