一种微藻及微藻的培养方法与流程

本发明涉及生物领域，特别涉及一种微藻及微藻的培养方法。

背景技术：

在化石能源日益枯竭，全球气候变暖的背景下，开展节能减排，发展循环经济，开发可再生能源，是今后科技与社会发展的重要方向。国内外许多研究者早已将目光投向了开发可替代化石能源的环境友好可再生能源，生物质能源是重要的可再生能源。微藻由于具有细胞增殖快、培养周期短、生物质产量高等优点，被认为是一种极具潜力的生物能源原料。

为了提高微藻细胞中的油脂含量，通常采用两步法进行培养：第一步利用微藻增殖培养的最优化条件，获得微藻细胞的最大生物量；第二步采用营养限制、压力环境、高光强、低温培养等条件，促进微藻中性脂的积累。专利公布号CN103352006A的发明专利“一种促进自养微藻中性脂累积的培养方法”就公开了在获得细胞增殖培养至最大生物量的前提下，通过对藻液的降温以及光照条件的改变，实现了促进和提高中性脂累积的目的，单位细胞的中性脂累积量比对照最大提高40％，但是此专利操作复杂、诱导培养时间较长，增加了培养成本。专利公布号CN103484372A的发明专利“一种提高微藻生物质和油脂产量的培养方法”采用富营养和贫营养二阶段式培养的方法，实现了生物质和油脂产量的双增长，但是中间过程中采用离心浓缩的方法，增加了能耗。上述两段式培养方法进行微藻培养及油脂累积，具有培养周期较长、培养效率低、操作步骤繁琐、应用成本较高且微藻生长量低、中性脂含量不高等问题，无法进行商业应用。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术中微藻的培养及油脂累积周期长、效率低、操作繁琐、应用成本高且获得的微藻中性脂含量不高等问题，提供一种具有高油脂含量的微藻，以及简单易行、适合于大规模培养应用、高效积累中性脂的微藻的培养方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种微藻，该微藻采用尼罗红染色法测定得微藻的单位细胞荧光强度为5.16×10⁴～6.54×10⁴a.u·cells^-1。

其中，尼罗红染色法是指：采用酶标仪检测荧光强度，激发波长为480nm，发射波长为580nm。用海水将微藻样品稀释至细胞密度为1.0×10⁶cells·mL^-1左右，加入尼罗红染料使其终质量浓度为1.00μg·mL^-1，加入DMSO(二甲基亚砜)使其终体积分数为2.0％，避光染色10min，此时测定的荧光强度为总荧光强度，总荧光强度减去微藻细胞自身荧光和海水自荧光即为微藻的尼罗红荧光强度。

中性脂含量即荧光强度，

一些实施例中，微藻为等鞭金藻、三角褐指藻或威氏海链藻中的一种或几种。

本发明同时还提供了一种微藻的培养方法，包括将待培养微藻在培养基中初步培养后，再添加壳寡糖、可溶性锌盐及2-羟基膦酰基乙酸培养得上述微藻。

一些实施例中，相对于培养基的体积，所述壳寡糖的质量为0.2-1mg·L^-1；所述可溶性锌盐中锌的摩尔质量为0.05-0.1mmol·L^-1；所述2-羟基膦酰基乙酸的摩尔质量为0.12-0.2mmol·L^-1。

一些实施例中，相对于培养基的体积，所述壳寡糖的质量为0.6-1mg·L^-1；所述可溶性锌盐中锌的摩尔质量为0.08-0.1mmol·L^-1；所述2-羟基膦酰基乙酸的摩尔质量为0.15-0.2mmol·L^-1。

