本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于高通量测序检测人循环肿瘤DNAKRAS基因变异的质控方法及试剂盒。
背景技术：
：在血液中存在着游离的小片段DNA(cell-freeDNA，cfDNA)，它们来自死亡的细胞。通常死亡的细胞会被清除掉，因此cfDNA的含量是非常低的，通常一个健康人的1mL血浆中含25ngcfDNA。而癌症患者的cfDNA的含量高出正常几倍，其中一部分是ctDNA(circulatingtumorDNA)。ctDNA的相对含量与肿瘤的负荷和对治疗的反应是相关的，可用于鉴定驱动基因、指导临床治疗、监测临床治疗效果及癌症复发、揭示治疗抗性以及检测疾病进展。在有些方面ctDNA方法的灵敏度甚至高传统的手段。例如，与传统的影像学检测相比，追踪早期乳腺癌患者术后血液中的肿瘤DNA，可以提前7.9个月发现乳腺癌复发。在肺癌、肠癌中检测cfDNA的KRAS突变对肺癌也有着重要的诊断价值。ctDNA在癌症早期就可以被检测到。因为cfDNA容易收集，在肺癌中已显示与组织中的变异高度一致，因此ctDNA的液体活检越来越受到关注。血液中ctDNA含量在癌症早期占cfDNA的比例是非常低，通常小于0.1％。ctDNA检测方法很多，如用数字化PCR(DigitalPCR)，或下一代测序(NextGenerationSequencing,NGS)等。通过NGS优化ctDNA的深度测序(CAPP-seq)使突变检测的敏感度达到0.02％，特异性为100％。此方法结合降低背景噪声的iDES(integratedDigitalErrorSuppression)分析方法后，使检测频率的阈值进一步下降到0.004％。从而大大提高了分析ctDNA的检出率。KRAS突变在肺癌和结直肠癌中均很常见，其与肿瘤细胞的生存、增殖、迁移、扩散和血管生成均有密切关系。同时KRAS突变是所有肿瘤中突变频率最高的基因，因此成为研究的焦点。KRAS基因是EGFR的下游因子，若KRAS基因发生突变，则患者不能从酪氨酸激酶抑制剂中获益，且对EGFR一TKIS耐药。因此KRAS的突变检测成为靶向治疗的关键。通过对人循环肿瘤DNAKRAS基因的检测可筛检出肺癌、肠癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗。高通量测序技术(Highthroughputsequencing)又称二代测序技术(NextGenerationSequencing,NGS)，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，然后将测序结果与参考序列进行比对，找到DNA分子上存在的突变信息。高通量测序技术是一种高效、精准的基因突变检测方法。目前国内尚无针对人循环肿瘤DNAKRAS基因测序检测的质控品和试剂盒。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于高通量测序检测人KRAS基因变异的质控方法及试剂盒。根据本发明的一个方面，提供人KRAS基因变异检测质控品的制备方法，包括以下步骤：(1)选择KRAS基因变异阳性的、可稳定传代的人肿瘤细胞系，提取基因组并通过Sanger测序法测定每个细胞系中KRAS基因上的潜在变异位点，经Sanger测序法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点；(2)培养所选择的人肿瘤细胞系，将来自各个细胞系的基因组DNA片段化并按照一定比例混合，获得质控品。在一些实施方案中，“将来自各个细胞系的基因组DNA片段化并按照一定比例混合”可以是先提取各个细胞系的基因组DNA，分别片段化，然后将片段化的各个细胞系基因组DNA按照一定比例混合。在一些实施方案中，“将来自各个细胞系的基因组DNA片段化并按照一定比例混合”可以是先提取各个细胞系的基因组DNA，将各个细胞系的基因组DNA按照一定比例混合，然后片段化。在一些实施方案中，“将来自各个细胞系的基因组DNA片段化并按照一定比例混合”可以是先将各个细胞系的基因组DNA片段化，再提取各个细胞系的片段化基因组DNA，然后将各个细胞系的片段化基因组DNA按照一定比例混合。在一些实施方案中，在按照一定比例混合之前，先将各个细胞系的片段化的或未片段化的基因组DNA稀释到相同浓度。在一些实施方案中，所述片段化是通过酶切片段化或通过超声处理片段化。在优选的实施方案中，通过MNase(微球菌核酸酶)酶切使DNA片段化。本发明的质控品中每一潜在变异位点上的变异频率值可以按照混合比例以及经Sanger测序法测定的变异频率确定，计算公式如下：其中混合比例i是指所选择的第i个细胞系的基因组DNA在质控品中的混合比例，变异频率i是指所选择的第i个细胞系的基因组DNA在该位点上的变异频率。在优选的实施方案中，所选择的可稳定传代的人肿瘤细胞系是HOP-62、HCT-15、AGS、NCI-H1573、COR-L23、NCI-H1355及SW1417细胞系。在进一步优选的实施方案中，由HOP-62、HCT-15、AGS、NCI-H1573、COR-L23、NCI-H1355及SW1417细胞系获得的片段化的或未片段化的基因组DNA按照1:1:1:1:1:1的比例(质量比)均匀混合。应当理解，根据本发明，所使用的细胞系包括但不限于A549、NCI-H720、NCI-H1650、NCI-H1975、SW48及SW1417细胞系，可以使用其它人肿瘤细胞系。