本发明属于细胞生物学和分子生物学研究领域，具体涉及一种寡核苷酸染液及其应用与用法。
背景技术：
寡核苷酸是可人工合成的短DNA或RNA序列。寡核苷酸作为探针广泛应用于染色体鉴定。由于单链寡核苷酸(single-strand oligonucleotide，SSON)探针具有较高的敏感性和分辨率，已在小麦、黑麦等多个作物以及人类的染色体鉴定中得到应用(Fu et al.2015，Du et al.2016，Beliveau et al.2012)。SSON探针的特点是易于合成和标记检测信号，可避免常规荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)过程中的变性步骤。该方法通常称为非变性荧光原位杂交(non-denaturing FISH，ND-FISH)。随着基因组测序的发展，SSON探针的开发已由基于端粒重复序列和简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)发展到基于基因组序列和串联重复序列(Han et al.2015，Tang et al.2014)。由于SSON探针的杂交信号与基于常规质粒克隆开发的探针的杂交信号一样稳定，因此，SSON可以取代质粒克隆用于开发FISH的简化步骤。
所以开发一种能够全面鉴定物种染色体的SSON探针组具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是解决现有单一探针组成的染液不能全面鉴定物种染色体的问题，提供能够全面鉴定物种染色体的寡核苷酸染液及其用法与应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种寡核苷酸染液，所述染液包含四个寡核苷酸探针：
第一个寡核苷酸探针为YMPNS-CentC69-1，5′端由FAM修饰，其核苷酸序列为：
5′-CCCAATCCACTACTTTAGGTCCAAAACTCATGTTTGGGGTGGTTTCGCGCAATTTCGTT-3′；
第二个寡核苷酸探针为MKnob-2，5′端由FAM修饰，其核苷酸序列为：
5′-GAAGGCTAACACCTACGGATTTTTGACCAAGAAATGGTCTCCACCAGAAATCCAAAAAT-3′；
第三个寡核苷酸探针为YMPNS-MR68-3，5′端由TAMRA修饰，其核苷酸序列为：
5′-CTCTCGTGCGAATACAATGCCCTCAATATCATAGAAACACTATTCCTTTAGTGTGAATA-3′；
第四个寡核苷酸探针为(ACT)10，5′端由TAMRA修饰，其核苷酸序列为：
5′-ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT-3′。
优选的，所述寡核苷酸染液包括YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)10和2×SSC，其中YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)10四种探针组成探针混合液，所述染液按体积比计，探针混合液︰2×SSC＝22︰25；所述探针混合液由体积比YMPNS-CentC69-1:MKnob-2:YMPNS-MR68-3:(ACT)10＝20:4:15:5混合所得，其中YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)10混合前均为1.0μg/μl的水溶液。
根据本发明的另一个方面，本发明所述的寡核苷酸染液可用于玉米及其亲缘物种中染色体快速鉴定；
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种寡核苷酸染液快速鉴定玉米染色体的用法：将寡核苷酸染液加8μl在每张不经变性的染色体制片上，并加入2.5μl 50％w/v硫酸葡聚糖水溶液于37℃培养箱进行杂交2小时，然后在42℃2×SSC中洗5分钟，用DAPI套染后在荧光显微镜下进行观察。
根据本发明的又一个方面，本发明所述的寡核苷酸染液可用于制备商品化染液，优选为试剂盒及其由试剂盒衍生的其它商品。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明成本低、检测时间快，可用于大规模玉米染色体变异分析。
本发明中的探针名称YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3和(ACT)10均为本发明自己定义的名称。
附图说明：
图1为16个玉米材料的多重SSON探针核型分析。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂耗材，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，另外实验过程中如无特殊说明，所述溶液均为水溶液。
实施例
1、植物材料及染色体准备
共有16个玉米材料用于染色体分析，包括3个自交系及对应的2个杂交种，以及其它11个中国主栽杂交种(表1)。玉米种子浸在水中28℃培养过夜直至根尖长度达到2cm。切取根尖放入2ml离心管，用0.29g/L8-羟基喹啉溶液处理3～4h。然后使用体积比为3:1的乙醇冰醋酸溶液固定2-3天。进行染色体准备时，切取0.3-0.5mm的根尖组织加入45％(v/v)的冰醋酸溶液进行滴片，-70℃冷冻过夜。含有有丝分裂染色体的载玻片经100％乙醇脱水后用于FISH或ND-FISH分析。
表1所用材料
2、单链寡核苷酸(SSON)探针开发及标记
利用简单序列重复(SSR)及质粒克隆的串联重复序列开发SSON探针。SSR包括(A)35，(GA)15，(AT)15，(GC)15，(AC)15，(GCC)10，(ACG)10，(CAG)10，(ATT)10，(AGG)10，(CAC)10，(CAT)10，(ACT)5，(ACT)10，(ACT)19，(GAA)10以及(AAC)10(Cuadrado and Jouve 2010)。串联重复序列包括180bp Knob序列，第六染色体特异序列MR68，Knob关联成簇重复TR1-357，着丝粒重复CentC69以及Knob关联串联重复克隆K10-72(Peacock et al.1981；Chen et al.2000，Hsu et al.2003，NCBI数据库http://preview.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)(表2)。基于SSR及180bp Knob序列合成的SSON探针在其5’末端由TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)或FAM(6-羧基荧光素)直接修饰，其它基于质粒克隆开发的SSON探针由生物素或地高辛标记。
