一种具有热稳定性和降解卡拉胶活力的酶的制作方法

本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种具有热稳定性和降解卡拉胶活力的酶。

背景技术：

卡拉胶(carrageenan)是海洋红藻中的一种结构性多糖，由α-1,3和β-1,4糖苷键交替连接的D-半乳糖或其衍生物组成。它是一种亲水性胶体，主要存在于海藻的细胞壁中。根据卡拉胶二糖结构单元中所含硫酸基和内醚键的数目和位置划分为若干种类型，其中κ-，λ-，ι-卡拉胶较为常见，另外也有α-，β-，θ-，μ-，ν-，γ-，δ-，ξ-，π-，ω-卡拉胶等类型。目前卡拉胶主要用于食品及与食品相关工业，已有的研究结果表明：卡拉胶寡糖具有多种生物活性，如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫调节等，因此在医药领域有很大的应用价值。

虽然卡拉胶有诸多优点，但是卡拉胶的分子质量大、溶解性差、机体不易吸收、利用率低等缺点，制约了卡拉胶在医药领域的应用。如何利用卡拉胶酶高效制备卡拉胶寡糖，提升卡拉胶的应用价值已成为当前卡拉胶研究亟需攻克的技术。迄今发现的卡拉胶酶大部分为热不稳定酶，当温度高于60℃时就会迅速失活，严重限制了卡拉胶降解酶的应用。牟海津研究表明，卡拉胶降解菌M-2分泌的κ-卡拉胶酶在55℃放置30min即丧失全部酶活；Potin等研究显示，Cytophaga菌株分泌的κ-卡拉胶酶在40℃放置1h，酶活亦完全丧失。而来源于嗜热微生物的高温酶因其作用温度高、耐热性好等优点，是生物工程领域具有发展前景的酶资源。

嗜热微生物由于能合成多种具有应用价值的耐热酶，已成为近年来科学研究的热点。微生物学家们普遍认为，能在55℃以上高温环境生长的微生物为嗜热微生物，包括最低等的古细菌和部分细菌，能在80℃以上环境中生长的为极端嗜热菌，其中大部分是古细菌。耐热酶是嗜热微生物产生的一类热稳定性酶，这种酶蛋白最显著特点就是在高温下仍能保持很高的催化效率。由于在高温条件下能提高底物和产物的溶解性，减少物质与反应器的贴壁效应，同时还能降低染菌的风险，减少产物收集的难度，所以高温酶有望取代传统的常温催化，广泛用于食品、皮革加工、生物制药、废水处理等诸多生产领域。本发明从一株热泉菌中分离获得热稳定卡拉胶酶，通过克隆获得其编码基因并通过基因工程手段实现了异源高效表达，从而获得了工业化生产热稳定卡拉胶酶的技术。

技术实现要素：

本发明提供一种具有热稳定性和降解卡拉胶活力的酶(简称为卡拉胶酶)及其应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的卡拉胶酶，其包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶；

2)与1)中氨基酸序列具有90％或以上同源性的蛋白酶。

编码上述酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2

本发明再一个方面提供一种用于重组表达上述酶的重组表达载体；

本发明还提供一种重组宿主细胞，转入了上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或上述重组载体。

本发明所提供的卡拉胶酶用于降解卡拉胶。

本发明从热泉菌株中克隆获得了一种具有热稳定性和降解卡拉胶活力的酶，将其编码基因克隆到宿主中实现异源表达，最终实现工业化生产卡拉胶酶，该酶具有较强的高温耐受力，为后续的工业应用奠定基础。

附图说明

图1：经SDS-PAGE电泳获得的电泳图；

图2：重组酶的活性鉴定图；

图3：筛选的酶的最适反应温度图；

图4：为筛选的酶降解卡拉胶的产物分析图；其中注：M为标准寡糖对照；依次为酶活酶对照、15min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、360min、720min、1440min。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

本发明说明书具体实施例中所使用的培养基的配比如下：

分离培养基(又名：Zobell 2216E海水培养基)组分如下：蛋白胨5g，酵母粉1g，用过滤后的陈海水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

分离平板培养基组分如下：蛋白胨5g，酵母粉1g，琼脂15g，用过滤后的陈海水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

LB液体培养基组分如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，用去离子水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

