本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种自凝集丙酸产甲烷菌剂的驯化方法。
背景技术：
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在能源短缺及环境污染的双重压力下，既能处理废弃物又能产生可再生能源的沼气产业得到了较快发展，从小规模的户用沼气走向了规模化生产。据统计，全国沼气用户约4300万户，全国规模化沼气工程约10万处，然而，多数沼气池由于无法长期稳定运行而处于闲置状态，大部分沼气工程至今无法盈利。由挥发性有机酸累积导致的酸抑制问题是制约沼气发酵稳定性及经济性的因素之一。酸抑制或酸败现象在餐厨垃圾、农林废弃物、城市有机垃圾、能源作物等为原料的厌氧发酵过程中常发生。酸抑制是由于厌氧发酵系统上游产酸过程与下游产甲烷过程失衡，中间产物挥发性脂肪酸累积(主要是丙酸，乙酸)，致使发酵系统pH降低，抑制了产甲烷菌的活性，最终导致发酵系统产气能力下降或者发生酸败。通常的解决方法是宏观上优化运行参数，如投加碱调节pH，或者降低有机负荷和发酵浓度，使发酵在相对较低的发酵浓度下运行，这就限制了发酵效率。随着生物强化技术在废水处理领域的应用，研究人员开始尝试将其应用到沼气发酵系统中，即人为的添加特定功能的微生物来应对酸抑制，提高发酵系统的稳定性，提高发酵浓度，或恢复酸败系统产气。
虽然，已有关于生物强化技术缓解酸抑制的报道，但是投加功能菌的多为购买的纯培养的针对丙酸降解的互营丙酸氧化细菌，或针对乙酸产甲烷过程的产甲烷古菌，亦或是人为地将几种微生物进行组合制成复合微生物菌剂。这些菌剂的制备技术存在以下问题：第一，纯培养的微生物丙酸氧化细菌或产甲烷菌作为外源投加的菌种很难适应厌氧发酵系统中的复杂环境条件，如低pH，高氨氮浓度等；第二，单一类型的微生物作为生物强化菌剂投加到厌氧发酵体系后很难抵抗土著微生物的竞争并长期地保持生物持有量以发挥强化作用。因此，为获得生物活性稳定且高效降解丙酸的生物强化菌剂，有必要提供一种有效的驯化方法。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种自凝集丙酸产甲烷菌剂的驯化方法，得到的自凝集丙酸产甲烷菌剂具有耐冲击性强，生物强化作用稳定性高等优点，还具有凝集聚团的能力，可在生长环境不利的条件下保护菌团内部菌体并维持活性，用于提高沼气发酵性能。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种自凝集丙酸产甲烷菌剂的驯化方法，该方法以沼气发酵液的胞外聚合物为接种物，以丙酸为碳源，该方法包括以下步骤：取分泌胞外聚合物的沼气发酵液，分离得到胞外聚合物接种到丙酸产甲烷的选择性培养基中，放入厌氧瓶摇床中37℃进行培养3-4周直至培养基中出现球团状的微生物凝集体；再取菌团加入新鲜的培养基，培养7-10天驯化得到的自凝集丙酸产甲烷菌团；所述选择性培养基配制方法为：在1L水中加入400mg NH4Cl、250mg MgSO4·6H2O、400mg KCl、120mg CaCl2·2H2O、80mg(NH4)2HPO4、55mg FeCl3·6H2O、5000mg NaHCO3，还加入CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、AlCl3·6H2O、ZnCl2、Na2WO4·2H2O、H3BO3、Na2SeO3、Ma2MoO4·2H2O各0.0005mg，此外还加入丙酸钠4200mg，pH调节至7.0。
所述分泌胞外聚合物的沼气发酵液，其判断方法为，大于10000rpm的转速下离心沼气发酵液10-15min后，出现发酵液分为三层的现象，上层清澈透明，中间层粘稠乳白色，底层含固体杂质黑色；所述的分离得到胞外聚合物，指大于10000rpm的转速下离心分泌胞外聚合物的沼气发酵液10-15min后，发酵液分为三层，去掉上层的澄清透明液体及底层的固体沉淀，收集中间层的粘稠乳白色物质，大于10000rpm的转速下再次离心粘稠乳白色物质15min，收集沉淀的菌泥作为接种物。
本发明还保护所述自凝集丙酸产甲烷菌的应用，上述驯化后得到的自凝集丙酸产甲烷菌用于生物强化沼气发酵，1周内可降解95％的3.0g/L的丙酸，其产气率为理论产量的70％，丙酸及乙酸的利用率大于90％。
本发明还提供一种自凝集丙酸产甲烷菌固体菌剂的制备方法，将上述驯化后得到的自凝集丙酸产甲烷菌的菌液经离心，弃去液体部分后置于厌氧环境下室温风干，收集固体粉末并真空密封保存得到目标产物。
