一种用于检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种用于检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的试剂盒。

背景技术：

蚊媒病毒在全世界分布广泛，是一种重要的传染病病原，主要通过蚊虫叮咬传播，传播速度快，易对人类和社会造成严重危害，特别是近年来，不断爆发蚊媒病毒疫情。蚊媒病毒大多属于黄热病毒科黄热病毒属，主要有黄热病毒、登革热病毒以及寨卡病毒，还有少数为膜病毒科甲病毒属，例如基孔肯雅病毒，这些病毒都属于蚊媒传播病毒，且近年来，不断有疫情爆发。2015年-2016年在巴西爆发寨卡病毒疫情，迅速蔓延至30多个国家和地区，同时在欧洲、北美等地的多个国家均报告发现输入性病例，我国今年也报告了多例输入性病例，由于寨卡病毒可能导致胎儿小头畸形、引起格林-巴利综合征而受到广泛关注。近年来，引起过大规模传染病爆发的蚊媒病毒还有登革热病毒和基孔肯雅病毒，世界卫生组织每年都收到大约50万份登革热病例的报告。

目前，我国已有研究机构研制出基于实时荧光定量PCR探针法的寨卡病毒检测方法、登革热病毒检测方法和基孔肯雅病毒检测方法，但这些方法均为单指标的病毒检测方法。如果需要同时筛查相关的蚊媒病毒，需要用到多种试剂盒，样品消耗量大，操作复杂，成本高昂。

目前基于实时荧光定量PCR探针法的核酸检测试剂，由于试剂中的DNA聚合酶和逆转录酶必须保存于-20℃条件下，因此，这类核酸检测试剂均需使用干冰，以保证冷链运输和低温储存，保证试剂盒不失效。但由于蚊媒相关病毒，如寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒等的多发地集中于非洲、南美和东南亚等热带地区，受当地气候条件及经济状况的限制，绝大多数地方要实现试剂的冷链运输非常困难，使得这些核酸检测试剂在这些地区的应用受到很大的限制。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的试剂盒。

本发明首先保护引物探针组合(引物探针组合甲)，由引物探针组Ⅰ、引物探针组Ⅱ和引物探针组Ⅲ组成；

所述引物探针组Ⅰ由引物ZIKV-F、引物ZIKV-R和探针ZIKV-P组成；

所述引物ZIKV-F为如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物ZIKV-R为如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述探针ZIKV-P的核苷酸序列为如下(b5)或(b6)；

(b5)如序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物探针组Ⅱ由引物DENV-F、引物DENV-R1、引物DENV-R2和探针DENV-P组成；

所述引物DENV-F为如下(c1)或(c2)；

(c1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(c2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物DENV-R1为如下(c3)或(c4)；

(c3)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(c4)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物DENV-R2为如下(c5)或(c6)；

(c5)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

(c6)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；

所述探针DENV-P的核苷酸序列为如下(c7)或(c8)；

(c7)序列表的序列7所示的单链DNA分子；

(c8)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物探针组Ⅲ由引物CHIKV-F、引物CHIKV-R和探针CHIKV-P组成；

所述引物CHIKV-F为如下(d1)或(d2)；

(d1)序列表的序列8所示的单链DNA分子；

(d2)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；

所述引物CHIKV-R为如下(d3)或(d4)；

(d3)序列表的序列9所示的单链DNA分子；

(d4)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；

所述探针CHIKV-P的核苷酸序列为如下(d5)或(d6)；

(d5)序列表的序列10所示的单链DNA分子；

(d6)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子。

所述探针ZIKV-P的末端标记有荧光基团甲，所述探针DENV-P的末端标记有荧光基团乙，所述探针CHIKV-P的末端标记有荧光基团丙。所述荧光基团甲、所述荧光基团乙和所述荧光基团丙为不同的荧光基团。