LB平板培养基组分如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g,琼脂15g，用去离子水定容至1000ml，121℃下高压湿热灭菌20min。

微生物样品采自于印度尼西亚卡利安达岛东海岸的热泉样品(5°44’46”N,105°35’12”E)，经16S DNA鉴定确定该菌为芽孢杆菌(Bacillus)属；初步发酵实验表明该菌株在高温下具有降解卡拉胶的能力。将纯化的菌株加入含30wt％的甘油溶液中，保存于-80℃超低温冰箱中。

实施例1：

产热稳定卡拉胶酶热泉菌的基因组文库构建

(1)制备目的DNA片段

将芽孢杆菌菌(Bacillus)种子液接种于Zobell 2216E海水培养基中，于50℃、150rpm的振荡培养箱中培养24h后，用细菌基因组提取试剂盒(购自Tiangen公司，DP302-02)提取染色体DNA，检测其电泳DNA浓度，DNA长度大于40kb，符合建库要求。

(2)基因组DNA的部分消化

芽孢杆菌菌(Bacillus)染色体DNA经Sau3AI内切酶部分消化，Sau3AI内切酶酶切60min后，制得插入片段。酶切60min后，染色体DNA刚好酶切完全，适用于构建基因组文库；当酶切时间超过80min后，酶切过度，各片段不是平均分布，而多为小片段，不利于建库。因此选酶切60min作为菌株染色体DNA的不完全酶切时间。

(3)基因组文库的构建

按照pUC118载体(购自Takara公司)和插入片段约1:3的摩尔比作连接反应。反应体系于16℃连接过夜，浓缩连接产物至3μl，分别取1μl转化感受态细胞E.coli DH5α，培养后涂布与含有氨苄青霉素(50μg/ml)、IPTG(20μg/ml)和X-Gal(40μg/ml)的LB平板培养基上，于37℃静置培养过夜至可见菌落，根据菌落蓝白斑反应筛选转化子。随机挑取约18000个菌落作为基因组文库的克隆保存，从平板中随机挑选15个白色单菌落，提取质粒，用BcaBEST Primer M13-47和BcaBEST Primer RV-M经PCR扩增目的片断，引物序列如下：

BcaBEST Primer M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

BcaBEST Primer RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸240s，30个循环；72℃延伸10min。

经检测每个克隆均有外源DNA，最小插入片段为800bp左右，最大插入片段6kb左右，平均插入片段大小约为4kb左右。

从基因组文库中筛选一个周围有明显水解圈的克隆。提取重组质粒并测序，获得产热稳定卡拉胶酶完整的ORF。ORF的完整长度为1125bp，共编码374个氨基酸，理论分子量为42.5kDa。

实施例2：热稳定卡拉胶的重组表达载体构建

将本发明获得的热稳定卡拉胶基因克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。首先基于全长序列，设计扩增全基因的引物：

上游引物F-GTCGTCGTCGACCAGTAATTTTACCGGTATC；

下游引物R-CATAAATCTAGACACTCACGACTAAAGTATCT；

PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用采用BamH I/XbaⅠ内切酶对热稳定卡拉胶酶的PCR产物和表达载体pET-30(a)分别进行双酶切，回收纯化；利用T4 DNA Ligase进行连接，并转化TOP10的感受态细胞。采用质粒抽提试剂盒(购自Tiangen公司)提取阳性克隆的质粒，经检测，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，该基因编码400个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

将上述制得的阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中，构建表达重组菌株；具体过程如下：

取-80℃保存的BL21，于冰上融化，以预冷的移液管枪尖吸取10μl重组质粒，加入刚刚融化的BL21；轻摇混匀，冰浴放置30min，迅速转移到42℃水浴中，准确放置90秒；迅速转移到冰上，冷却2min；然后加入800μl LB液体培养基，于37℃，150rpm，45min；涂布含卡那霉素50μg/mL的LB平板培养基过夜培养。

实施例3：利用重组表达菌株表达热稳定卡拉胶酶

将上述构建好的表达重组菌株转接到100ml含有卡那霉素50μg/mL的LB液体培养基中，37℃扩大培养直至菌液OD₆₀₀值达0.6时，15℃冷却30min，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为1.0mmol/L，15℃摇床培养24h。低温离心收集上清，浓缩冻干。然后进行Ni²⁺亲和层析，由于表达的重组蛋白N端含有6×His tag，能亲和吸附到层析柱中，经不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱后，收集洗脱液，冻干备用。重组蛋白的诱导表达以及纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳检测，如图1所示。