由A549、NCI-H720、NCI-H1650、NCI-H1975、SW48及SW1417细胞系获得的片段化的或未片段化的基因组DNA也可以按照其它比例进行均匀混合。本发明可以通过选取不同的细胞系，配置不同的片段化的或未片段化的基因组DNA的比例，以及验证不同的变异位点来制备人KRAS基因变异检测质控品。选取不同的细胞系、配制不同的片段化的或未片段化的基因组DNA的比例时，所获得的质控品的变异位点和/或位点变异频率可能会有所不同，但不会妨碍其作为质控品的应用。在一些实施方案中，步骤(2)是：培养所选择的人肿瘤细胞系，使各个细胞系的基因组DNA片段化，然后提取纯化各个细胞系的片段化基因组DNA，再将各个细胞系的片段化基因组DNA按照一定比例混合，获得质控品。在一些实施方案中，所述人肿瘤细胞系的培养条件是包括37℃恒温，5％CO2，湿度50％培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代。在一些实施方案中，使各个细胞系的基因组DNA片段化包括通过酶切使各个细胞系的基因组DNA片段化。在优选的实施方案中，所述酶是MNase(微球菌核酸酶)。在一些实施方案中，使各个细胞系的基因组DNA片段化包括在细胞生长对数期收集细胞，弃上清，用预冷PBS溶液重悬，吸弃上清，然后用0.1％TritonX-100重悬沉淀，冰上孵育后离心，吸弃上清，然后加入BSA和MNase，孵育后加入EDTA中止酶反应。在一些实施方案中，使各个细胞系的基因组DNA片段化包括在细胞生长对数期收集，1500g的速度4℃离心5min取沉淀弃上清，然后使用预冷PBS溶液重悬，5000rpm速度4℃离心5min，吸弃上清；然后用0.1％TritonX-100重悬沉淀，冰上孵育10min，5000rpm速度4℃离心10min；然后吸弃上清，加入1XMNaseBuffer，重悬沉淀；然后吸弃上清，加入1×MNaseBuffer，重悬沉淀；然后加入1×BSA及MNase，37℃孵育5min，加入EDTA中止酶反应。在一些实施方案中，片段化的或未片段化的各个细胞系的基因组DNA在混合前分别被稀释至15±1ng/μL。在一些实施方案中，用TE溶液稀释片段化的或未片段化的各个细胞系的基因组DNA。根据本发明的另一个方面，提供通过上述方法获得的人KRAS基因变异检测质控品。根据本发明的另一个方面，提供人KRAS基因变异检测试剂盒，其中包含本发明的人KRAS基因变异检测质控品。本发明的人KRAS基因变异检测试剂盒还可以包含用于人KRAS基因变异的高通量测序检测的任何其它组分。在优选的实施方案中，所述人KRAS基因变异检测试剂盒进一步包含选自末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、捕获探针、核酸纯化磁珠、链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。本发明的人KRAS基因变异检测试剂盒任选地还可以包含阴性质控品。在特别优选的实施方案中，所述人KRAS基因变异检测试剂盒包含上述全部试剂。根据本发明的又一方面，提供上述人KRAS基因变异检测质控品或人KRAS基因变异检测试剂盒在人KRAS基因变异的高通量测序检测的质量控制中的应用，特别是在人循环肿瘤DNAKRAS基因变异的高通量测序检测的质量控制中的应用。本发明中，检测人KRAS基因变异可以包括检测人基因组KRAS基因变异，还可以包括检测人循环肿瘤DNAKRAS基因变异。本发明所述的“高通量测序”也被称为二代测序，其主要特点是能够同时对输入的序列进行大规模平行测序，获得大量短序列的测序结果。高通量测序的基本原理是将待测DNA随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列、PCR等步骤进行文库构建，最后使用Illumina，IonTorrent等测序仪进行测序。本发明的人KRAS质控品可以作为阳性质控品。本发明的人KRAS质控品包含不同的变异频率的变异位点，有利于控制分析准确性。本发明提供的人KRAS基因变异检测质控品和试剂盒能够有效对人KRAS基因变异(特别是人循环肿瘤DNAKRAS基因变异)的高通量测序检测体系的可靠性进行评估，提高了效率并降低检测质控成本。附图说明图1是质控品的电泳检测图。具体实施方式下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。实施例1：人循环肿瘤DNAKRAS基因变异检测质控品的制备1.1.从ATCC购买获得七株常用的可稳定传代人肿瘤细胞系HOP-62、HCT-15、AGS、NCI-H1573、COR-L23、NCI-H1355及SW1417。用Sanger法对每个细胞系的基因组DNA进行测序，经Sanger法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点。经验证共含有6个阳性变异位点。1.2.采用专用培养基培养这七株人肿瘤细胞系，培养条件：37℃恒温，5％CO2，湿度50％。培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代，在细胞生长对数期收集，1500g的速度4℃离心5min取沉淀弃上清。1.3.使用预冷PBS溶液重悬，5000rpm速度4℃离心5min，吸弃上清。重复本步骤一次。1.4.吸弃上清，使用0.1％TritonX-100重悬沉淀，冰上孵育10min，5000rpm速度4℃离心10min。吸弃上清，加入1XMNaseBuffer，重悬沉淀。1.5.吸弃上清，加入1×MNaseBuffer，重悬沉淀。