一些实施例中，壳寡糖的聚合度为3-10。

一些实施例中，可溶性锌盐选自氯化锌、硫酸锌或硝酸锌中的一种或几种。

一些实施例中，所述将待培养微藻在培养基中初步培养为将微藻培养至稳定期。

一些实施例中，培养基为灭菌海水。

一些实施例中，再添加壳寡糖、可溶性锌盐及2-羟基膦酰基乙酸培养的时间为1-3天。

本发明的有益效果在于：本发明获得的微藻油脂含量高，微藻的单位细胞荧光强度可以达到5.16×10⁴～6.54×10⁴a.u·cells^-1，较现有技术提高了30-55％。本发明能提高生物量和快速积累中性脂，推测可能因为本发明添加的壳寡糖可以延长微藻稳定期，维持微藻的生物活性，2-羟基膦酰基乙酸与Zn²⁺具有协同作用，能促进微藻中性脂的累积，显著的提高了微藻中性脂肪的含量。同时本发明加入的物质，不受外界环境条件的限制，具有操作方便、实用性强，可用于微藻室内及开放式培养，且培养周期短、对水体无污染等优势，可以用于微藻规模化培养，为生物柴油产业化提供更多原料，降低产业化成本。

附图说明

图1为实施例1湛江等鞭金藻培养过程生长曲线，其中1为对照组，2为处理组；

图2为实施例2湛江等鞭金藻培养过程生长曲线，其中1为对照组，2为处理组；

图3为实施例3湛江等鞭金藻培养过程生长曲线，其中1为对照组，2为处理组；

图4为实施例4湛江等鞭金藻培养过程生长曲线，其中1为对照组，2为处理组；

图5为对比例1湛江等鞭金藻培养过程生长曲线，其中1为对照组，2为处理组；

图6为对比例2湛江等鞭金藻培养过程生长曲线，其中1为对照组，2为处理组；

图7为对比例3湛江等鞭金藻培养过程生长曲线，其中1为对照组，2为处理组。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的具体实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提供了一种微藻，该微藻采用尼罗红染色法测定得微藻的单位细胞荧光强度为5.16×10⁴～6.54×10⁴a.u·cells^-1，油脂含量高，为微生物的产业应用奠定了基础。

其中，尼罗红染色法是指：采用酶标仪检测荧光强度，激发波长为480nm，发射波长为580nm。用海水将微藻样品稀释至细胞密度为1.0×10⁶cells·mL^-1左右，加入尼罗红染料使其终质量浓度为1.00μg·mL^-1，加入DMSO使其终体积分数为2.0％，避光染色10min，此时测定的荧光强度为总荧光强度，总荧光强度减去微藻细胞自身荧光和海水自荧光即为微藻的尼罗红荧光强度。

中性脂含量即荧光强度，

一些实施例中，微藻为等鞭金藻、三角褐指藻或威氏海链藻等海洋微藻，本发明具体为等鞭金藻。

本发明同时还提供了一种微藻的培养方法，包括将待培养微藻在培养基中初步培养后，再添加壳寡糖、可溶性锌盐及2-羟基膦酰基乙酸培养得上述微藻，是一种促进微藻中性脂快速累积的方法。

一些实施例中，相对于培养基的体积，所述壳寡糖的质量为0.2-1mg·L^-1；所述可溶性锌盐中锌的摩尔质量为0.05-0.1mmol·L^-1；所述2-羟基膦酰基乙酸的摩尔质量为0.12-0.2mmol·L^-1。进一步优选，相对于培养基的体积，所述壳寡糖的质量为0.6-1mg·L^-1；所述可溶性锌盐中锌的摩尔质量为0.08-0.1mmol·L^-1；所述2-羟基膦酰基乙酸的摩尔质量为0.15-0.2mmol·L^-1，进一步促进微藻中性脂的快速累积。

一些实施例中，壳寡糖的聚合度为3-10，进一步保证微藻的稳定期。

其中，可溶性锌盐本发明没有限制，可以为本领域技术人员公知的各种含锌易溶解的无机盐类，例如，可溶性锌盐可以选自氯化锌、硫酸锌或硝酸锌中的一种或几种。

本发明优选，将待培养微藻在培养基中初步培养为将微藻培养至稳定期。一般，可通过每天取样测定培养基中微藻细胞密度，细胞密度达到7.5±0.5×10⁷cells·mL^-1左右即为达到稳定期，一般需培养5天。

