一种荧光甲壳素水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及水凝胶领域，具体而言，涉及一种荧光甲壳素水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

甲壳素是地球上含量最丰富的天然高分子之一，由于甲壳素具有一定的生物功能，因而甲壳素在生物材料领域研究和应用已日益引人注目。水凝胶是由三维亲水性高分子网络构成，它的结构类似于大分子组成人体组织，因而在生物医学领域得到了广泛研究。

稀土元素因其电子结构的特殊性而具有光、电、磁等特性。早在六十年代初，人们就利用稀土离子特有的光、电、磁等性质开始将小分子稀土化合物以掺杂方式引入到聚合物中，并由此获得了一些具有特殊功能并具有实用性的高分子材料。之后，科学家们通过在高分子材料中掺杂稀土用以获得具有意想不到效果的光、电、磁等特殊性能的稀土/高分子复合材料。

目前，还没有关于荧光甲壳素水凝胶方面的报道，因而制备一种新型荧光甲壳素水凝胶具有重要的研究意义和价值。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种荧光甲壳素水凝胶，这种荧光甲壳素水凝胶在紫外光激发下能够发出荧光，该荧光相对稳定，且这种荧光甲壳素水凝胶无细胞毒性。

本发明的第二目的在于提供一种荧光甲壳素水凝胶的制备方法，该方法能够使用多种荧光物质，普适性好，所制得的荧光甲壳素水凝胶的荧光强度大、稳定性好。

本发明的第三目的在于提供一种荧光甲壳素水凝胶在生物成像或荧光免疫分析领域的应用。这种荧光甲壳素水凝胶具有很好的生物相容性，可以安全的作为生物体内的荧光成像试剂。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种荧光甲壳素水凝胶的制备方法，其包括：

将荧光物质、甲壳素与第一混合溶液混合，其中第一混合溶液为碱和第一尿素混合而成的水溶液，得到第二混合溶液；然后，将第二混合溶液进行冷冻处理，解冻后再将第二混合溶液与交联剂混合均匀，静置凝固。

一种荧光甲壳素水凝胶，采用上述荧光甲壳素水凝胶的制备方法制得。

一种荧光甲壳素水凝胶在生物成像或荧光免疫分析领域的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

这种制备荧光甲壳素水凝胶的方法，将荧光物质均匀的分布于甲壳素中，形成在紫外光激发下能够发出荧光的甲壳素水凝胶，且可通过调节与甲壳素混合的荧光物质的量，来调节荧光甲壳素水凝胶的荧光强度。通过这种方法所制得的荧光甲壳素水凝胶的溶胀率高、荧光相对稳定、荧光强度可调，且无细胞毒性，具有良好的生物相容性，可以安全的作为生物体内荧光成像试剂应用于生物成像或荧光免疫分析领域。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例5提供的荧光甲壳素水凝胶(b)与对比例1提供的甲壳素水凝胶(a)的对比图；

图2为实施例5提供的荧光甲壳素水凝胶的荧光光谱图；

图3为实施例6提供的荧光甲壳素水凝胶的荧光光谱图；

图4为实施例7提供的荧光甲壳素水凝胶的荧光光谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供一种荧光甲壳素水凝胶的制备方法，其包括：

将荧光物质、甲壳素与第一混合溶液混合，其中第一混合溶液为碱和第一尿素混合而成的水溶液，得到第二混合溶液；然后，将第二混合溶液进行冷冻处理，解冻后再将第二混合溶液与交联剂混合均匀，静置凝固。

这种制备荧光甲壳素水凝胶的方法，将荧光物质均匀的分布于甲壳素中，形成在紫外光激发下能够发出荧光的甲壳素水凝胶，且可通过调节与甲壳素混合的荧光物质的量，来调节荧光甲壳素水凝胶的荧光强度。通过这种方法所制得的荧光甲壳素水凝胶的溶胀率高、荧光相对稳定、荧光强度可调，且无细胞毒性，具有良好的生物相容性。

进一步的，第一混合溶液中的第一尿素的含量为2～6wt％；第一混合溶液中的碱为NaOH或者KOH，优选为NaOH，第一混合溶液中碱的含量为8～12wt％。第一混合溶液中的碱和第一尿素，有利于促进甲壳素在低温下的充分溶解，从而提高荧光甲壳素水凝胶的光学透过率和荧光稳定性。