表2具有杂交信号的SSON探针
3、非变性荧光原位杂交
每个不经变性的染色体载玻片含有12μl的杂交液，由5.0μl 20×SSC缓冲液，2.5μl50％(w/v)硫酸葡聚糖以及5～3000ng SSON(根据每个SSON探针调节)，上覆20×20mm盖玻片。混合好的染液在37℃培养箱杂交2小时，然后在42℃2×SSC中洗5分钟，用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)套染后在奥林巴斯BX51荧光显微镜下进行观察，染色体无重叠，杂交信号清晰的图片用于后续分析。每个载玻片观察5-20个细胞，每个玉米材料至少检测4个重复。
4、非变性荧光原位杂交分析
非变性荧光原位杂交结果显示：基于SSR开发的SSON探针中，(ACT)10在B73的3个染色体(1、2和4)及Mo17的四个染色体(1、2、4和5)上获得了清晰的杂交信号。与(ACT)5开发的探针相比，(ACT)10的杂交信号更稳定、有效；基于180bp Knob重复序列开发的三个SSON探针在相同条件下产生相似的信号，但差异类型不同。Knob-2探针在B73第5、7、8和9染色体信号较强，在第1和6染色体信号较弱。Mo17中，Knob-2探针在第8染色体获得清晰信号，但在第3、4、6和9染色体上信号较弱；基于着丝粒重复序列CentC69(GenBank：AY530284.1)开发的SSON探针中，只有CentC69-1探针在B73及Mo17中能够检测到信号。在B73中，CentC69-1在第1、6、7和8染色体着丝粒区域信号较强，在第3、5、9和10染色体信号较弱，在第4和6染色体上未见杂交信号。在Mo17中，CentC69-1可在所有染色体的着丝粒区域产生杂交信号，其中，第1、3、7、8和9染色体上信号较强，其它染色体信号较弱；基于串联重复序列MR68，TR1-357及K10-72开发的三个SSON探针MR68-3，TR1-357-2及K10-72-1在Mo17第6染色体相同区域均可产生清晰的杂交信号。在B73中，三个探针只在第4和6染色体上产生信号。
5、多重SSON探针组开发
SSON探针CentC69-1，MR68-3，K10-72-1，TR1-357-2，Knob-2和(ACT)10用于开发多重SSON探针组。经过筛选，(ACT)10，Knob-2，CentC69-1及MR68-3组成的探针组可产生清晰的杂交信号，能够只通过一轮非变性荧光原位杂交即可区分16个玉米材料的所有染色体(图1)。其中，(ACT)10在第1、2和4染色体上产生强信号，足以区分所有玉米材料的这三个染色体。此外，(ACT)10在第2染色体(TZ201，ZZ8，WK702，WK06-9，XY335，DF30，SR16和SR568)和第3染色体的着丝粒(XY9)、第六染色体的近着丝粒区域(ZD958，TZ201，ZZ8，WK702，XY335，BY989，DF30，XY9和XY18)以及第9染色体短臂末端区域均能产生信号，部分信号与Knob-2重复(WK06-9和XY335)。MR68-3除了在所有材料第6染色体产生信号外，在第4染色体长臂末端区域也可产生信号(Mo17除外)。MR68-3还可在其它8个材料(Z58，ZD958，TZ201，ZZ8，WK702，BY989，XY9和XY18)中产生与Knob-2重叠的强信号。该多重SSON探针组在所有材料的第6染色体上表现出最强的信号多态性。在所有材料第6染色体短臂的卫星位点上，MR68-3和Knob-2可产生几乎完全重叠的清晰信号。在第6染色体的长臂末端区域上，MR68-3只在10个材料(Z58，ZD958，TZ201，ZZ8，WK702，BY989，XY9，XY18，SR16和SR568)中产生强信号。Knob-2在12个材料的长臂末端区域可产生或强或弱的信号，其中9个材料(Z58，ZD958，TZ201，ZZ8，WK702，XY9，XY18，SR16和SR568)的信号与MR68-3重叠。CentC69-1可在所有材料第6染色体着丝粒区域产生强度不同的杂交信号。
利用SSON探针通过一轮非变性荧光原位杂交过程即可实现玉米染色体核型分析，全部杂交时间只有2h。本研究中，5OD SSON探针(50-70美元)足以分析1000多个玻片，平均费用远低于常规荧光原位杂交。因此，该技术可用于大规模玉米染色体变异快速分析。
尽管已经详细描述了本发明的实施方式，但是应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的实施方式做出各种改变、替换和变更。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种寡核苷酸染液及其应用与用法
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccaatccac tactttaggt ccaaaactca tgtttggggt ggtttcgcgc aatttcgtt 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaggctaac acctacggat ttttgaccaa gaaatggtct ccaccagaaa tccaaaaat 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctctcgtgcg aatacaatgc cctcaatatc atagaaacac tattccttta gtgtgaata 59
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
actactacta ctactactac tactactact actact 36