实施例4：热稳定卡拉胶酶活性检测和酶特性分析

利用DNS(3,5-二硝基水杨酸)方法测定上述制得的热稳定卡拉胶酶活性。具体操作如下：

分别取1mL灭活的与没灭活的热稳定卡拉胶酶酶液和2mL底物溶液(含有0.2wt％的κ-卡拉胶)于60℃温度恒温水浴反应30min，取1mL反应产物加入到1.5mL DNS溶液中，沸水浴5min。而后迅速冷却至室温，加蒸馏水至25mL，混匀在520nm波长下测OD值。测得的热稳定卡拉胶酶活性为800U/ml。

另外，将上述制得的热稳定卡拉胶酶酶液直接滴于固体平板培养基上，用碘液染色后可以看到明显的透明圈(图2)，表明热稳定卡拉胶酶是具有卡拉胶降解活性的，为后续的研究和应用提供了良好材料。

为测定热稳定卡拉胶酶的耐热性，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃进行酶促反应30min，DNS法测定热稳定卡拉胶酶的酶活。以酶活最高值为100％计算其相对酶活力。

经测定，热稳定卡拉胶酶最适反应温度为60℃(如图3)，在温度为80℃的条件下，该酶仍具有50％左右的酶活，较现有卡拉胶酶具有明显的高温耐受性特性。

实施例4：酶解产物组成分析

称别一定量的热稳定卡拉胶酶酶液和含有0.2wt％的卡拉胶的底物于60℃温度恒温水浴反应，并分别于30min、60min、90min、120min、150min、180min、240min、360min、720min和1440min取一定反应产物，离心浓缩，采用TLC层析技术分析反应不同时间后酶解产物的组成(图4)。其中海藻寡糖的检测方法的步骤如下：

A、毛细管点样用铅笔在距硅胶板底端2cm处轻轻划一条直线，为方便点样，在点样前在直线上每隔2cm处做一个标记。用0.5mm玻璃点样毛细管分别将卡拉胶寡糖标准品和卡拉胶寡糖样品点样于硅胶板直线上的标记处，在用毛细管点样时，毛细管应垂直于硅胶板的方向点样，而且毛细管接触硅胶板的时间应尽量短，不然点样斑点直径难以控制，点样斑点直径要控制2mm，让点样点自然干燥。

B、层析缸展层将已点好样的硅胶板底端(点样端)放入已盛有展层剂的层析缸中，层析板一定要放平，展层剂液面不得超过点样点，层析时层析缸封闭，自下而上展层，当展层前沿达距薄板顶端1厘米处时，取出硅胶板，于60℃烘箱中烘干。

C、显色剂显色将显色剂均匀的喷涂在烘干好的层析硅胶板上，置于60℃烘箱内加热，直至显出层析斑点。

由图4可见，该酶在60℃的温度下，与卡拉胶底物经过不同时间(15min-1440min)的反应，可以直接将卡拉胶降解为卡拉二糖，不产生任何中间产物，因而可以高效地制备高纯度的卡拉二糖。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家海洋局第一海洋研究所

<120> 一种具有热稳定性和降解卡拉胶活力的酶

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 374

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Met Ala Phe Ile Asn Ile Lys Pro Glu Leu Lys Gln Asn Met Glu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Asp Ile Leu Asn Ile Pro Glu Pro Leu Leu Ile Ser Ala Asn

