本发明涉及一种药物组合物及其制备方法和应用，特别涉及一种药物组合物及其制备方法和在抗万古霉素耐药菌上面的应用，属于药物化学领域。
背景技术：
细菌(Bacteria)是生物的主要类群之一，属于细菌域，是所有生物中数量最多的一类，细菌对环境、人类和动物既有用处又有危害。一些细菌成为病原体，可导致破伤风、伤寒、肺炎、梅毒、霍乱和肺结核等各类感染性疾病。在植物中，细菌导致叶斑病、火疫病和萎蔫。
在被称为抗生素“黄金时代”的五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人数约为700万，而这一数字到了1999年上升到2000万。在号称科技最发达国家的美国，1982至1992年间死于传染性疾病的人数上升了40％，死于败血症的人数上升了89％。医学家在研究这一现象后惊讶地发现，在和抗生素接触多次后，细菌已进化出一整套有效的耐药机制，耐药菌这个隐藏的“敌人”正在逐渐强大起来，造成病死率升高的主要原因是耐药菌带来的用药困难。
所谓细菌的耐药性，是指细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。同自然界其他生物一样，细菌的基因也在进化中随机发生突变。对抗生素敏感的细菌被杀死了，而基因突变后不敏感的细菌则可能存活下来，经过一次次与抗菌药物的“遭遇战”，存活下来的细菌都积累了丰富的“战斗经验”，成为变异的物种。如铜绿假单胞菌可以改变细胞膜的通透性，阻止抗菌药物的进入；结核分枝杆菌通过改变体内蛋白质结构阻止抗生素与其结合；更有甚者，有的细菌可以主动出击，产生水解酶破坏青霉素和头孢菌素类药物。细菌不但可以将突变的基因遗传给下一代，还可以通过质粒传递等方式把耐药性传递给异种菌株。时至今日，当今世界乃至我国的耐药菌问题已变得十分突出，耐药菌引起的医院感染人数，已超过住院感染患者总人数的50％。
长久以来，细菌的耐药性并未引起足够的重视，医生们相信现有抗菌药物对付耐药菌已经是绰绰有余。比如对天然青霉素耐药的金黄色葡萄球菌(金葡菌)，可以应用苯唑西林；即使出现对所有β内酰胺类耐药的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)，人们还有最后一道防线——万古霉素。万古霉素是一种高分子量的糖肽类抗菌药物，它通过与革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖前体结合，抑制细菌细胞壁合成发挥抗菌作用，临床上大多数革兰氏阳性菌对此类抗生素敏感。据报道，糖肽类抗生素(如万古霉素)曾经是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)引起全身严重感染的唯一有效药物。
但是从1992年起，美国首次发现了可对万古霉素产生耐药性的MRSA后，世界各国相继发现了万古霉素中介金黄色葡萄球菌(vancomycin intermediate Staphylococcus aureus，VISA)、异质性万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(heterogeneous vancomycin resistant Staphylococcus aureus，h-VRSA)、万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(vancomycin resistant Staphylococcus aureus，VRSA)等耐万古霉素菌株。