在第二混合溶液的制备过程中，物料的添加顺序优选为：将荧光物质分散于含有碱和第一尿素的第一混合溶液中，随后将其与甲壳素混合，得到第二混合溶液。由于甲壳素在常温下不溶于第一混合溶液中，所以先将荧光物质分散于第一混合溶液中，再加入甲壳素，有利于提高荧光物质的分散性，使其均匀的分布于所制备的甲壳素凝胶中。

对第二混合溶液进行冷冻处理，有利于使甲壳素完全溶解，以进一步使荧光粉与甲壳素混合均匀。进一步的，冷冻处理包括将第二混合溶液于-28～-38℃下冷冻8～48h，更为优选的，冷冻处理为将第二混合溶液于零下34℃下冷冻24h。第二混合溶液所在环境的温度为-28～-38℃，甲壳素能够完全溶解，与荧光物质的混合更加均匀，且混合效率高。

解冻后在第二混合溶液中加入交联剂，有利于使结合有荧光物质的甲壳素分子之间相互交联，形成三维网状结构。优选的，交联剂为环氧氯丙烷，其用量为2～6mL/100g，即每100g的第二混合溶液中添加交联剂的用量为2～6mL，优选为4mL。

在本发明较佳的实施例中，荧光物质包括稀土荧光粉、荧光素、罗丹明和量子点中的任意一种。稀土荧光粉、荧光素、罗丹明和量子点这四类物质可均匀的分散于第一混合溶液中，并与甲壳素结合形成发光效率高的甲壳素水凝胶。

荧光素，又称荧光黄，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。已在多种应用(如荧光抗体技术)中被广泛用作为荧光示踪物。罗丹明，是一种可以通过细胞膜的选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，呈黄绿色荧光，具有极好的生物相容性。量子点，可以为碳量子点，也可以为其它元素的量子点，如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe等。量子点由于其尺寸小，为纳米级的，使其具有很好的荧光特性。稀土荧光粉，为含有稀土元素的荧光粉。

在本发明较为优选的实施例中，荧光物质为稀土荧光粉，稀土荧光粉为至少含有两种稀土元素相互掺杂的氧化物、碳酸氢氧化物或者碳酸盐，两种稀土元素中的一种为铕、铈或铽。

采用含有至少两种稀土元素的荧光粉，能够避免在所制得的荧光甲壳素水凝胶中发生荧光猝灭现象，使得所制得的荧光甲壳素水凝胶的荧光相对稳定。而采用两种稀土元素相互掺杂的方式得到稀土荧光粉，荧光的稳定性增强。铕、铈或铽这三种稀土元素是稀土荧光三基色中的基础元素，利用这三种稀土元素与其他稀土元素(如钇或者镧)相互掺杂，能够得到红、绿、蓝三基色的稀土荧光粉，可进一步的制备荧光甲壳素水凝胶。

进一步优选的，稀土荧光粉为至少含有两种稀土元素相互掺杂的碳酸氢氧化物，稀土荧光粉的制备方法为：将硝酸钆与稀土元素的硝酸盐、以及第二尿素混合均匀后得到第三混合溶液，将第三混合溶液于80～90℃的水浴中加热1～5h，随后进行离心、洗涤并干燥，得到稀土荧光粉。

利用水热法，将稀土元素钆作为主体元素与铕、铈或铽的硝酸盐进行掺杂。当第三混合溶液于80～90℃进行加热时，第二尿素会分解成CO₂和氨水，与稀土元素的硝酸盐反应生成稀土元素的碳酸氢氧化物，即为稀土荧光粉。

进一步的，第三混合溶液中硝酸钆与稀土元素的硝酸盐的摩尔比为70～99：1～30，优选为85：15。采用这种比例所得到的稀土荧光粉中，钆与另一种稀土元素的摩尔比为70～99：1～30，稀土荧光粉发光效率高、荧光稳定性强。