具体来说，探针ZIKV-P的5'末端具有荧光基团JOE，3’末端具有淬灭基团BHQ2。

具体来说，探针DENV-P的5'末端具有荧光基团FAM，3’末端具有淬灭基团BHQ1。

具体来说，探针CHIKV-P的5'末端具有荧光基团CY5，3’末端具有淬灭基团BHQ3。

所述引物探针组合甲的用途为如下(e1)或(e2)：

(e1)鉴定寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒；

(e2)检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒。

本发明还保护一种试剂盒(试剂盒甲)，包括所述引物探针组合甲。

具体来说，所述试剂盒甲包括反应管C；所述反应管C中包埋有所述引物ZIKV-F、所述引物ZIKV-R、所述探针ZIKV-P、所述引物DENV-F、所述引物DENV-R1、所述引物DENV-R2、所述探针DENV-P、所述引物CHIKV-F、所述引物CHIKV-R和所述探针CHIKV-P。所述引物和探针具体借助封装试剂包埋于反应管。所述封装试剂由3-10质量份琼脂糖、1-5质量份皂苷和2-6质量份羟丙基纤维素组成。所述封装试剂具体由5质量份琼脂糖、3质量份皂苷和4质量份羟丙基纤维素钠组成。反应管具体可为取八连排的PCR反应管。所述反应管C的制备方法具体如下：①将封装试剂、引物ZIKV-F、引物ZIKV-R、探针ZIKV-P、引物DENV-F、引物DENV-R1、引物DENV-R2、探针DENV-P、引物CHIKV-F、引物CHIKV-R、探针CHIKV-P和无菌水混合，得到包埋液(包埋液中，封装试剂的浓度为0.1g/100ml，引物ZIKV-F的浓度为2μM、引物ZIKV-R的浓度为2μM、探针ZIKV-P的浓度为1μM、引物DENV-F的浓度为2μM、引物DENV-R1的浓度为2μM、引物DENV-R2的浓度为2μM、探针DENV-P的浓度为1μM、引物CHIKV-F的浓度为2μM、引物CHIKV-R的浓度为2μM、探针CHIKV-P的浓度为1μM)；②向每个反应管内滴加2μl包埋液，然后冷冻干燥。

所述试剂盒甲还包括反应组分A和/或反应组分B。

所述反应组分A(无色透明的液体)：由溶质和溶剂组成；溶剂为pH8.0-8.4、50mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其在反应组分A中的浓度如下：KCl 40-100mM、MgCl₂ 1.5-4mM、dNTP 0.2-0.4mM(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为0.2-0.4mM)、热启动Taq DNA聚合酶0.1-0.5U/μl、RNase抑制剂0.5U/μl。

所述反应组分B(干粉状态)为AMV逆转录酶。

所述反应组分A具体可为：由溶质和溶剂组成；溶剂为pH8.2、50mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其在反应组分A中的浓度如下：KCl 70mM、MgCl₂ 2.8mM、dNTP 0.3mM(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为0.3mM)、热启动Taq DNA聚合酶0.3U/μl、RNase抑制剂0.5U/μl。

所述试剂盒甲还包括阳性质控品和/或阴性质控品。

阳性质控品：含有寨卡病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列11)、登革热病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列12)和基孔肯雅病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列13)的核酸溶液。阳性质控品中，各个病毒的核酸浓度均可为10⁴copies/μl。

阴性质控品：不含寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的灭活的临床阴性样本。

所述试剂盒甲的用途为如下(e1)或(e2)：

(e1)鉴定寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒；

(e2)检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒。

本发明还保护所述试剂盒甲的应用，为如下(e1)或(e2)：

(e1)鉴定寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒；

(e2)检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒。

应用所述试剂盒甲检测待测病毒是否为寨卡病毒、登革热病毒或基孔肯雅病毒的方法如下：在反应管C内加入待测病毒的核酸、反应组分A和反应组分B，然后进行检测；如果荧光基团甲的检测通道显示为阳性，待测病毒为或候选为寨卡病毒；如果荧光基团乙的检测通道显示为阳性，待测病毒为或候选为登革热病毒；如果荧光基团丙的检测通道显示为阳性，待测病毒为或候选为基孔肯雅病毒。

应用所述试剂盒甲检测待测病毒是否为寨卡病毒、登革热病毒或基孔肯雅病毒的方法具体如下：

(1)取50U反应组分B，加入100μl 50％甘油，静置至溶液呈现透明状态，涡旋混匀，瞬时离心；

(2)取反应管C，在每个管中加入10μl反应组分A、1μl步骤(1)得到的溶液和2-9μl待测溶液，加入ddH₂O至总体积为20μl，然后盖好反应管的盖子，涡旋混匀，瞬时离心，然后进行检测(寨卡病毒检测通道设为JOE，登革热病毒检测通道设为FAM，基孔肯雅病毒检测通道设为CY5)；

对于JOE检测通道，其Ct值≤37.5的样本，检测结果为寨卡病毒阳性，对于JOE检测通道Ct值＞37.5的样本，检测结果为寨卡病毒阴性；对于FAM检测通道，其Ct值≤37的样本，检测结果为登革热病毒阳性，对于FAM检测通道Ct值＞37的样本，检测结果为登革热病毒阴性；对于CY5检测通道Ct值≤36.7的样本，检测结果为基孔肯雅病毒阳性，对于CY5检测通道Ct值＞36.7的样本，检测结果为基孔肯雅病毒阴性。

应用所述试剂盒甲检测待测样本是否含有寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒的方法如下：在反应管C内加入待测病毒的核酸、反应组分A和反应组分B，然后进行检测；如果荧光基团甲的检测通道显示为阳性，待测样本含有或疑似含有寨卡病毒；如果荧光基团乙的检测通道显示为阳性，待测样本含有或疑似含有登革热病毒；如果荧光基团丙的检测通道显示为阳性，待测样本含有或疑似含有基孔肯雅病毒。

应用所述试剂盒甲检测待测样本是否含有寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒的方法具体如下：

(1)取50U反应组分B，加入100μl 50％甘油，静置至溶液呈现透明状态，涡旋混匀，瞬时离心；

(2)取反应管C，在每个管中加入10μl反应组分A、1μl步骤(1)得到的溶液和2-9μl待测溶液，加入ddH₂O至总体积为20μl，然后盖好反应管的盖子，涡旋混匀，瞬时离心，然后进行检测(寨卡病毒检测通道设为JOE，登革热病毒检测通道设为FAM，基孔肯雅病毒检测通道设为CY5)；