加入1×BSA及MNase，37℃孵育5min。加入EDTA中止酶反应。2000g离心1min后取上清使用LifeTechMagMax试剂盒提取，最终将提取的七株人肿瘤细胞系核酸用TE溶液稀释至15±1ng/μL，并等比例混合，-20℃保存。取少量等比例混合物使用GXTouch和配套的DNAHighSensitivityReagentKit(二者均购自PerkinElmer,Inc.)进行电泳检测，按说明书进行操作。检测结果如图1所示。电泳结果表明：质控品片段化后大小集中于143bp，与人体中cfDNA大小接近，达到质控品制备要求。其中MNase是微球菌核酸酶，1XMNaseBuffer和MNase购自NEB。BSA是牛血清清蛋白，购自NEB。实施例2：人循环肿瘤DNAKRAS基因变异检测试剂盒的制备2.1.设计并合成针对人循环肿瘤DNAKRAS基因上不同目标区域的多个捕获探针，所有捕获探针的集合能够覆盖人KRAS基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域；捕获探针上具有生物素标记；所述捕获探针的序列如序列表中SEQIDNO:1-37所示。2.2.将序列表中SEQIDNO:1-37所示的全部捕获探针按相同比例混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。2.3.将捕获探针混合物和实施例1中获得的质控品分别分装。2.4.准备说明书、外包装，组装封口。2.5.其中捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应；质控品的用量为5μL/3反应，10μL/6反应，20μL/12反应，40μL/24反应。实施例3：人循环肿瘤DNAKRAS基因变异的测序检测本实施例中测序所使用的仪器为基因序列自动分析仪NextSeqCN500，在Illumina平台上进行高通量测序。质控品的制备方法同实施例1。3.1.从10例阳性血浆样本中提取人cfDNA，质控品直接使用，无需提取。3.2.文库构建3.2.1.末端修复0.2mlPCR反应管，加入30ng提取后的cfDNA样本或质控品，用LowEDTATE补齐至50μL，震荡混匀，短暂离心。分别加入1μL末端修复酶混合物和6μL末端修复反应缓冲液，震荡混匀短暂离心后在37℃保温5min，随后在65℃保温30min，37℃保温5min，进行末端修复。反应结束后取出PCR反应管，将产物分别转移至新的1.5mL离心管中；在每个离心管中加入108μL核酸纯化磁珠，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上，室温静置2min后，小心吸弃上清。加入200μL80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。在每个离心管中分别加入30μLLowEDTATE、18μL缓冲液、1μL修复酶G3、1μL修复酶G4，充分混匀后，于20℃孵育20min。取出离心管，分别加入50μLPEGNaCl，吹打混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上，室温静置2min后，小心吸弃上清。加入200μL80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清。重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。3.2.2.接头连接向干燥后的离心管中分别单独加入5μL接头，用于不同cfDNA样本文库或质控品的接头上具有不同标签以区分它们；分别加入20μLLowEDTATE、3μL接头缓冲液、2μL连接酶，充分混匀并重悬磁珠后，25℃恒温孵育15min。加入49.5μLPEGNaCl，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min，小心吸弃上清。加入200μL80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。分别加入30μLLowEDTATE、16μL缓冲液、3μL连接酶，充分混匀并重悬磁珠后，40℃恒温孵育10min。加入82.5μLPEGNaCl，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min，小心吸弃上清。加入200μL80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留，室温干燥5min(不可使磁珠过度干燥)。加入20μLLowEDTATE，室温孵育3min。将离心管转移至磁力架上，静置2min，小心吸取上清分别至新的1.5mL离心管中。3.2.3文库扩增与纯化分别加入25μLPCR扩增酶混合物、5μL引物混合物进行PCR扩增。向反应完成的离心管中，加入1.65倍的PEGNaCl溶液，并吹打混合均匀，室温孵育。孵育完成后，将离心管置于磁力架上静置2-3min，待溶液澄清后，吸弃溶液，期间切忌接触磁珠。在离心管中加入新鲜的80％乙醇200μL，静置30s后，吸弃乙醇，切勿接触磁珠，重复操作一次。吸弃乙醇后，将磁珠晾干至表明呈磨砂状，切勿使磁珠过干，出现许多裂缝，磁珠晾干后，加入LowEDTATEbuffer20μL，并室温孵育。孵育完成后，置于磁力架上，静置2-3min，待溶液澄清后，吸取溶液，分别转移至新的1.5mLLoBind离心管中。