进一步的，稀土元素的硝酸盐为硝酸铕、或者稀土元素的硝酸盐为硝酸铽和硝酸铈铵、或者稀土元素的硝酸盐为硝酸铥和硝酸铈铵。

当稀土元素的硝酸盐为硝酸铕时，将硝酸钆与硝酸铕采用上述方法进行掺杂，得到红色荧光粉，其分子式为Gd_xEu_1-x(OH)CO₃，其中x为0.7～0.99。当稀土元素的硝酸盐为硝酸铽和硝酸铈铵，将硝酸钆与硝酸铽和硝酸铈铵采用上述方法进行掺杂，得到绿色荧光粉，其分子式为Gd_xTb_yCe_1-x-y(OH)CO₃，其中，x为0.7～0.99，y为0.01～0.2，x+y＜1。当稀土元素的硝酸盐为硝酸铥和硝酸铈铵，将硝酸钆与硝酸铥和硝酸铈铵采用上述方法进行掺杂，得到蓝色荧光粉，其分子式为Gd_xTm_yCe_1-x-y(OH)CO₃，其中，x为0.7～0.99，y为0.01～0.2，x+y＜1。

在形成蓝色荧光粉和绿色荧光粉时，之所以还加入第三种稀土元素铈，主要是由于稀土元素钆与铽或者铥的能级差异较大，如果直接掺杂的话存在有较大的难度，不能形成性能稳定的稀土荧光粉。

一种荧光甲壳素水凝胶，这种荧光甲壳素水凝胶由上述方法所制得。通过上述方法制备的这种荧光甲壳素水凝胶在紫外光激发下能够发出荧光，这种荧光水凝胶的溶胀率高、荧光相对稳定、荧光强度可调，且无细胞毒性。

一种荧光甲壳素水凝胶在生物成像或荧光免疫分析领域的应用。这种荧光甲壳素水凝胶有良好的生物相容性，可以安全的作为生物体内荧光成像试剂，广泛的应用于生物成像或荧光免疫分析领域。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种荧光甲壳素水凝胶，该荧光甲壳素水凝胶的制备方法为：

将0.1g的荧光素分散于100g第一混合溶液中，第一混合溶液中含有12wt％的NaOH和2wt％的尿素；将第一混合溶液于1200rpm转速下机械搅拌0.1h后超声处理15分钟，随后加入甲壳素，得到第二混合溶液，第二混合溶液中甲壳素的百分质量浓度为2wt％；然后将得到的第二混合溶液再次在1200rpm下机械搅拌30min和超声处理15min后；再将第二混合溶液进行于-38℃下冷冻8h，在室温下解冻，离心脱泡后再将所得到的第二混合溶液与环氧氯丙烷混合均匀，其中加入环氧氯丙烷的量为2mL/100g溶液，静置凝固后即得荧光甲壳素水凝胶。

实施例2

本实施例提供一种荧光甲壳素水凝胶，该荧光甲壳素水凝胶的制备方法为：

将0.01g的碳量子点分散于100g第一混合溶液中，第一混合溶液中含有8wt％的NaOH和6wt％的尿素；将第一混合溶液于1200rpm转速下机械搅拌1h后超声处理15分钟，随后加入甲壳素，得到第二混合溶液，第二混合溶液中甲壳素的百分质量浓度为8wt％；然后将得到的第二混合溶液再次在1200rpm下机械搅拌30min和超声处理15min后；再将第二混合溶液进行于-28℃下冷冻48h，在室温下解冻，离心脱泡后再将所得到的第二混合溶液与环氧氯丙烷混合均匀，其中加入环氧氯丙烷的量为6mL/100g溶液，静置凝固后即得荧光甲壳素水凝胶。

实施例3

本实施例提供一种荧光甲壳素水凝胶，该荧光甲壳素水凝胶的制备方法为：

将0.05g的罗丹明分散于100g第一混合溶液中，第一混合溶液中含有11wt％的NaOH和4wt％的尿素；将第一混合溶液于1200rpm转速下机械搅拌30min后超声处理15分钟，随后加入甲壳素，得到第二混合溶液，第二混合溶液中甲壳素的百分质量浓度为4wt％；然后将得到的第二混合溶液再次在1200rpm下机械搅拌30min和超声处理15min后；再将第二混合溶液进行于零下33℃下冷冻24h，在室温下解冻，离心脱泡后再将所得到的第二混合溶液与环氧氯丙烷混合均匀，其中加入环氧氯丙烷的量为4mL/100g溶液，静置凝固后即得荧光甲壳素水凝胶。