对于JOE检测通道，其Ct值≤37.5的样本，检测结果为寨卡病毒阳性，对于JOE检测通道Ct值＞37.5的样本，检测结果为寨卡病毒阴性；对于FAM检测通道，其Ct值≤37的样本，检测结果为登革热病毒阳性，对于FAM检测通道Ct值＞37的样本，检测结果为登革热病毒阴性；对于CY5检测通道Ct值≤36.7的样本，检测结果为基孔肯雅病毒阳性，对于CY5检测通道Ct值＞36.7的样本，检测结果为基孔肯雅病毒阴性。

以上任一所述检测的程序设置如下：50℃15-30min；95℃3-5min；95℃5-15s、60℃30-60s，45个循环。以上任一所述检测的程序设置具体如下：50℃23min；95℃4min；95℃10s、60℃45s，45个循环。

本发明还保护一种引物探针组合(引物探针组合乙)，为如下(a2)或(a3)：

(a2)由所述引物探针组Ⅰ、所述引物探针组Ⅱ和所述引物探针组Ⅲ中的任意两个组成；

(a3)所述引物探针组Ⅰ、所述引物探针组Ⅱ或所述引物探针组Ⅲ。

本发明还保护引物探针组合乙的应用，为如下(e1)或(e2)：

(e1)鉴定寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒；

(e2)检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒。

本发明还保护一种引物组合，为如下(f1)或(f2)或(f3)：

(f1)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ和所述引物组Ⅲ组成；

(f2)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ和所述引物组Ⅲ中的任意两个组成；

(f3)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ或所述引物组Ⅲ。

本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(e1)或(e2)：

(e1)鉴定寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒；

(e2)检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒。

本发明还保护一种检测待测病毒是否为寨卡病毒、登革热病毒或基孔肯雅病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病毒的核酸；如果所述核酸中含有特异片段M1、待测病毒为或候选为寨卡病毒；如果所述核酸中含有特异片段M2-1或M2-2、待测病毒为或候选为登革热病毒；如果所述核酸中含有特异片段M3、待测病毒为或候选为基孔肯雅病毒。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有寨卡病毒和/或登革热病毒和/或基孔肯雅病毒的方法，包括如下步骤：检测待测样本的核酸；如果所述核酸中含有特异片段M1、待测样本含有或疑似含有寨卡病毒；如果所述核酸中含有特异片段M2-1或M2-2、待测样本含有或疑似含有登革热病毒；如果所述核酸中含有特异片段M3、待测样本含有或疑似含有基孔肯雅病毒。

所述特异片段M1为如下(f1)、(f2)或(f3)：

(f1)寨卡病毒核酸中所述引物ZIKV-F和所述引物ZIKV-R的靶序列；

(f2)序列表的序列11第59-159位核苷酸所示的DNA分子；

(f3)序列表的序列11所示的DNA分子。

所述特异片段M2-1为如下(g1)、(g2)或(g3)：

(g1)登革热病毒(登革热病毒Ⅰ型、登革热病毒Ⅱ型或登革热病毒Ⅲ型)核酸中所述引物DENV-F和所述引物DENV-R1的靶序列；

(g2)序列表的序列12第912-1033位核苷酸所示的DNA分子；

(g3)序列表的序列12所示的DNA分子。

所述特异片段M2-2为如下(g4)、(g5)或(g6)：

(g4)登革热病毒(登革热病毒Ⅳ型)核酸中所述引物DENV-F和所述引物DENV-R2的靶序列；

(g5)序列表的序列14第942-1083位核苷酸所示的DNA分子；

(g6)序列表的序列14所示的DNA分子。

所述特异片段M3为如下(h1)、(h2)或(h3)：

(h1)寨卡病毒核酸中所述引物CHIKV-F和所述引物CHIKV-R的靶序列；

(h2)序列表的序列13第874-961位核苷酸所示的DNA分子；

(h3)序列表的序列13所示的DNA分子。

以上任一所述登革热病毒Ⅱ型具体可为DEN-2NGC株。

本发明提供的试剂盒具有如下优点：(1)可以在同一反应体系中检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒；(2)具有良好的灵敏度(寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅热病毒均可检测50copies/反应的核酸样本，寨卡病毒检测灵敏度甚至可达20copies/反应)；(3)具有良好的特异性；(4)目前，相关的核酸检测试剂由于酶在常温下不稳定，大多需要冷链运输，冷链运输过程中会用到大量的干冰，而干冰特别昂贵，提高了其运输成本，本发明提供的试剂盒可于常温运输长达30天，而保证其活性不变，此过程无需干冰，无需冷链运输，大大节省了运输成本。本发明对于寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅热病毒的检测和相关疾病的防控具有重大价值。

