利用PCR‑SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法及其应用与流程

本发明属于分子遗传学领域，涉及绵羊单核苷酸多态性(SNP)分子标记的筛选与检测，特别涉及利用PCR-SSCP方法快速检测NELF基因组第454位点单核苷酸多态性。具体来说，就是对PCR扩增获得的产物变性之后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据电泳结果确定其单核苷酸多态性。

背景技术：

近20年来，尤其是近10年来，分子遗传学和分子生物技术有了突飞猛进的发展，其中，分子遗传标记是目前在家畜育种中研究得最多的内容，也是近期内最可能在家畜育种中得到广泛应用的研究项目。遗传标记是指那些可以准确鉴别的、能反映个体特异性的遗传特征。分子遗传标记则是指以个体遗传物质即核苷酸序列变异为基础的DNA分子标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。利用分子标记辅助选择育种，是现代动物分子育种的一项主要研究内容，其直接在DNA水平上对性状的基因型进行选择，因此其选种的准确性大大提高，克服了传统动物育种方法的缺陷。

单核苷酸多态性(SNP)是一种重要的分子遗传标记，它是由美国学者Lander于1996年提出的第三代DNA遗传标记，是基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基的转换、插入及缺失等形式。PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。因此，可以通过PCR-SSCP技术检测基因组是否存在SNP位点，并且准确的鉴别SNP位点的基因型。现在已经公认单链构象多态性(SSCP)可作为遗传标记应用于育种中。该方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且检测序列位点无特殊要求。

鼻胚胎促黄体激素释放激素因子(Nasal embryonic LHRH factor，NELF)编码基因与动物的生殖有密切关系。Samuel D.Quaynor等通过创建纯合NELF敲除(KO)小鼠模型，证明雌性小鼠NELF基因敲除将推迟阴道口开放，并没有延迟第一次发情的时间，减少了子宫重量并且减少了GnRH的神经元数目。与此相反，雄性小鼠的青春期表现正常。NELF敲除导致雌雄小鼠都表现为生育能力受损，平均窝产仔数降低。此外，越来越多的报道表明，NELF在小鼠的生殖方面有重要作用。绵羊的NELF基因定位在第20号染色体上，全长5928bp，编码区全长1112bp。

目前，国内外对NELF基因多态性的研究主要集中于小鼠等模式动物，而对于家畜NELF基因单核苷酸多态性的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法及其应用，从而为绵羊的分子标记辅助选择育种提供基础资料，加快中国绵羊的种质资源改良工作。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

以包含NELF基因的待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊NELF基因片段；对扩增片段进行变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据凝胶电泳结果判定绵羊NELF基因的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物F：5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’ 18nt；

下游引物R：5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’ 19nt。

所述的PCR扩增反应程序为：

95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火50s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min。

根据聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳结果鉴定绵羊NELF基因accession number NC_019477.2：g.454位的T>C突变的多态性。

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定绵羊NELF基因组第454位存在TT、TC、CC三种基因型。

所述的凝胶电泳为10-12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，先在4℃下，200-250V预电泳20-60min，再在室温下，120-150V电泳3-4h。

本发明的有益效果体现在：

针对绵羊NELF基因第454位T>C的突变，本发明提供了其检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后变性成单链DNA，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。该方法能够简单、快速、低成本、精确度高的鉴定基因的单核苷酸多态性。

本发明对突变位点的基因型进行了检测和基因频率分析，并将该位点与绵羊的繁殖性状进行关联分析。结果表明该位点可作为分子遗传标记进行分子标记辅助选择育种，以提高绵羊繁殖性状。

附图说明

图1为绵羊NELF基因组第454位(具有深色背景的位点)TT基因型个体的测序图。

图2为绵羊NELF基因组第454位CC基因型个体的测序图。

图3为绵羊NELF基因组第454位TC基因型个体的测序图。

图4为绵羊NELF基因组第454位不同基因型PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明根据绵羊NELF基因组序列设计引物，分别以2种绵羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，产物测序得到绵羊NELF基因的部分序列。与NCBI上公布的参考序列比对，发现在绵羊NELF基因组第454位存在T>C的突变，该突变位点位于绵羊NELF基因内含子内，产生一个无意突变，并将其与繁殖性状进行关联分析，确定为与绵羊繁殖性状相关的分子遗传标记，利用PCR-SSCP方法对该突变进行检测。

一、绵羊NELF基因部分序列的克隆及其多态性检测

1.样本采集及基因组DNA提取

⑴血样的采集

本发明采用了2个绵羊品种，共计607个个体作为检测对象，血液的采集方法为颈静脉采血。血样的采集地区，以及各品种的数据资料情况如表1所示：

表1实验动物情况

⑵血样DNA的提取

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃，12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。

②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。

④将反应液冷却至室温，加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次。

⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

⑧4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

⑨4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的超纯水溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪检测其质量，-80℃保存。

2.DNA池的构建

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。如果OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从2个绵羊群体中随机选择10个浓度为50ng/μL DNA样品中取5μL混合构建DNA池。

二、扩增引物设计

1.绵羊NELF基因PCR引物的设计

以NCBI所公布的绵羊序列(NC_019477.2)为参考，利用Primer 5.0软件设计能够扩增包含绵羊NELF基因第454位点的PCR引物，其引物序列如下：