下面对万古霉素耐药菌耐药机理进行分析：以万古霉素耐药肠球菌为例，万古霉素耐药肠球菌自20世纪80年代后期被发现以来，已逐渐发展成为重要的医院感染病原菌，由耐万古霉素肠球菌(VRE)引发的感染日益增多，引起全世界广泛关注。VRE的耐药机制主要与万古霉素等糖肽类药物作用靶位改变有关，万古霉素耐药基因簇是介导此类靶位改变的遗传物质。万古霉素通过与肽聚糖前体物质五肽链上C末端D-Ala-D-Ala结合而抑制革兰阳性菌细胞壁的合成。VRE携带的万古霉素耐药基因簇(van gene cluster)可编码多种蛋白，合成新的细胞壁前体，并清除原有含D-Ala-D-Ala的细胞壁前体，致使糖肽类药物与细胞壁前体的亲和力下降，进而产生耐药性，是已知细菌耐药机制中最复杂的机制。根据这些基因簇的基因序列以及基因结构不同可分为9种类型，并根据它们携带的连接酶分别命名为VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG、VanL、VanM和VanN型万古霉素耐药基因簇。万古霉素耐药基因簇编码产物可催化合成与万古霉素、替考拉宁等糖肽类抗生素亲和力极低的细胞壁前体导致耐药。
万古霉素耐药基因簇编码的连接酶(ligase)是介导耐药的关键蛋白，根据基因簇中编码的连接酶不同又可分为2类：一类是D-Ala:D-Lac连接酶(D-Ala:D-Lac ligase)基因簇，包括VanA、VanB、VanD和VanM，介导产生的细胞壁前体含D-丙氨酸-D-乳酸(D-Ala-D-Lac)末端，常介导宿主菌对万古霉素高度耐药，对临床治疗影响最大，其中VanA、VanB型最为常见，近年上海地区vanM型上升迅速，并成为主要型别；另一类为D-Ala:D-Ser连接酶(D-Ala：D-Ser ligase)基因簇，包括VanC、VanE、VanG、VanL和VanN，介导产生的细胞壁前体含D-丙氨酸-D-丝氨酸(D-Ala-D-Ser)末端，携带此类基因簇的菌株表现为对万古霉素低水平耐药，故对临床治疗影响小。故研发出一种能抑制基因簇编码蛋白D-Ala:D-Lac连接酶活性，抗万古霉素高度耐药菌的化合物，对制备预防或治疗万古霉素耐药菌感染疾病的药物有重要意义，具有极大市场价值。
目前，市面上抗万古霉素耐药菌的化合物较少，但发明人研发了一种抗万古霉素耐药菌的组合物，可制备治疗万古霉素耐药菌感染疾病的药物。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种药物组合物及其制备方法和应用，该药物组合物含有活性较高的VanA型D-Ala:D-Lac连接酶的抑制剂，能阻碍连接酶参与耐药细菌中细胞壁前体D-Ala-D-Lac的合成，从而避免此类前体合成的细胞壁肽聚糖介导的万古霉素耐药性的形成，与万古霉素或替考拉宁等糖肽类药物联合，达到抑制万古霉素耐药菌生长的作用。
本发明提供了一种有活性的化合物，其具体结构如化学式(I)所示：
本发明还提供了制备上述化学式I的化合物的方法，该制备方法为以下反应a：
或反应b：
或反应c：
作为一种优选方案，所述药物组合物包括含有化学式I的化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。其作为万古霉素耐药菌抑制剂，有显著抗菌作用。
作为一种优选方案，所述药物组合物包括抗生素、含有化学式I的化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。
更优选地，所述抗生素选自糖肽类药物，如万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁等。
本发明的另一目的是提供上述药物组合物的应用，以充分发挥含化学式I的化合物在临床中的药用价值。
优选地，本发明所述的药物组合物的应用，是指以化学式I作为活性成分的化合物或其药学上可接受的盐用于制备抗菌药物的新用途。
更优选地，本发明所述的药物组合物的应用，是指以化学式I作为活性成分的化合物或其药学上可接受的盐用于制备预防或治疗万古霉素耐药菌感染疾病的药物的新用途。
优选地，本发明所述的药物组合物的应用，是以化学式I作为活性成分的的化合物或其药学上可接受的盐和抗生素的组合物用于制备抗菌药物组合物的新用途。
更优选地，本发明所述的药物组合物的应用，是以化学式I作为活性成分的的化合物或其药学上可接受的盐和抗生素的组合物用于制备预防或治疗万古霉素耐药菌感染疾病的药物的新用途。
在一些优选方案中，本发明化合物或组合物可用于治疗革兰阳性菌感染，包括万古霉素耐药菌及敏感菌引起的感染。
本发明还提供所述药物组合物在制备抗感染药物中的应用。
该抗感染药物的抗菌谱为革兰氏阳性菌及它们的耐药菌。