附图说明

图1为实施例2中RNA1相应的结果。

图2为实施例2中RNA2-1相应的结果。

图3为实施例2中RNA3相应的结果。

图4为实施例3的结果。

图5为实施例4中，RNA浓度为10²copies/μl的待测溶液的平均Ct值。

图6为实施例4中，RNA浓度为10¹copies/μl的待测溶液的平均Ct值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。RNase抑制剂：Promega公司，货号N2611。AMV逆转录酶(干粉状态)：Life Sciences Advanced Technologies,货号LRT 20116,63452U/mg。琼脂糖：Baygene公司，货号162090。

人参皂苷：Sigma公司，货号：65839。

人参皂苷的化学结构式见式(Ⅰ)。

羟丙基纤维素(average M_w～100000)：Sigma公司，货号191884。

羟丙基纤维素的化学结构式见式(Ⅱ)。

实施例1、试剂盒的制备

一、引物和探针的制备

用于检测寨卡病毒(Zika Virus)的引物探针组甲由引物ZIKV-F、引物ZIKV-R和探针ZIKV-P组成。引物ZIKV-F如序列表的序列1所示。引物ZIKV-R如序列表的序列2所示。探针ZIKV-P的核苷酸序列如序列表的序列3所示，5'末端具有荧光基团JOE，3’末端具有淬灭基团BHQ2。

ZIKV-F：5'-CAGCTGGCATCATGAAGAAYC-3'；

ZIKV-R：5'-CACYTGTCCCATCTTYTTCTCC-3'；

ZIKV-P：5'-JOE-CYGTTGTGGATGGAATAGTGG-BHQ2-3'。

用于检测登革热病毒(Dengue virus)的引物探针组乙由引物DENV-F、引物DENV-R1、引物DENV-R2和探针DENV-P组成。引物DENV-F如序列表的序列4所示。引物DENV-R1如序列表的序列5所示。引物DENV-R2如序列表的序列6所示。探针DENV-P的核苷酸序列如序列表的序列7所示，5'末端具有荧光基团FAM，3’末端具有淬灭基团BHQ1。

DENV-F：5'-GACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCC-3'；

DENV-R1：5'-CCATTCCATTTTCTGGCGTTCTG-3'；

DENV-R2：5'-CAATCCATCTTGCGGCGCTCT-3'；

DENV-P：5'-FAM-CTGTCTCYWCAGCATCATTCCAGGCA-BHQ1-3'。

用于检测基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)的引物探针组丙由引物CHIKV-F、引物CHIKV-R和探针CHIKV-P组成。引物CHIKV-F如序列表的序列8所示。引物CHIKV-R如序列表的序列9所示。探针CHIKV-P的核苷酸序列如序列表的序列10所示，5'末端具有荧光基团CY5，3’末端具有淬灭基团BHQ3。

CHIKV-F：5'-AAAGGGCAAACTYAGCTTCAC-3'；

CHIKV-R：5'-GCCTGGGCTCATCGTTATTC-3'；

CHIKV-P：5'-CY5-CGCTGTGATACAGTGGTTTCGTGTG-BHQ3-3'。

以上各个引物和探针的核苷酸序列中，Y代表C或T，W代表A或T。

二、试剂盒的制备

试剂盒由以下组分组成：

反应组分A(无色透明的液体)：由溶质和溶剂组成；溶剂为pH8.2、50mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其在反应组分A中的浓度如下：KCl 70mM、MgCl₂ 2.8mM、dNTP 0.3mM(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度均为0.3mM)、热启动Taq DNA聚合酶0.3U/μl、RNase抑制剂0.5U/μl。

反应组分B(干粉状态)：AMV逆转录酶。

反应管C：八连排管，每个管的底部包埋有引物ZIKV-F、引物ZIKV-R、探针ZIKV-P、引物DENV-F、引物DENV-R1、引物DENV-R2、探针DENV-P、引物CHIKV-F、引物CHIKV-R和探针CHIKV-P。反应管C的制备方法：①将封装试剂、引物ZIKV-F、引物ZIKV-R、探针ZIKV-P、引物DENV-F、引物DENV-R1、引物DENV-R2、探针DENV-P、引物CHIKV-F、引物CHIKV-R、探针CHIKV-P和无菌水混合，得到包埋液(包埋液中，封装试剂的浓度为0.1g/100ml，引物ZIKV-F的浓度为2μM、引物ZIKV-R的浓度为2μM、探针ZIKV-P的浓度为1μM、引物DENV-F的浓度为2μM、引物DENV-R1的浓度为2μM、引物DENV-R2的浓度为2μM、探针DENV-P的浓度为1μM、引物CHIKV-F的浓度为2μM、引物CHIKV-R的浓度为2μM、探针CHIKV-P的浓度为1μM)；封装试剂由5质量份琼脂糖、3质量份皂苷和4质量份羟丙基纤维素钠组成；②取八连排的PCR反应管，向每个反应管内滴加2μl包埋液，然后冷冻干燥。

阳性质控品：含有寨卡病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列11)、登革热病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列12)和基孔肯雅病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列13)的核酸溶液，各个病毒的核酸浓度均为10⁴copies/μl。