优选，培养基为灭菌海水，一些实施例中具体可以通过将过滤后的天然海水110℃高温蒸汽灭菌20min，在整个培养的过程中加入f/2培养基，一些实施例中，具体的f/2培养基的组分可以为：每升f/2培养基中含有75g NaNO₃，5g NaH₂PO4·H₂O，3.15g FeCl₃·6H₂O，4.36g Na₂EDTA，0.0098g CuSO₄·5H₂O，0.0063g Na₂MoO₄·2H₂O，0.022g ZnSO₄·7H₂O，0.01g CoCl₂·6H₂O，0.18g MnCl₂·4H₂O，0.001g vitamin(维生素)B₁₂，0.2g vitamin B₁，0.001g biotin(生物素)。优选，每天1L培养基中加入1mL f/2培养基。

优选，添加壳寡糖、可溶性锌盐及2-羟基膦酰基乙酸的时期一般为微藻经过5-6天的培养，然后再添加本发明的组合物壳寡糖、可溶性锌盐及2-羟基膦酰基乙酸培养1-3天。

优选，在整个培养过程中，包括初步培养过程中，通入空气，一些实施例中具体的，以藻液即培养液的体积计，培养0-2天以60％通入空气，2天以后以80％通入空气，进一步优选通入空气中含体积比2％的CO₂气体。优选整个培养过程中培养条件为:温度25±1℃，光照强度8 000±500lx，光照时间和黑暗时间比值为12:12。

一般培养后可通过絮凝和离心的方法收集微藻，微藻收集后采用喷雾干燥得到微藻粉，保存备用。

本发明的方法能提高生物量和快速积累中性脂，具有操作方便、实用性强、培养周期短、对水体无污染、降低产业化成本等优点。

以下是本发明提供的具体实施例，用以说明上述方案及其各种条件的选取。本发明实施例中所用试剂均采用市购分析纯。

实施例1

摇瓶培养的湛江等鞭金藻转接至600mL管式反应器培养，接种量500mL、接种密度1.0×10⁷cells·mL^-1，培养基为将过滤后的天然海水110℃高温蒸汽灭菌20min，培养过程中加入f/2培养基。培养条件为:温度(25±1)℃，光照强度(8 000±500)lx，光照时间(h)和黑暗时间(h)比值为12:12，微藻培养0-2天以藻液体积的60％通入空气，2天以后以藻液体积的80％通入空气，通入空气中含体积比2％的CO₂气体,每天加入f/2培养基0.5mL。每天取样测定湛江等鞭金藻细胞密度，湛江等鞭金藻培养至第5天时，细胞密度达到7.5×10⁷cells·mL^-1左右，处理组加入0.2mg·L^-1壳寡糖、0.05mmol·L^-1 ZnCl₂和0.12mmol·L^-12-羟基膦酰基乙酸，对照组不加入上述物质，培养1天后，通过絮凝和离心的方法收集微藻，微藻收集后采用喷雾干燥得到微藻粉，保存备用。采用尼罗红染色法测定湛江等鞭金藻的中性脂含量，对照组单位细胞荧光强度为3.98×10^-4a.u·cells^-1，处理组单位细胞荧光强度为5.16×10^-4a.u·cells^-1，结果表明加入0.2mg·L^-1壳寡糖、0.05mmol·L^-1ZnCl₂和0.12mmol·L^-12-羟基膦酰基乙酸，微藻单位细胞中性脂累积量与对照相比增加约为30％。

实施例2

湛江等鞭金藻转接至600mL管式反应器培养，接种量500mL、接种密度1.0×10⁷cells·mL^-1，培养基为将过滤后的天然海水110℃高温蒸汽灭菌20min，培养过程中加入f/2培养基。培养条件为:温度(25±1)℃，光照强度(8 000±500)lx，光照时间(h)和黑暗时间(h)比值为12:12，微藻培养0-2天以藻液体积的60％通入空气，2天以后以藻液体积的80％通入空气，通入空气中含体积比2％的CO₂气体,每天加入f/2培养基0.5mL。每天取样测定湛江等鞭金藻细胞密度，湛江等鞭金藻培养至第5天时，细胞密度达到7.5×10⁷cells·mL^-1左右，处理组加入0.6mg·L^-1壳寡糖、0.08mmol·L^-1 ZnSO₄和0.18mmol·L^-12-羟基膦酰基乙酸，对照组不加入上述物质，培养2天后，通过絮凝和离心的方法收集微藻，微藻收集后采用喷雾干燥得到微藻粉，保存备用。采用尼罗红染色法测定湛江等鞭金藻的中性脂含量，处理组单位细胞荧光强度为5.90×10^-4a.u·cells^-1，对照组单位细胞荧光强度为4.15×10^-4a.u·cells^-1，结果表明加入0.6mg·L^-1壳寡糖、0.08mmol·L^-1ZnSO₄和0.18mmol·L^-12-羟基膦酰基乙酸，微藻单位细胞中性脂含量与对照相比增加42％。