本发明还提供一种液体浓缩自凝集丙酸产甲烷菌剂的制备方法，将上述驯化后得到的自凝集丙酸产甲烷菌菌液经离心，收集全部的固体沉淀及少许上清液，利用灭菌的液体甘油封液面以隔绝空气，-20℃低温保存。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明得到的自凝集丙酸产甲烷菌剂可快速降解丙酸，1周内可降解95％的3.0g/L的丙酸，其产气率为理论产量的70％，丙酸及乙酸的利用率大于90％。此外，由于菌剂自凝集的特性，可增加菌种间的物质传递，并保护内部菌体不受冲击，具有耐冲击性强、生物强化作用稳定性高等优点，可用于因丙酸积累导致的产气下降或酸败发酵体系，促进丙酸降解及其降解产物产甲烷，提高沼气发酵性能。
(2)本发明得到的自凝集丙酸产甲烷菌固体菌剂和液体浓缩自凝集丙酸产甲烷菌剂便于运送和长期保存。
附图说明：
图1为实施例1驯化得到的自凝集丙酸产甲烷菌团。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
本实施例接种物为分泌胞外聚合物的沼气发酵液的胞外聚合物，制备方法如下：13000rpm的转速下离心分泌胞外聚合物的沼气发酵液(餐厨垃圾发酵液或其他沼气发酵液)15min后，发酵液分为三层，上层清澈透明，中间层粘稠乳白色，底层含固体杂质黑色，收集中间层的粘稠乳白色物质，13000rpm的转速下再次离心粘稠乳白色物质15min，收集沉淀的菌泥作为接种物。
培养装置为200ml厌氧瓶。
本实施例自凝集丙酸产甲烷菌甲烷菌剂的驯化方法，包括以下步骤：取分泌胞外聚合物的沼气发酵液分离得到的胞外聚合物接种到丙酸产甲烷的选择性培养基中，放入厌氧瓶摇床中37℃进行培养3-4周直至培养基中出现球团状的微生物凝集体；再取菌团加入新鲜的培养基，培养7-10天驯化得到的自凝集丙酸产甲烷菌团，如图1所示。所述选择性培养基，配制方法为：在1L水中加入400mg NH4Cl、250mg MgSO4·6H2O、400mg KCl、120mg CaCl2·2H2O、80mg(NH4)2HPO4、55mg FeCl3·6H2O、5000mg NaHCO3，还加入CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、AlCl3·6H2O、ZnCl2、Na2WO4·2H2O、H3BO3、Na2SeO3、Ma2MoO4·2H2O各0.0005mg，此外还加入丙酸钠4200mg，pH调节至7.0。
上述驯化后得到的自凝集丙酸产甲烷菌用于生物强化沼气发酵，1周内可降解95％的3.0g/L的丙酸，其产气率为理论产量的70％，丙酸及乙酸的利用率大于90％。
将上述驯化后得到的自凝集丙酸产甲烷菌菌液以5000-8000rpm的转速离心5-10min，弃去液体部分后置于厌氧环境(厌氧操作箱，厌氧气袋)下室温风干，收集固体粉末并真空密封保存得到自凝集丙酸产甲烷菌固体菌剂。
将上述驯化后得到的自凝集丙酸产甲烷菌菌液以5000-8000rpm的转速离心5-10min，收集全部的固体沉淀及少许上清液，利用灭菌的液体甘油封液面以隔绝空气，-20℃低温保存。
实施例2：本发明获得的自凝集丙酸产甲烷菌剂对能源草厌氧发酵生物强化作用
发酵原料：边际土地种植的能源草。
接种物：猪粪处理厂厌氧发酵液。
反应装置：2L的连续CSTR在线自动采气装置。
实验设置：共运行2个2L半连续厌氧发酵罐，分别为R1，R2。R1为空白对照，即能源草独立厌氧发酵，不添加菌剂。R2为每天添加实施例1得到的自凝集丙酸产甲烷固体菌剂0.3g。
2个反应器的运行过程如下：水力停留时间(HRT)为20天，即每天排出100ml的发酵液，注入100ml的能源草与水混合物料。2个反应器共连续运行120d，即6个HRT，每个HTR的有机负荷率(OLR)依次为0.5g/L d，0.75g/L d，1.0g/L d，1.5g/L d，2.0g/L d及2.5g/L d。
结果表明：有机负荷率不高于1.0g/L d的前60天内，R1和R2均可稳定产气，但添加菌剂的R2的平均产气量比R1提高10％，当有机负荷提升至1.5g/L d时，R1未加菌剂的发酵体系产气明显下降，而R2添加菌剂的发酵体系产气量增加，此后的两个HRT，R2产气稳定，有机负荷率在2.5g/L d仍可稳定运行，发酵液中丙酸浓度小于1.0g/L。而不加菌剂的R1在有机负荷率提至2.0g/L d后已完全不能产气，丙酸浓度达到4.0g/L。
由此可见，通过本发明得到的自凝集丙酸产甲烷菌剂可应对厌氧发酵过程中的丙酸抑制，提高能源草厌氧发酵的有机负荷，促进产气。