阴性质控品：不含寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的灭活的临床阴性样本。

三、试剂盒的使用方法

待测溶液可为溶液Ⅰ或溶液Ⅱ。溶液Ⅰ：取待测病毒，提取核酸(如果待测样本为DNA病毒，提取基因组DNA；如果待测样本为RNA病毒，提取总RNA)，得到的核酸溶液或其稀释液即为溶液Ⅰ。溶液Ⅱ：取待测样本(例如血清或血浆)，提取总RNA，得到的RNA溶液或其稀释液即为溶液Ⅱ。

1、取50U反应组分B，加入100μl 50％甘油，静置几分钟，待溶液变为透明状态，涡旋混匀15秒钟，瞬时离心，需保存于-20℃。50％甘油：甘油和水等体积混合得到的溶液。

2、取反应管C，在每个管中加入10μl反应组分A、1μl步骤1得到的溶液和2-9μl待测溶液，加入ddH₂O至总体积为20μl，然后盖好反应管的盖子，间歇涡旋混匀30s，瞬时离心，然后进行检测。

检测通道设置：寨卡病毒检测通道设为JOE，登革热病毒检测通道设为FAM，基孔肯雅病毒检测通道设为CY5，检测时同时进行三个荧光通道的检测。

程序设置如下：50℃23min；95℃4min；95℃10s、60℃45s，45个循环。

判断标准：对于JOE检测通道，其Ct值≤37.5的样本，检测结果为寨卡病毒阳性，对于JOE检测通道Ct值＞37.5的样本，检测结果为寨卡病毒阴性；对于FAM检测通道，其Ct值≤37的样本，检测结果为登革热病毒阳性，对于FAM检测通道Ct值＞37的样本，检测结果为登革热病毒阴性；对于CY5检测通道Ct值≤36.7的样本，检测结果为基孔肯雅病毒阳性，对于CY5检测通道Ct值＞36.7的样本，检测结果为基孔肯雅病毒阴性。

四、试剂盒的优点

本发明提供的试剂盒，在一个反应体系中完成逆转录过程和聚合酶链式反应过程，可有效的避免两步法中先逆转录制备cDNA，再进行PCR扩增体系配制过程中的污染。

实施例2、用于三种蚊媒病毒核酸检测试剂盒的灵敏度和特异性分析

一、模板的制备

制备寨卡病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列11)，作为RNA1。

制备登革热病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列12)，作为RNA2-1。RNA2-1对应登革热病毒Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

制备登革热病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列14)，作为RNA2-2。RNA2-2对应登革热病毒Ⅳ型。

制备基孔肯雅病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列13)，作为RNA3。

取RNA(RNA1或RNA2-1或RNA2-2或RNA3)，用无菌水稀释，得到RNA浓度为10¹⁰copies/μl的RNA溶液。取RNA溶液，用无菌水进行梯度稀释，分别得到RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl、4copies/μl的稀释液。

二、试剂盒的灵敏度和交叉特异性分析

采用实施例1的步骤二制备的试剂盒，按照实施例1的步骤三的方法进行检测，待测溶液为步骤一制备的稀释液，加入量为5μl。

RNA1相应的结果见图1和表1。图1中，每两个相似曲线为一组，代表两个重复处理，自左至右各组曲线依次对应RNA浓度由高至低的稀释液。对于寨卡病毒RNA标准品而言，待测溶液的RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl或4copies/μl，寨卡病毒检测通道均显示明显的S形扩增曲线，且Ct值＜37.5，结果为阳性。对于寨卡病毒RNA标准品而言，待测溶液的RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl或4copies/μl，登革热病毒检测通道均不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性。对于寨卡病毒RNA标准品而言，待测溶液的RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl或4copies/μl，基孔肯雅病毒检测通道均不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性。对于阴性质控品而言，寨卡病毒检测通道、登革热病毒检测通道和基孔肯雅病毒检测通道均不显示S形扩增曲线，无Ct值，扩增结果为阴性。

表1

RNA2-1相应的结果见图2和表2。图2中，每两个相似曲线为一组，代表两个重复处理，自左至右各组曲线依次对应RNA浓度由高至低的稀释液。对于登革热病毒RNA标准品而言，待测溶液的RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl或4copies/μl，寨卡病毒检测通道均不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性。对于登革热病毒RNA标准品而言，待测溶液的RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl或10¹copies/μl，登革热病毒检测通道均显示明显的S形扩增曲线，且Ct值＜37，结果为阳性。对于登革热病毒RNA标准品而言，待测溶液的RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl或4copies/μl，基孔肯雅病毒检测通道均不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性。对于阴性质控品而言，寨卡病毒检测通道、登革热病毒检测通道和基孔肯雅病毒检测通道均不显示S形扩增曲线，无Ct值，扩增结果为阴性。