优选地，所述革兰氏阳性菌为：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌等中的一种或多种。
此外，本发明的术语“化合物”，如在本文中所使用，是指包括所有的立体异构体、几何异构体、互变异构体、同位素。
术语“药用盐”是指其中母体化合物通过所存在的碱部分转化成它的盐形式而进行改性的化合物的衍生物，或者其中母体化合物通过所存在的酸部分转化成它的盐形式而进行改性的化合物的衍生物。药用盐的实例包括但不限于：碱性基团(如氨)的无机或有机酸的盐，或者酸性基团(如羧酸)的无机或有机碱的盐。合适的盐被在Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418和Journal of Pharmaceutical Science,66,2(1977)中列出。
术语“药学上可接受的载体”是指一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。所述药学上可接受的载体可以是纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明的化合物可以是非对称的，例如具有一个或多个立体中心。除非有另外的限定，所有的立体异构体，可以是对映异构体和非对映异构体。含有非对称取代的碳原子的本发明的化合物可以被分离成光学纯或外消旋形式。光学纯形式可以通过外消旋体的拆分来制备，或者通过使用手性合成子(synthon)或手性试剂来制备。
本发明的化合物也可以包括互变异构体形式。互变异构体新形式由单键和相邻的双键一起伴随质子的迁移而互换所产生的。
本发明的化合物也可以包括存在于中间体或最终化合物中的原子的所有同位素形式。同位素包括具有相同的原子序数但不同的质量数的那些原子。例如，氢的同位素包括氘和氚。
本发明的化合物、以及其药用盐还包括溶剂化物形式或水合物形式。一般而言，溶剂化物形式或水合物形式与非溶剂化物形式或非水合物形式是等同的，均包括在本发明的范围内。本发明的一些化合物可以以多种晶型形式或非晶型形式存在。总体而言，化合物的所有的物理形式都包括在本发明的范围内。
本发明还包括化学式(I)化合物的前药。前药是一种由母体药物衍生的药理学物质(即药物)。一旦给药之后，前药在体内被代谢成为母体药物。前药可以通过取代在化合物中存在的一个或多个官能团来制备。关于前药的制备和使用可以在T.Higuchi and V.Stella,“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,”Vol.14of the A.C.S.Symposium Series和Bioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中找到。
上述的药物组合物可以是任何可药用的剂型，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。所述的口服剂型可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
上述各种剂型均可以按照药学领域的常规方法制备。可以通过胃肠外给药(注射)、口服给药、喷雾吸入、局部给药、经直肠给药、经鼻腔给药、阴道给药、腹膜内给药或经由植入的储库给药；物理或化学介导的方法导入如肌肉、内皮、皮下、静脉、黏膜组织；或是其他物质混合或包裹后导入机体。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。
在所述固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明提供的药物组合物可以单独给药，也可以与其它药学上可接受的化合物联合给药。
实验结果表明化合物(式I)可抑制革兰阳性菌生长，与糖肽类药物万古霉素、去甲万古霉素或替考拉宁联合，可增强糖肽类药物的抗菌活性；可望开发成治疗抗万古霉素耐药菌的药物以替代现有的无法抑制万古霉素耐药菌生长的化学药物，本发明可促使本发明提供的化合物(式I)充分发挥其药用价值。
具体实施方式