3.3.文库捕获3.3.1.杂交将1-6个个文库混合在一个样品池中进行杂交捕获，将文库按量混合于1.5mLLoBind离心管中成为一个样品池，样本用量不低于125ng，样品池总量不超过1μg。向样品池中加入2μL接头封闭剂和5μLDNA封闭剂，震荡混匀，短暂离心后冷冻真空抽干。加入8.5μL杂交缓冲液(2×)、2.7μL杂交增强剂和3.8μLPCR-gradewater，震荡混匀，短暂离心后，室温静置5min重溶。将重溶后的液体全部转移至新的0.2mLPCR反应管中，95℃保温10min。取出PCR反应管，短暂离心后加入2μL实施例2获得的捕获探针混合物，震荡混匀3-5s，短暂离心后在68℃保温4h以上，热盖温度为78℃。3.3.2.富集取链霉亲合素磁珠洗涤后加入1倍体积磁珠洗液，振荡重悬后按每管100μL分装到不同的0.2mLPCR反应管中。将步骤3.3.1中的PCR反应管取出，短暂离心后将全部杂交产物转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR反应管中，充分悬浮后于PCR仪上65℃孵育45min，期间每隔12min吸打混匀一次。孵育结束后，每管加入100μL65℃预热的1×洗液Ⅰ，将全部悬液转移至1.5mLLoBind离心管中，震荡混匀，短暂离心后转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。加入200μL65℃预热的1×杂交洗液，震荡混匀，短暂离心后65℃孵育5min，转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。重复本步骤一次。再用磁珠洗液充分洗脱后加入18μLNuclease-freewater，震荡重悬后全部转移至0.2mLPCR反应管中备用。3.3.3.捕获文库扩增与纯化向上述PCR反应管中分别加入25μL2×PCR预混液和捕获文库PCR引物各2.5μL，充分混匀短暂离心后按下述程序进行PCR扩增：95℃3min；10个循环，每个循环为98℃20s，60℃30s，72℃30s；72℃1min；4℃保存备用。将PCR反应管短暂离心后，将产物全部转移至1.5mL离心管中。加入75μL核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置10min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。加入200μL80％乙醇，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖晾干至无液滴残留。加入21.6μLNuclease-freewater震荡重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取20μL上清至新的1.5mLLoBind离心管中备用。取2μL捕获文库或捕获的质控品DNA进行定量(使用Qubit荧光定量仪)。3.4.测序及数据分析3.4.1.测序按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序。平均有效覆盖深度≥5000×。3.4.2.数据分析获得原始测序数据后，与参比数据库比对，进行变异分析和解读。检测结果如下：临床样本的突变位点及检测结果如表1所示。临床样本检测符合率：10/10＝100％。所有临床样本经数字PCR法验证无误。表1临床样本突变位点及检测结果样本编号基因名称转录本外显子或内含子cDNA变异信息蛋白质变异信息检测结果1KRASNM_00498518c.35G>Ap.G12D3.83％，阳性2KRASNM_00498519c.35G>Cp.G12A1.96％，阳性3KRASNM_00498519c.35G>Tp.G12V5.7‰，阳性4KRASNM_00498519c.34G>Ap.G12S2.9‰，阳性5KRASNM_00498519c.34G>Cp.G12R2.01％，阳性6KRASNM_00498519c.34G>Tp.G12C1.27％，阳性7KRASNM_00498519c.38G>Ap.G13D6.1‰，阳性8KRASNM_00498519c.183A>Tp.Q61H4.68％，阳性9KRASNM_00498519c.182A>Cp.Q61A2.3‰，阳性10KRASNM_00498519c.182A>Tp.Q61L7.29％，阳性质控品的变异位点检测结果如表2所示，其中参考突变频率为根据混合比例以及经数字PCR法测定的变异频率计算获得的理论检测值为高通量测序实验检测结果。表2质控品变异位点及检测结果由表2的结果可见，质控品中变异位点检测符合率为100％。实施例4：可重复性实验按照实施例1的制备方法制备质控品K-P2。使用质控品K-P2按照实施例2的制备方法生产三批试剂盒，批号分别为20160314，20160315，20160316。按照实施例3的检测方法进行高通量测序检测。同一批次试剂盒20160316，检测K-P2三次，检测结果见表3。不同批次试剂盒20160314，20160315，20160316，检测K-P2各三次，检测结果见表4。表3批内差异批号样本名称阳性变异符合率20160316K-P2100％(6/6)20160316K-P2100％(6/6)20160316K-P2100％(6/6)表4批间差异批号样本名称阳性变异符合率20160314K-P2100％(6/6)20160315K-P2100％(6/6)20160316K-P2100％(6/6)检测结果：试剂盒可重复性满足要求。