表2

RNA2-2相应的结果与RNA2-1的结果一致。

RNA3相应的结果见图3和表3。图3中，每两个相似曲线为一组，代表两个重复处理，自左至右各组曲线依次对应RNA浓度由高至低的稀释液。对于基孔肯雅病毒RNA标准品而言，待测溶液的RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl或4copies/μl，寨卡病毒检测通道均不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性。对于基孔肯雅病毒RNA标准品而言，待测溶液的RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10¹copies/μl或4copies/μl，登革热病毒检测通道均不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性。对于基孔肯雅病毒RNA标准品而言，待测溶液的RNA浓度为10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl或10¹copies/μl，基孔肯雅病毒检测通道均显示明显的S形扩增曲线，且Ct值＜36.7，结果为阳性。对于阴性质控品而言，寨卡病毒检测通道、登革热病毒检测通道和基孔肯雅病毒检测通道均不显示S形扩增曲线，无Ct值，扩增结果为阴性。

表3

实施例3、试剂盒的特异性分析

与三种蚊媒病毒感染具有相似症状的常见病原体作为特异性参考品。

待测样本如下：

乙型肝炎病毒：张娟，陈建宗，张金平，贾新，蒋蔚峰；黄芪甲甙体外抗乙型肝炎病毒的作用；第四军医大学,2008,28(24):2291-2293。

EB病毒(人类疱疹病毒4型)：吴凡，翟维维，葛柳莹，祁燕伟，高辉；245例人类免疫缺陷病毒感染者唾液中人类疱疹病毒1-4型的检测情况分析；《华西口腔医学杂志》,2012,30(5):514-517。

麻疹病毒L4株：赵大鹏，姚为民，吴晓娟，戚凤春，汪春义；麻疹病毒L4株基因组全序列的测定；全国生物制品学术会议,2007。

H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Guangdong/S1322/2010(DK/GD/S1322/2010)：卢昆鹏，崔鹏飞，张芳，王晶，肖红波；H5亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定；《中国兽医科学》,2015(5):453-457。

H7N2亚型禽流感病毒(Avian in fluenzavirus,AIV)A/Chicken/Hebei/1/2002：:王传彬，田克恭，王宏伟，孙明，遇秀玲；我国H_7N_2亚型禽流感病毒CK/HB/1/02株分离鉴定；《中国病毒学》,2005,20(6):632-636。

A组轮状病毒TB-Chen株；文喻玲，李传印，范耀春，张艳，魏海涛；TB-Chen株轮状病毒NSP5/NSP6及基因型的初步研究；《病毒学报》,2009(5):349-354。

人巨细胞病毒：王敏，毛建平；人巨细胞病毒检测技术；《中国生物工程杂志》,2007,27(2):103-107。

寨卡病毒：张硕、李德新；寨卡病毒与寨卡病毒病；病毒学报，2016年1月，第32卷第1期，121-123。

登革热病毒Ⅱ型(DEN-2NGC株)：舒莉萍，左丽，李永念，郝牧，陈阿英；通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型；《贵阳医学院学报》,2004,29(4):283-286。

基孔肯雅病毒：汪玉娇，张云波，段新亚，汪亚玲，赵桂萍；基孔肯雅病毒感染的诊断技术研究进展；《临床检验杂志》,2012(7):522-524。

采用实施例1的步骤二制备的试剂盒。提取各个待测样本的核酸(如果待测样本为DNA病毒，提取基因组DNA；如果待测样本为RNA病毒，提取总RNA)，作为待测溶液，按照实施例1的步骤三的方法进行检测，待测溶液加入量为5μl。

部分检测结果如图4所示。

对于阳性质控品而言，寨卡病毒检测通道、登革热病毒检测通道和基孔肯雅病毒检测通道均为阳性结果。对于阴性质控品而言，寨卡病毒检测通道、登革热病毒检测通道和基孔肯雅病毒检测通道均为阴性结果。

对于寨卡病毒而言：寨卡病毒检测通道显示明显的S形扩增曲线，且Ct值＜37.5，结果为阳性；登革热病毒检测通道不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性；基孔肯雅病毒检测通道不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性。

对于登革热病毒Ⅱ型而言：寨卡病毒检测通道不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性；登革热病毒检测通道显示明显的S形扩增曲线，且Ct值＜37，结果为阳性；基孔肯雅病毒检测通道不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性。

对于基孔肯雅病毒而言：寨卡病毒检测通道不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性；登革热病毒检测通道不显示S形扩增曲线，无Ct值，结果为阴性；基孔肯雅病毒检测通道显示明显的S形扩增曲线，且Ct值＜36.7，结果为阳性。

其他各个病毒，寨卡病毒检测通道、登革热病毒检测通道和基孔肯雅病毒检测通道均为阴性结果。

结果表明，本发明提供的试剂盒对三种蚊媒病毒的扩增具有良好的特异性。

实施例4、用于三种蚊媒病毒核酸检测试剂盒模拟常温运输稳定性分析

采用实施例1的步骤二制备的试剂盒。

将反应组分A、反应组分B和反应管C置于摇床上，通过在室温条件下的振荡来模拟常温运输过程，分别在0天、3天、5天、10天、15天、20天、30天后作为试剂盒的组件检测待测样本。