实施例4

本实施例提供一种荧光甲壳素水凝胶，该荧光甲壳素水凝胶的制备方法为：

将0.1g的铕激活的氧化钇(Y₂O₃:Eu)分散于100g的第一混合溶液中，第一混合溶液中含有11wt％的NaOH和4wt％的尿素；将第一混合溶液于1200rpm转速下机械搅拌30min后超声处理15分钟，随后加入甲壳素，得到第二混合溶液，第二混合溶液中甲壳素的百分质量浓度为4wt％；然后将得到的第二混合溶液再次在1200rpm下机械搅拌30min和超声处理15min后；再将第二混合溶液进行于零下33℃下冷冻24h，在室温下解冻，离心脱泡后再将所得到的第二混合溶液与环氧氯丙烷混合均匀，其中加入环氧氯丙烷的量为4mL/100g溶液，静置凝固后即得红色的荧光甲壳素水凝胶。

实施例5

本实施例提供一种荧光甲壳素水凝胶，该荧光甲壳素水凝胶的制备方法为：

将0.3373g的硝酸钆六水合物、0.0175g的硝酸铕六水合物、2g的尿素及50g的蒸馏水混合并搅拌均匀，得到第三混合溶液。然后将第三混合溶液在85℃恒温水浴加热3h，加热结束后室温冷却。冷却后将第三混合溶液置于离心机中进行离心，留下底部沉淀，再加入适量的蒸馏水和无水乙醇进行超声处理后再离心，重复上述过程4次。最后将离心后的上层清液倒去，底部沉淀物即为红色的稀土荧光粉。

将0.1g红色的稀土荧光粉分散于100g的第一混合溶液中，第一混合溶液中含有11wt％的NaOH和4wt％的尿素；将第一混合溶液于1200rpm转速下机械搅拌30min后超声处理15分钟，随后加入甲壳素，得到第二混合溶液，第二混合溶液中甲壳素的百分质量浓度为4wt％；然后将得到的第二混合溶液再次在1200rpm下机械搅拌30min和超声处理15min后；再将第二混合溶液进行于零下33℃下冷冻24h，在室温下解冻，离心脱泡后再将所得到的第二混合溶液与环氧氯丙烷混合均匀，其中加入环氧氯丙烷的量为4mL/100g溶液，静置凝固后即得荧光甲壳素水凝胶。

该荧光甲壳素水凝胶，在紫外光下发出较强的红光，如图1(b)所示。其溶胀率为73.7g/g，其荧光光谱如图2所示，由图2可知，该荧光甲壳素水凝胶的最大发射波长为610nm。

实施例6

本实施例提供一种荧光甲壳素水凝胶，该荧光甲壳素水凝胶的制备方法为：

将0.180g的硝酸铥六水合物、0.106g的硝酸铈铵、1.491g的硝酸钆六水合物、10g的尿素及250g的蒸馏水混合并搅拌均匀，得到第三混合溶液。然后将第三混合溶液在80℃恒温水浴加热5h，加热结束后室温冷却。冷却后将第三混合溶液置于离心机中进行离心，留下底部沉淀，再加入适量的蒸馏水和无水乙醇进行超声处理后再离心，重复上述过程3次。最后将离心后的上层清液倒去，底部沉淀物即为蓝色的稀土荧光粉。

将0.2g蓝色的稀土荧光粉分散于100g的第一混合溶液中，第一混合溶液中含有11wt％的NaOH和4wt％的尿素；将第一混合溶液于1200rpm转速下机械搅拌30min后超声处理15分钟，随后加入甲壳素，得到第二混合溶液，第二混合溶液中甲壳素的百分质量浓度为4wt％；然后将得到的第二混合溶液再次在1200rpm下机械搅拌30min和超声处理15min后；再将第二混合溶液进行于零下33℃下冷冻24h，在室温下解冻，离心脱泡后再将所得到的第二混合溶液与环氧氯丙烷混合均匀，其中加入环氧氯丙烷的量为4mL/100g溶液，静置凝固后即得荧光甲壳素水凝胶。

该荧光甲壳素水凝胶在紫外光下发出较强的蓝光，其溶胀率为58.6g/g，其荧光光谱如图3所示，由图3可知，该荧光甲壳素水凝胶的最大发射波长为415～417nm。

实施例7

本实施例提供一种荧光甲壳素水凝胶，该荧光甲壳素水凝胶的制备方法为：

将0.178g的硝酸铽六水合物、0.108g的硝酸铈铵、1.5088g的硝酸钆六水合物、10g的尿素及250g的蒸馏水混合并搅拌均匀，得到第三混合溶液。然后将第三混合溶液在90℃恒温水浴加热1h，加热结束后室温冷却。冷却后将第三混合溶液置于离心机中进行离心，留下底部沉淀，再加入适量的蒸馏水和无水乙醇进行超声处理后再离心，重复上述过程5次。最后将离心后的上层清液倒去，底部沉淀物即为绿色的稀土荧光粉。