实施例3

湛江等鞭金藻转接至600mL管式反应器培养，接种量500mL、接种密度1.0×10⁷cells·mL^-1，培养基为将过滤后的天然海水110℃高温蒸汽灭菌20min，培养过程中加入f/2培养基。培养条件为:温度(25±1)℃，光照强度(8 000±500)lx，光照时间(h)和黑暗时间(h)比值为12:12，微藻培养0-2天以藻液体积的60％通入空气，2天以后以藻液体积的80％通入空气，通入空气中含体积比2％的CO₂气体,每天加入f/2培养基0.5mL。每天取样测定湛江等鞭金藻细胞密度，湛江等鞭金藻培养至第5天时，细胞密度达到7.5×10⁷cells·mL^-1左右，处理组加入1.0mg·L^-1壳寡糖、0.1mmol·L^-1 ZnSO₄和0.2mmol·L^-1 2-羟基膦酰基乙酸，对照组不加入上述物质，培养3天后，通过絮凝和离心的方法收集微藻，微藻收集后采用喷雾干燥得到微藻粉，保存备用。采用尼罗红染色法测定湛江等鞭金藻的中性脂含量，实验组单位细胞荧光强度为6.54×10^-4a.u·cells^-1，对照组单位细胞荧光强度为4.22×10^-4a.u·cells^-1，结果表明加入1.0mg·L^-1壳寡糖、0.1mmol·L^-1ZnSO₄和0.2mmol·L^-1 2-羟基膦酰基乙酸，微藻单位细胞中性脂含量与对照相比增加约为55％。

实施例4

湛江等鞭金藻转接至600mL管式反应器培养，接种量500mL、接种密度1.0×10⁷cells·mL^-1，培养基为将过滤后的天然海水110℃高温蒸汽灭菌20min，培养过程中加入f/2培养基。培养条件为:温度(25±1)℃，光照强度(8 000±500)lx，光照时间(h)和黑暗时间(h)比值为12:12，微藻培养0-2天以藻液体积的60％通入空气，2天以后以藻液体积的80％通入空气，通入空气中含体积比2％的CO₂气体,每天加入f/2培养基0.5mL。每天取样测定湛江等鞭金藻细胞密度，湛江等鞭金藻培养至第5天时，细胞密度达到7.5×10⁷cells·mL^-1左右，处理组加入0.5mg·L^-1壳寡糖、0.06mmol·L^-1 ZnSO₄和0.15mmol·L^-1 2-羟基膦酰基乙酸，对照组不加入上述物质，培养3天后，通过絮凝和离心的方法收集微藻，微藻收集后采用喷雾干燥得到微藻粉，保存备用。采用尼罗红染色法测定湛江等鞭金藻的中性脂含量，处理组单位细胞荧光强度为5.68×10^-4a.u·cells^-1，对照组单位细胞荧光强度为4.18×10^-4a.u·cells^-1，结果表明加入0.5mg·L^-1壳寡糖、0.06mmol·L^-1ZnSO₄和0.15mmol·L^-12-羟基膦酰基乙酸，微藻单位细胞中性脂含量与对照相比增加约为36％。