实施例5：探针对比测试的性能分析指标分别使用常规捕获探针和实施例2的捕获探针，按照与实施例3相同的实验步骤进行操作。其中常规捕获探针为18条探针的混合物，其中所包含的18条探针首尾相接覆盖KRAS的全部目标区域，每条探针长度随机，Tm值无限制，所有探针均具有生物素标记。经过测序和数据分析，两种探针的性能指标比较如表5和表6所示。表5常规捕获探针性能指标验证分析表6实施例2探针性能指标验证分析样本重复率(％)目标区占比(％)目标区边缘占比(％)非目标区占比(％)10.1368.9719.9011.1320.1279.198.4712.3430.1468.319.4322.2640.0978.4911.859.6750.0974.5012.0113.4860.0976.4012.1811.4170.1169.8817.2712.8580.1071.6217.4210.9690.1069.0817.5613.36100.0969.3419.3311.32均值0.1172.5814.5412.88其中重复率：测序重复的数据量与测序得到的总数据量之比；目标区占比：目标区域测序测得的数据量与测序得到的总数据量之比；目标区边缘占比：目标区边缘区域测得的数据量与测序得到的总数据量之比；非目标区占比：非目标区域测得的数据量与测序得到的总数据量之比。实施例6：利用22条探针组合对人循环肿瘤DNAKRAS基因变异进行测序检测将序列表中SEQIDNO:1-22所示的捕获探针按相同比例混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。上述22条捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应。对人循环肿瘤DNAKRAS基因变异进行测序检测，步骤与实施例3相同，除了在文库捕获步骤中使用上述制备的22条捕获探针混合物。检测结果如下：临床样本的突变位点及检测结果如表7所示。临床样本检测符合率：10/10＝100％。所有临床样本经数字PCR法验证无误。表722条探针组合临床样本检测结果利用实施例5中所述的常规捕获探针与本实施例的22条探针在65℃杂交条件下进行捕获，对比捕获后核酸得率如下表8所示：表8捕获核酸得率比较样本编号常规捕获探针本实施例的22条探针10.09％1.78％20.12％1.93％30.97‰1.36％40.82％2.28％50.23％1.43％60.06‰1.02％70.38％2.59％80.41‰1.77％91.72％3.01％100.68％2.36％注：样本捕获总量1μg；理想得率在1％-4％之间。实施例7：利用31条探针组合对人循环肿瘤DNAKRAS基因变异进行测序检测将序列表中SEQIDNO:1-31所示的捕获探针按相同比例混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。上述31条捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应。对人循环肿瘤DNAKRAS基因变异进行测序检测，步骤与实施例3相同，除了在文库捕获步骤中使用上述制备的31条捕获探针混合物。检测结果如下：临床样本的突变位点及检测结果如表9所示。临床样本检测符合率：10/10＝100％。所有临床样本经数字PCR法验证无误。表931条探针组合临床样本检测结果利用实施例5中所述的常规捕获探针与本实施例的31条探针在65℃杂交条件下进行捕获，对比捕获后核酸得率如下表10所示：表10捕获核酸得率比较样本编号常规捕获探针本实施例的31条探针10.39％1.81％20.18％2.43％30.72‰1.28％40.91％2.57％50.34％1.25％60.06‰1.20％70.29％2.03％84.58‰2.66％91.69％3.13％101.07％2.94％注：样本捕获总量1μg；理想得率在1％-4％之间。SEQUENCELISTING<110>埃提斯生物技术（上海）有限公司<120>基于高通量测序检测人KRAS基因变异的质控方法及试剂盒<130>2016<160>37<170>PatentInversion3.5<210>1<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>1aacagtctgcatggagcaggaaaaaaattaggtaatgctaaaacaaatgctaataattta60gtgtaatgtacaaaaattaccacttgtactagtatgccttaagaaaaaagtacaaattgt120<210>2<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>2gtgtaatgtacaaaaattaccacttgtactagtatgccttaagaaaaaagtacaaattgt60atttacataattacacactttgtctttgacttctttttcttctttttaccatctttgctc120<210>3<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>3atttacataattacacactttgtctttgacttctttttcttctttttaccatctttgctc60atcttttctttatgttttcgaatttctcgaactaatgtatagaaggcatcatcaacaccc120<210>4<