下面结合实施例及对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。下列实施例中未注明的试剂均采用市售分析纯，按照使用说明书操作。
实验材料：
(一)菌株
Enterococcus faecium BM4147(VanA型万古霉素耐药肠球菌标准株，对糖肽类药物万古霉素及替考拉宁均耐药)，由法国巴斯德研究所提供；
Enterococcus faecalis ATCC 29212(粪肠球菌ATCC标准株，对糖肽类药物万古霉素、去甲万古霉素及替考拉宁均敏感，故亦可称为万古霉素敏感肠球菌)，购自美国标准生物品收藏中心；
(二)实验试剂及耗材
阳离子调节的MH肉汤培养基(Cation-adjusted Mueller-Hinton broth)、MH琼脂培养基(Mueller-Hinton agar)、脑心浸出液培养基(Brain-heart infusion broth)及空白药敏纸片，均购自英国OXOID公司；
万古霉素及替考拉宁标准品，购自中国药品生物制品检定所；
万古霉素及替考拉宁Etest药敏试条，购自法国生物梅里埃公司；
一次性试管、培养皿及96培养板，购自青岛金典生化器材有限公司。
实施例1
反应a制备化合物(式IA)，反应如下：
经检测，该化合物(式IA)分子式为C11H7N5O3S；经检测，本实施例所得化合物(式IA)为本发明提供的化合物(式I)：
实施例2
反应b制备化合物(式IA')，反应如下：
经检测，本实施例所得化合物(式IA')与实施例1为同一化合物，即式IA与式IA'均为本发明提供的化合物(式I)：
实施例3
反应c制备化合物(式IA”)，反应如下：
经检测，本实施例所得化合物(式IA”)与实施例1为同一化合物，即式IA与式IA”均为本发明提供的化合物(式I)：
抗菌活性实验
通过纸片扩散法药敏试验来评价化合物(式I)的抗菌活性，实验步骤见美国临床实验室标准化协会(CLSI,Clinical and Laboratory Standards Institute)提供的操作手册，每张实验纸片含式I化合物50μg，抑菌实验结果见表1。
表1式I化合物纸片扩散法药敏试验结果
其中，纸片(50μg)表示纸片含式I化合物50μg，纸片(100μg)表示纸片含式I化合物100μg，纸片(空白)表示纸片不含式I化合物。
由表1可知，式I化合物在低浓度时无明显抑菌作用，但随浓度升高，对万古霉素耐药及敏感菌株均有一定抑菌作用。
式I化合物与其他抗生素联用的抗菌活性实验
本实施例与实施例1的差别仅在于采用不同浓度的式I化合物(0mM、0.1mM、0.5mM或1.0mM)与糖肽类药物(100μg万古霉素或替考拉宁)联用分别进行纸片扩散法药敏试验，以明确式I化合物与糖肽类药物联合后，对糖肽类药物抗菌活性的影响。其实验结果见表2。
表2化合物(式I)与糖肽类抗菌药物联用药敏试验结果
其中，万古霉素的用药量为16mg/L。
由表2可知，式I化合物为低浓度(0.1mM)时，与糖肽类药物(万古霉素、替考拉宁)联合，对糖肽类药物的抗菌活性无明显增强作用，但随浓度升高(0.5mM、1.0mM)，联合糖肽类药物无论对万古霉素耐药菌株还是敏感菌株，式I化合物对糖肽类药物的抗菌活性均有明显的增强作用。
万古霉素最小抑菌浓度(MIC)测定：
采用Etest方法分别对不同浓度的化合物(式I)(0mM或1.0mM)与万古霉素或替考拉宁联用进行MIC实验，实验步骤见美国临床实验室标准化协会(CLSI,Clinical and Laboratory Standards Institute)及法国生物梅里埃公司提供的操作手册，其实验结果见表3。
表3化合物(式I)与糖肽类抗菌药物联用的MIC实验结果
MIC实验所用样品与药敏性实验相同。
上述实验证明，本发明提供的化合物(式I)具有显著的抑菌活性，尤其是抑制万古霉素耐药菌的活性，此外与万古霉素联用后针对相同菌株的MIC降低，证明其与万古霉素类抗生素联用具有拮抗作用，可将本发明提供的化合物(式I)作为一种理想的抗菌药物进行进一步研发利用。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。