20 25 30

Ala Asn Ala Ser Ala Asp Glu Leu Tyr Phe Pro Gly Val Ser Phe His

35 40 45

Ala Gly Lys Asn Val Gln Ala Ala Glu Thr Tyr Glu Gln Leu Gln Leu

50 55 60

Leu Ala Asn Gln Tyr Thr Phe Glu Asp Glu Gln Trp Leu Thr Lys Thr

65 70 75 80

Ala Val Tyr Asp Ser Ala Glu Leu Lys Lys Glu Ile Gly Arg Leu Thr

85 90 95

Glu Cys Phe Pro Phe Val Thr Ser Arg Ile Ile Gly Arg Ser Ser Met

100 105 110

Gly Gln Pro Ile Tyr Glu Leu Leu Leu Gly Ala Glu Asn Ala Gly Lys

115 120 125

Arg Thr His Met Asn Ala Ser Phe His Ala Asn Glu Trp Ile Thr Thr

130 135 140

Ser Val Leu Met Lys Trp Leu Lys Glu Tyr Cys Tyr His Leu Cys Thr

145 150 155 160

Gly Gln Thr Ala Leu Gly Phe Ser Pro Leu Asp Ile Phe Ser Ser Thr

165 170 175

Lys Leu Ser Val Val Pro Ile Val Asn Pro Asp Gly Val Asp Leu Val

180 185 190

Leu Asn Gly Pro Gly His Leu Gly Ile Ala Arg Glu Ala Leu Asp Glu

195 200 205

Met Asn Glu His Gln Pro Asp Phe Arg Glu Trp Lys Ala Asn Ile Asn

210 215 220

Gly Val Asp Leu Asn Asn Gln Phe Pro Ser Phe Trp Glu Ile Glu Lys

225 230 235 240

Gln Arg Lys Pro Pro Lys Ser Pro Ser Tyr Arg Asp Tyr Pro Gly Asp

245 250 255

Glu Pro Leu Thr Glu Pro Glu Ala Ala Ala Met Arg Asp Leu Ile Ala

260 265 270

Asn Glu Pro Pro Asp Arg Leu Val Ala Leu His Thr Gln Gly Glu Glu

275 280 285

Ile Tyr Trp Gly Tyr Lys Gly Leu Glu Pro Pro Glu Ser Ala Asp Val

290 295 300

Ile Gln Thr Phe Glu Arg Leu Ser Gly Tyr Lys Gly Val Arg Tyr Ile

305 310 315 320

Asp Ser Tyr Ala Gly Phe Arg Asp Trp Phe Ile His Tyr Tyr Gly Arg

325 330 335

Glu Gly Tyr Thr Val Glu Leu Gly Lys Gly Lys Asn Pro Leu Pro Leu

340 345 350

Lys Gln Phe Asp Asp Ile Tyr Cys Lys Ser Arg Gly Ile Leu Trp Ala

355 360 365

Ser Cys Phe Phe Glu Ser

370

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

atggcattca tcaacatcaa accggagtta aagcagaata tggaaagact gtctgacatt 60

ctgaacatac ccgaaccgct tttaatcagt gcaaatgcaa atgcatccgc ggacgaactt 120

tattttccgg gagtatcttt tcatgcagga aaaaacgttc aagcagcaga aacatatgaa 180

cagctgcaat tattggcgaa tcaatacacg tttgaagatg aacagtggct gacaaaaaca 240

gccgtttacg attcagcaga actgaaaaag gaaattggca gattgacgga atgctttccg 300

tttgttactt cccgtatcat cggccgctca agcatgggcc agcctatata tgaactgctc 360

cttggagctg aaaatgccgg aaaaagaacg catatgaatg cctcttttca tgccaatgaa 420

tggatcacca cttctgtttt gatgaaatgg ctcaaagaat actgttatca tttatgtaca 480

ggccagaccg ctttaggttt ttcaccgctc gatatttttt catcaacaaa gctttccgtc 540

gtgccgatcg ttaatcccga cggtgttgac cttgtactta acggccccgg tcatcttggg 600

atcgcgagag aagcgctgga tgagatgaac gagcatcagc cggatttccg ggaatggaaa 660

gccaatataa acggagtgga tttaaataat cagtttccgt ctttctggga gatcgaaaaa 720

caaagaaaac cgcctaaatc cccttcctac agagactacc ccggagatga accgctgaca 780

gaaccggaag cggcagcgat gagggattta atcgcaaacg agccgcctga ccggcttgtg 840

gcgcttcaca cacaggggga ggaaatttat tggggataca agggattgga gcctcctgaa 900

tcagctgatg tgatccaaac atttgagcgc ctgagcggtt ataagggcgt cagatatata 960

gacagctatg caggatttag agattggttt attcattatt acggaagaga aggatatact 1020

gttgaacttg gcaaaggaaa aaatccttta ccgctgaaac aatttgacga tatatattgt 1080

aaaagcagag gaatactttg ggcatcctgt ttttttgaaa gctga 1125