上游引物F:5’-TTGCCCCTTTCGTTGCTC-3’ 18nt；

下游引物R:5’-TTTCTCCACTGTCACCGCC-3’ 19nt。

三、PCR扩增

PCR反应体系如表2所示。

表2 PCR反应体系

PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火50s，72℃延伸30s，34个循环；72℃后延伸10min。

四、PCR产物测序

将用以上混合的DNA池为模板扩增的PCR产物送上海生工有限公司进行双向测序。对绵羊NELF基因目的片段测序结果与参考序列进行比对，发现在基因组的第454位存在一个T>C的突变(参见图1、图2以及图3)。

五、PCR产物变性及SSCP检测

对于PCR扩增后的产物首先变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶检测，最终根据不同的带型结果判定其SNP多态性。具体步骤如下：

(1)根据不同的扩增片段，选择30％丙烯酰胺(29:1)配成10％～12％的聚丙烯酰胺凝胶(见表3)。

(2)加好上述溶液后，用玻璃棒慢慢搅动，使其充分混匀。立即缓慢倒入已准备好的底部密封的玻璃板之间，注意不要产生气泡；倒好凝胶后，立即插上梳子，切勿在梳子齿下留有气泡。

(3)待胶凝固后，拔掉梳子，轻轻的甩干点样孔中的水分，然后将玻璃板固定到垂直电泳槽上，并往槽中倒入1×TBE缓冲液。

(4)取8μL PCR产物，加入8μL变性缓冲液(95％甲酰胺、10mol/L EDTA、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青)，瞬时离心后在PCR仪中98℃变性10min，取出后立即置于冰上，30min后即可上样。

(5)4℃、先250V预电泳20min，然后120V电泳4h(根据扩增片段大小、凝胶浓度以及玻璃板的长度确定电压大小和电泳时间)。

(6)将电泳槽中的1×TBE缓冲液倒出回收，然后从玻璃板中取出凝胶，用蒸馏水漂洗2次后，加入适量的0.1％的硝酸银溶液，放于摇床避光轻轻摇15min(硝酸银可回收利用2～3次)。

(7)加入显色液(2％氢氧化钠+0.1％甲醛)浸没凝胶，边摇边观察，直到凝胶上显现电泳带。

(8)待条带清晰后，倒掉显色液，迅速用去离子水清洗2～3次。银染后的聚丙烯酰胺凝胶利用凝胶成像系统成像保存，留做后续的分析统计。

表3中性聚丙烯酰胺凝胶的组成

PCR-SSCP图片如图4所示。不同的带型表示不同的基因型。从图中可以看出NELF基因454位点存在三种基因型，即TT、TC、CC，其中，TT基因型和CC基因型均为两个条带，且TT基因型与CC基因型相比，远离上样端的条带距离上样端更远，TC基因型具有相应的三个条带。

六、绵羊NELF基因SNP位点的频率统计及其与繁殖性状的关联分析

1.基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。计算公式如下：

P_BB＝N_BB/N

其中P_BB代表某一位点的BB基因型频率；N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式可写成：

P_B＝(2N_BB+N_Bb1+N_Bb2+N_Bb3+N_Bb4+……+N_Bbn)/2N

式中，P_B表示等位基因B频率，N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数量，N_Bbi表示群体中具有Bb_i基因型个体数量，b₁～b_n为等位基因B的n个互不相同的复等位基因。

各品种中的基因频率与基因型频率的统计结果如表4所示：

表4 2个绵羊品种中NELF基因的基因型和等位基因频率

从表3中可以看出等位基因T的频率变化范围为0.460～0.506，等位基因C的频率变化范围为0.494～0.500，由此可见，在2个绵羊品种中，对于等位基因C的选择具有很大的潜力。

2.相关分析统计模型

利用SAS(9.2)软件分析基因位点与繁殖性状(产羔数)的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用t分析、方差分析或是多元线性模型分析基因型效应。在数据处理中，根据影响产羔数因素不同，考虑到环境效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中：Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的基因型效应；E_ijk为随机误差。

表5 NELF基因单核苷酸多态性与绵羊繁殖性状之间的方差分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表6 NELF基因单核苷酸多态性与湖羊繁殖性状之间的方差分析

表7 NELF基因单核苷酸多态性与小尾寒羊繁殖性状之间的方差分析

参见表5、6、7，结果表明，在绵羊NELF基因序列的第454位单核苷酸多态位点上的不同基因型与绵羊产羔数关联分析表明，TC基因的个体的产羔数显著高于TT和CC两种基因型的个体。如果分品种来看，对于湖羊来说TC基因型的个体的产羔数显著高于TT和CC基因型个体。但对于小尾寒羊来说，TC基因型的个体的产羔数与TT和CC基因型个体差异不显著。从群体来看，TC基因型与TT和CC基因型差异显著，但在品种上只在湖羊上检测到了差异性，而在小尾寒羊上未检测到，这可能是品种特异性造成的。因此推测TC基因型可作为湖羊早期选择的分子育种基因标记。

总之，本发明所述的方法能够快速的检测绵羊NELF基因的单核苷酸多态性，为NELF基因的SNP与繁殖性能关系的建立奠定基础，以便用于中国绵羊用繁殖性状的标记辅助选择(MAS)育种提供基础资料，快速建立遗传资源优良的绵羊种群。

核苷酸序列表

<110> 兰州大学

<120> 利用PCR-SSCP快速检测绵羊NELF基因单核苷酸多态性的方法及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttgccccttt cgttgctc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tttctccact gtcaccgcc 19