待测样本分别为：寨卡病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列11)的稀释液，RNA浓度为10²copies/μl或10¹copies/μl；登革热病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列12)的稀释液，RNA浓度为10²copies/μl或10¹copies/μl；基孔肯雅病毒RNA标准品(单链RNA分子，其核酸序列见序列表的序列13)的稀释液，RNA浓度为10²copies/μl或10¹copies/μl。

按照实施例1的步骤三的方法检测，待测溶液加入量为5μl。

每种待测溶液进行8次重复试验，Ct值取平均值。

RNA浓度为10²copies/μl的待测溶液的平均Ct值见图5。RNA浓度为10¹copies/μl的待测溶液的平均Ct值见图6。本发明的试剂检测在常温运输条件下其活性可保持至少30天，且其检测灵敏度不变，可以满足南美等地区常温运输的问题。

实施例5、临床样本的检测

待测溶液为疑似蚊媒病毒感染病人的血清样本(共141例)，血清样本由厄瓜多尔疾控中心提供。

将每个血清样本分为两份。一份采用实施例1的步骤二制备的试剂盒，按照实施例1的步骤三的方法进行检测，待测溶液加入量为5μl。另一份采用市售ELISA试剂盒进行检测。

结果见表4。

表4

对于每一个采用采用市售ELISA试剂盒检测结果为阳性的样本采用本发明的试剂盒检测的结果也为阳性。另外，对于少数样本而言，采用市售ELISA试剂盒检测结果为阴性，但采用本发明试剂盒检测的结果为阳性，对这些样本进行病毒培养验证，结果表明本发明提供的试剂盒的检测结果正确。本发明提供的试剂盒对相应病毒的检出率高于ELISA法，且其检测结果准确可靠。

序列表

<120> 一种用于检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的试剂盒

<130> GNCYX161840

<160> 14

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)

<223> y = c or t

<400> 1

cagctggcat catgaagaay c 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4,16)

<223> y = c or t

<400> 2

cacytgtccc atcttyttct cc 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)

<223> y = c or t

<400> 3

cygttgtgga tggaatagtg g 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gactagaggt tagaggagac cccc 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccattccatt ttctggcgtt ctg 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caatccatct tgcggcgctc t 21

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)

<223> y = c or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)

<223> w = a or t

<400> 7

ctgtctcywc agcatcattc caggca 26

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)

<223> y = c or t

<400> 8

aaagggcaaa ctyagcttca c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcctgggctc atcgttattc 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgctgtgata cagtggtttc gtgtg 25