对比例1

湛江等鞭金藻转接至600mL管式反应器培养，接种量500mL、接种密度1.0×10⁷cells·mL^-1，培养基为将过滤后的天然海水110℃高温蒸汽灭菌20min，培养过程中加入f/2培养基。培养条件为:温度(25±1)℃，光照强度(8000±500)lx，光照时间(h)和黑暗时间(h)比值为12:12，微藻培养0-2天以藻液体积的60％通入空气，2天以后以藻液体积的80％通入空气，通入空气中含体积比2％的CO₂气体,每天加入f/2培养基0.5mL。每天取样测定湛江等鞭金藻细胞密度，湛江等鞭金藻培养至第5天时，细胞密度达到7.5×10⁷cells·mL^-1左右，处理组加入0.05mmol·L^-1ZnCl₂和0.2mmol·L^-12-羟基膦酰基乙酸，对照组不加入上述物质，培养1天后，通过絮凝和离心的方法收集微藻，微藻收集后采用喷雾干燥得到微藻粉，保存备用。采用尼罗红染色法测定湛江等鞭金藻的中性脂含量，处理组单位细胞荧光强度为4.46×10^-4a.u·cells^-1，对照组单位细胞荧光强度为3.98×10^-4a.u·cells^-1，结果表明加入0.05mmol·L^-1ZnCl₂和0.2mmol·L^-1 2-羟基膦酰基乙酸微藻单位细胞中性脂含量与对照相比增加12％。

对比例2

湛江等鞭金藻转接至600mL管式反应器培养，接种量500mL、接种密度1.0×10⁷cells·mL^-1，培养基为将过滤后的天然海水110℃高温蒸汽灭菌20min，培养过程中加入f/2培养基。。培养条件为:温度(25±1)℃，光照强度(8000±500)lx，光照时间(h)和黑暗时间(h)比值为12:12，微藻培养0-2天以藻液体积的60％通入空气，2天以后以藻液体积的80％通入空气，通入空气中含体积比2％的CO₂气体,每天加入f/2培养基0.5mL。每天取样测定湛江等鞭金藻细胞密度，湛江等鞭金藻培养至第5天时，细胞密度达到7.5×10⁷cells·mL^-1左右，处理组加入0.6mg·L^-1壳寡糖及0.08mmol·L^-1ZnSO₄，对照组不加入上述物质，培养2天后，通过絮凝和离心的方法收集微藻，微藻收集后采用喷雾干燥得到微藻粉，保存备用。采用尼罗红染色法测定湛江等鞭金藻的中性脂含量，处理组单位细胞荧光强度为4.52×10^-4a.u·cells^-1，对照组单位细胞荧光强度为4.15×10^-4a.u·cells^-1，结果表明加入0.6mg·L^-1壳寡糖、0.08mmol·L^-1ZnSO₄微藻单位细胞中性脂含量与对照相比增加8.9％。

对比例3

湛江等鞭金藻转接至600mL管式反应器培养，接种量500mL、接种密度1.0×10⁷cells·mL^-1，培养基为将过滤后的天然海水110℃高温蒸汽灭菌20min，培养过程中加入f/2培养基。培养条件为：温度(25±1)℃，光照强度(8000±500)lx，光照时间(h)和黑暗时间(h)比值为12:12，微藻培养0-2天以藻液体积的60％通入空气，2天以后以藻液体积的80％通入空气，通入空气中含体积比2％的CO₂气体，每天加入f/2培养基0.5mL。每天取样测定湛江等鞭金藻细胞密度，湛江等鞭金藻培养至第5天时，通过絮凝和离心的方法收集微藻，微藻收集后采用喷雾干燥得到微藻粉，保存备用。细胞密度达到7.5×10⁷cells·mL^-1左右，处理组加入1.0mg·L^-1壳寡糖和0.2mmol·L^-12-羟基膦酰基乙酸，对照组不加入上述物质，培养3天后，采用尼罗红染色法测定湛江等鞭金藻的中性脂含量，处理组单位细胞荧光强度为4.85×10^-4a.u·cells^-1，对照组单位细胞荧光强度为4.22×10^-4a.u·cells^-1，结果表明加入1.0mg·L^-1壳寡糖和0.2mmol·L^-1 2-羟基膦酰基乙酸微藻单位细胞中性脂含量与对照相比增加15％。

本发明获得的微藻油脂含量高，微藻的单位细胞荧光强度可以达到5.16×10⁴～6.54×10⁴a.u·cells^-1，较现有技术提高了30-55％，本发明能提高生物量和快速积累中性脂，同时本发明加入的物质，不受外界环境条件的限制，具有操作方便、实用性强，可用于微藻室内及开放式培养，且培养周期短、对水体无污染等优势，可以用于微藻规模化培养，为生物柴油产业化提供更多原料，降低产业化成本。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。