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>4atcttttctttatgttttcgaatttctcgaactaatgtatagaaggcatcatcaacaccc60tgaaatacataaaaagtattaaaatgtgaatatatacgatggcttcatgtgtacaggtaa120<210>5<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>5tgaaatacataaaaagtattaaaatgtgaatatatacgatggcttcatgtgtacaggtaa60caaatttcattaatggaaaaaatattaagaaaggattctttatgtttctcttcaggcaac120<210>6<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>6ttttaatacttcaagttagaatactacacctaagtagttctaaagtggttgccaccttgt60tacctttaaaagacatctgctttctgccaaaattaatgtgctgaacttaaacttaccaga120<210>7<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>7tacctttaaaagacatctgctttctgccaaaattaatgtgctgaacttaaacttaccaga60ttacattataatgcattttttaattttcacacagccaggagtcttttcttctttgctgat120<210>8<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>8ttacattataatgcattttttaattttcacacagccaggagtcttttcttctttgctgat60ttttttcaatctgtattgtcggatctccctcaccaatgtataaaaagcatcctccactct120<210>9<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>9ttttttcaatctgtattgtcggatctccctcaccaatgtataaaaagcatcctccactct60ctgcattgtaaaacacaacttctttaaagtctgttgcattggtaagagtaatttactggg120<210>10<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>10ctgcattgtaaaacacaacttctttaaagtctgttgcattggtaagagtaatttactggg60aaagccatgtgcaagaagtttgagattatgagcttgagatttttttttttttaaacagac120<210>11<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>11acaaaaacatttactaaatattgttttatttcctagtatagcataattgagagaaaaact60gatatattaaatgacataacagttatgattttgcagaaaacagatctgtatttatttcag120<210>12<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>12gatatattaaatgacataacagttatgattttgcagaaaacagatctgtatttatttcag60tgttacttacctgtcttgtctttgctgatgtttcaataaaaggaattccataacttcttg120<210>13<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>13tgttacttacctgtcttgtctttgctgatgtttcaataaaaggaattccataacttcttg60ctaagtcctgagcctgttttgtgtctactgttctagaaggcaaatcacatttatttccta120<210>14<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>14ctaagtcctgagcctgttttgtgtctactgttctagaaggcaaatcacatttatttccta60ctaggaccataggtacatcttcagagtccttaactcttttaatttgttctctgggaaaga120<210>15<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>15ctaggaccataggtacatcttcagagtccttaactcttttaatttgttctctgggaaaga60aaaaaaagttatagcacagtcattagtaacacaaatatctttcaaaacctgtccacaact120<210>16<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>16aaaaaaagttatagcacagtcattagtaacacaaatatctttcaaaacctgtccacaact60tttgtcataaaatttggctgaaagaaaacaatgtaattcctagtttccactacaccaaat120<210>17<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>17tatgcatggcattagcaaagactcaaaaaataaaaactataattactccttaatgtcagc60ttattatattcaatttaaacccacctataatggtgaatatcttcaaatgatttagtatta120<210>18<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>18gcttattatattcaatttaaacccacctataatggtgaatatcttcaaatgatttagtat60tatttatggcaaatacacaaagaaagccctccccagtcctcatgtactggtccctcattg120<210>19<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>19attatttatggcaaatacacaaagaaagccctccccagtcctcatgtactggtccctcat60tgcactgtactcctcttgacctgctgtgtcgagaatatccaagagacaggtttctccatc120<210>20<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>20attgcactgtactcctcttgacctgctgtgtcgagaatatccaagagacaggtttctcca60tcaattactacttgcttcctgtaggaatcctgagaagggagaaacacagtctggattatt120<210>21<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>21catcaattactacttgcttcctgtaggaatcctgagaagggagaaacacagtctggatta60ttacagtgcaccttttacttcaaaaaaggtgttatatacaactcaacaacaaaaaatt118<210>22<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>22cagataacttaactttcagcataattatcttgtaataagtactcatgaaaatggtcagag60aaacctttatctgtatcaaagaatggtcctgcaccagtaatatgcatattaaaacaagat120<210>23<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>23aaacctttatctgtatcaaagaatggtcctgcaccagtaatatgcatattaaaacaagat60ttacctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctgtatcgtca120<210>24<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>24ttacctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctgtatcgtca60aggcactcttgcctacgccaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttca120<210>25<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>25aggcactcttgcctacgccaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttca60gcaggccttataataaaaataatgaaaatgtgactatattagaacatgtcacacataagg120<210>26<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>26gcaggccttataataaaaataatgaaaatgtgactatattagaacatgtcacacataagg60ttaatacactatcaaatactccaccagtaccttttaatacaaactcacctttatatgaaa120<210>27<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>27agtaacattttaaatttatcaaaaggattgtttttatttttattttaaagcattattaaa60tatggatcagacttgaaaagtgtttatgcaatgttaatttaaccagtgttaagagaacta120<210>28<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>28gccaaacctagagattgtaaaactttttcacttcattgtttaaaaaaaaaattaatgtct60tggcacaccaccaccccaaaatctcaacttttgag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