<210> 11

<211> 990

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

auguacuuga ucccaggccu acaagcggca gcagcgcgug cugcccagaa aaggacagca 60

gcuggcauca ugaagaaucc cguuguggau ggaauagugg uaacugacau ugacacaaug 120

acaauagacc cccaggugga gaagaagaug ggacaagugu uacucauagc aguagccauc 180

uccagugcug ugcugcugcg gaccgccugg ggaugggggg aggcuggagc ucugaucaca 240

gcagcgaccu ccaccuugug ggaaggcucu ccaaacaaau acuggaacuc cucuacagcc 300

accucacugu gcaacaucuu cagaggaagc uaucuggcag gagcuucccu uaucuauaca 360

gugacgagaa acgcuggccu gguuaagaga cguggaggug ggacgggaga gacucuggga 420

gagaagugga aagcucgucu gaaucagaug ucggcccugg aguucuacuc uuauaaaaag 480

ucagguauca cugaagugug uagagaggag gcucgccgug cccucaagga uggaguggcc 540

acaggaggac augccguauc ccggggaagu gcaaagauca gaugguugga ggagagagga 600

uaucugcagc ccuaugggaa gguuguugac cucggaugug gcagaggggg cuggagcuau 660

uaugccgcca ccauccgcaa agugcaggag gugagaggau acacaaaggg aggucccggu 720

caugaagaac ccaugcuggu gcaaagcuau ggguggaaca uaguucgucu caagagugga 780

guggacgucu uccacauggc ggcugagccg ugugacacuc ugcuguguga cauaggugag 840

ucaucaucua guccugaagu ggaagagaca cgaacacuca gagugcucuc uauggugggg 900

gacuggcuug aaaaaagacc aggggccuuc uguauaaagg ugcugugccc auacaccagc 960

acuaugaugg aaaccaugga gcgacugcaa 990

<210> 12

<211> 1055

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

aacaagugcc uuuuuguuca caccacuucc accagcugau caugaaggau gggagggaaa 60

uaguggugcc augccgcaac caagaugaac uuguggguag ggcuagagua ucacaaggug 120

cuggguggag ccugagagaa accgcaugcc uaggcaaauc auaugcacaa auguggcagc 180

ugauguacuu ccacaggaga gaccugagac uagccgcuaa ugccaucugu ucagccguuc 240

caguugauug ggucccaacc agccgcacca ccuggucgau ccaugcccau caccaaugga 300

ugacaacaga agacaugcug ucagugugga auaggguuug gauagaggaa aacccaugga 360

uggaggacaa aacccauaua uccaauuggg aagauguucc auauuuaggg aaaagggaag 420

aucaauggug uggaucccug auaggcuuaa cagcaagggc caccugggcc accaacauac 480

aaguggccau aaaccaagug agaagacuaa uugggaauga gaauuaucug gauuacauga 540

caucaaugaa gagauucaag aacgagagug aucccgaagg ggcacucugg ugagucaaca 600

cauuuauaaa auaaaggaaa acaagaaauu aaacaaggca agaagucagg ccggauuaag 660

ccauaguacg guaagagcua ugcugccugu gagccccguc uaaggacgua aaaugaaguc 720

aggccgaaag ccacgguuug agcaaaccgu gcugccugua gcuccaucgu ggggauguaa 780

aaaccuggga ggcugcaacc cauggaagcu guacgcaugg gguagcagac uagugguuag 840

aggagacccc ucccgaaaca uaacgcagca gcggggccca acaccagggg aagcuguacc 900

cuggugguaa ggacuagagg uuagaggaga ccccccgcau aacaauaaac agcauauuga 960

cgcugggaga gaccagagau ccugcugucu cuacagcauc auuccaggca cagaacgcca 1020

gaaaauggaa uggugcuguu gaaucaacag guucu 1055

<210> 13

<211> 990

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

auggcugcgu gagacacacg uagccuacca guuucuuacu gcucuacucu gcaaagcaag 60

agauuaagaa cccaucaugg auccugugua cguggacaua gacgcugaca gcgccuuuuu 120

gaaggcccug caacgugcgu accccauguu ugagguggaa ccuaggcagg ucacaccgaa 180

ugaccaugcu aaugcuagag cguucucgca ucuagcuaua aaacuaauag agcaggaaau 240

ugaucccgac ucaaccaucc uggauauugg uagugcgcca gcaaggagga ugaugucgga 300

caggaaguac cacugcguuu gcccgaugcg cagugcagaa gaucccgaga gacucgccaa 360

uuaugcgaga aagcuagcau cugccgcagg aaaaguccug gacagaaaca ucucuggaaa 420

gaucggggac uuacaagcag uaauggccgu gccagacacg gagacgccaa cauucugcuu 480

acacacagau guaucaugua gacagagagc agacgucgcg auauaccaag acgucuaugc 540

uguacacgca cccacgucgc uauaccacca ggcgauuaaa gggguccgau uggcguacug 600

gguaggguuu gacacaaccc cguucaugua caaugccaug gcgggugccu accccucaua 660

cucgacaaau ugggcagaug agcagguacu gaaggcuaag aacauaggau uauguucaac 720

agaccugacg gaagguagac gaggcaaauu gucuauuaug agaggaaaaa agcuagaacc 780

gugcgaccgu gugcuguucu caguaggguc aacgcucuac ccggaaagcc guaagcuacu 840

uaagagcugg caccuaccau cgguguucca uuuaaagggc aagcucagcu ucacaugccg 900

cugugauaca gugguuucgu gcgaaggcua cgucguuaag agaauaacga ugagcccagg 960

ccuuuacgga aaaaccacag gguaugcggu 990

<210> 14

<211> 1083

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

cccuuagaug agagguuuag caccucccuc cucuucuuga augacauggg aaaggugagg 60

aaagauaucc cgcaguggga accauccaag ggauggaaaa acuggcaaga gguuccuuuu 120

ugcucccacc auuuccacaa gaucuucaug aaagauggcc gcucacuagu uguuccaugc 180

agaaaccagg augaacugau aggaagagcc agaaucucgc agggggcugg auggagcuug 240

agagagacag ccugucuggg caaagcuuac gcccaaaugu ggucgcuuau guauuuccau 300

agaagggacc ugcgccuagc cuccauggcc auaugcucag caguuccaac agaaugguuu 360

ccaacaagca gaacaacaug gucaauccac gcucaucacc aguggaugac cacugaagau 420

augcuuaaag uguggaacag aguguggaua gaagauaacc ccaauaugac ugacaagacu 480

ccaguccauu cgugggaaga cauaccuuac cuagggaaaa gagaggaucu guggugcgga 540

ucccugauug gacuuucuuc cagagccacc ugggcgaaga auauucacac ggcuauaacc 600

caggucagga aucugaucgg aaaagaggaa uauguggauu acaugccagc caugaaaaga 660

uacagcgcuc cuuucgagag ugaaggaguu cuguaauugu uaacaacaaa caccaaaggg 720

accauugaag ucaggccacu ugugccacgg cuugagcaaa ccgugcugcc uguagcuccg 780

ccaauaaugg gaggcguaaa auucccaggg aggccaugcg ccacggaagc uguacgcgug 840

gcauauugga cuagcgguua gaggagaccc cucccaucac ugacaaaacg cagcaaaaaa 900

gggggcccga agccaggagg aagcuguacu ccugguggaa ggacuagagg uuagaggaga 960

cccccccaac acaaaaacag cauauugacg cugggaaaga ccagagaucc ugcugucucu 1020

gcaacaucaa uccaggcaca gagcgccgca agauggauug guguuguuga uccaacaggu 1080

ucu 1083