将0.2g绿色的稀土荧光粉分散于100g的第一混合溶液中，第一混合溶液中含有11wt％的NaOH和4wt％的尿素；将第一混合溶液于1200rpm转速下机械搅拌30min后超声处理15分钟，随后加入甲壳素，得到第二混合溶液，第二混合溶液中甲壳素的百分质量浓度为4wt％；然后将得到的第二混合溶液再次在1200rpm下机械搅拌30min和超声处理15min后；再将第二混合溶液进行于零下33℃下冷冻12h，在室温下解冻，离心脱泡后再将所得到的第二混合溶液与环氧氯丙烷混合均匀，其中加入环氧氯丙烷的量为4mL/100g溶液，静置凝固后即得荧光甲壳素水凝胶。

该荧光甲壳素水凝胶在紫外光下发出较强的绿光，其溶胀率为56.7g/g，其荧光光谱如图4所示，由图4可知，该荧光甲壳素水凝胶的最大发射波长为505～510nm。

对比例1

本对比例提供一种没有荧光的甲壳素水凝胶，该甲壳素水凝胶的制备方法为：

将4g的甲壳素加入到含有11wt％的NaOH和4wt％的尿素的第一混合溶液中，得到第二混合溶液，第二混合溶液中甲壳素的百分质量浓度为4wt％；然后将得到的第二混合溶液在1200rpm下机械搅拌30min和超声处理15min后；再将第二混合溶液进行于零下33℃下冷冻12h，在室温下解冻，离心脱泡后再将所得到的第二混合溶液与环氧氯丙烷混合均匀，其中加入环氧氯丙烷的量为4mL/100g溶液，静置凝固后即得甲壳素水凝胶。

该甲壳素水凝胶在紫外光下不发光，如图1(a)所示，其溶胀率为100.2g/g。

实验例

下面结合细胞实验对本发明实施例提供的荧光甲壳素水凝胶在细胞毒性方面的效果进行评价。

将实施例1-7所制备的荧光甲壳素水凝胶以及对比例1所制备的甲壳素水凝胶进行细胞毒性试验。其中实验组有三组，分别施用实施例1-7所制备的荧光甲壳素水凝胶；对照组有1组，施用比例1所制备的甲壳素水凝胶。

具体实验方法为：

将实施例1-7制备的荧光甲壳素水凝胶打粉后使用高压灭菌制备试样提取物；同时把对比例1提供的甲壳素水凝胶打碎成粉末后作为对照提取物。根据ISO10993-5标准，按照200L/孔的量把L929细胞悬浮液加入到96孔板中，并保证每个孔中细胞密度为1×10⁴cells/孔，然后将96孔板置于37℃、5％CO₂的环境下培养24h。随后，更换新鲜培养液并加入灭菌后试样提取物(50L/孔)，同时，在对照组加入对照提取物(50L/孔)。细胞分别培养24h、48h和72h后，在每孔加入20L的MTT溶液(浓度为5mg/mL，溶剂为磷酸盐缓冲溶液)，使最终的MTT浓度达到0.5mg/mL，然后将96孔板置于培养箱中在同样条件下放置4h。移去MTT后以150L/孔数量加入二甲基亚砜，用于溶解细胞中的甲瓒。随后，在490nm波长下测定每个孔的吸光度值A，并按照下面公式进行计算细胞成活率，结果如表1所示：

细胞成活率(％)＝A_test/A_control×100％

式中，A_test和A_control分别代表测试组和对照组的吸光度值。

表1.细胞毒性试验结果

由表1可知，与对比例1相比，本发明实施例1-7中所提供的荧光甲壳素水凝胶的细胞生活率均在90％以上，说明本发明实施例1-7中所提供的荧光甲壳素水凝胶具有良好的生物相容性，几乎无细胞毒性，可以安全的作为生物体内荧光成像试剂应用于生物成像或荧光免疫分析领域。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。