本发明涉及一种提高葡萄糖氧化酶耐氧化性的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术：
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，简称GOD)是生物领域中最主要的工具酶之一，自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品饲料医药等相关领域。国内外对葡萄糖氧化酶的研究主要集中产该酶的新菌株的筛选，菌株的定向改良以及发酵工艺的优化等方面。
在食品工业中，由于氧的存在引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前许多国家已将GOD作为公认的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于将葡萄糖氧化形成过氧化氢和葡萄糖酸。利用其专一氧化酶的原理制成葡萄糖氧化酶分析仪能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量指导生产。在医药工业中GOD作为试剂盒酶电极等用于血清(浆)尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑牙垢和龋齿的形成，防止口腔疾病和牙病的发生。此外由于可以催化生成H2O2，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境调节饲料消化促进动物生长。含葡萄糖氧化酶乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂可用于预防牲畜胃肠道感染腹泻并有促进动物生长作用。从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产GOD，日本常用尼奇青霉，俄罗斯用生机青霉。近年报道胶霉属(Clioctadium)、拟青霉属(Paecilomyces)和帚霉属(Scopulariopsis)也能生产GOD。葡萄糖氧化酶主要来源是黑曲霉，由于黑曲霉所产葡萄糖氧化酶酶活低、催化效率低和杂蛋白较多而使得其在实际应用中有一定的局限性。
GOD反应过程中产生过氧化氢，使得该酶具有抗菌杀菌的作用，但是过氧化氢的积累会抑制GOD的活性而影响其本身的催化效率。研究发现，当过氧化氢浓度达到30mM时就会对GOD活性产生抑制作用。因此提高GOD对氧的耐受性事目前亟待解决的问题。
技术实现要素：
为了克服上述问题，本发明利用定点突变获得了耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶。
本发明的耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，所述葡萄糖氧化酶是以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为出发序列，将第340位的丝氨酸S突变为异亮氨酸I，同时将第352位的丙氨酸A突变成为甘氨酸G；所得突变葡萄糖氧化酶命名为S340I-A352G。
本发明还要求保护编码所述突变体的核苷酸片段、含有编码权利要求1所述突变体的基因的载体、表达所述突变体的基因工程菌，以及所述突变体在食品、化工或纺织领域的应用。
本发明还提供了一株产所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌，是以毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为宿主，以pPIC9K为载体，表达所述葡萄糖氧化酶。
所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：PCR或化学合成得到编码葡萄糖氧化酶S340I-A352G的基因，连接表达载体pPIC9K，将重组质粒转化P.pastoris GS115，获得基因工程菌。
利用所述基因工程菌发酵产葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤：(1)将携带突变基因的基因工程菌活化后，在30℃、200rpm下培养至OD600＝1.5，作为种子液；(2)将种子液以3％(v/v)的接种量转入基本发酵培养基，于30℃、200rpm条件下发酵培养；(3)当在基本发酵培养基中培养至OD600＝1.4时，收集菌体，将酵母细胞转入诱导培养基中诱导蛋白的产生。
所述基本发酵培养基为BMGY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM pH 6.0的磷酸缓冲液。
所述诱导培养基为BMMY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB 13.4g，100mM pH 6.0的磷酸缓冲液。
突变体命名方式：
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如S234F，表示位置234的氨基酸由亲本普鲁兰酶的Ser替换成Phe，位置的编号对应于亲本普鲁兰酶的氨基酸序列。
本发明的有益效果：
该菌株表达的葡萄糖氧化酶S340I-A352G相比于对照出发酶，耐氧化性在不同浓度的H2O2处理后剩余酶活均有不同程度的提高，在100mmol·L-1和500mmol·L-1 H2O2存在下是对照酶的2.1、3.2倍。本发明提高了葡萄糖氧化酶的氧化稳定性，在工业上具有重大应用价值。
具体实施方式
葡萄糖氧化酶酶活测定方法：
GOD活性测定采用邻-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧的条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶(POD)作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。测540nm处吸光度的变化，根据标准曲线的结果计算葡萄糖氧化酶活力单位。1个葡萄糖氧化酶活力(1U)定义为：在30℃、pH 6.0的条件下，1min将1μmol的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量为一个葡萄糖氧化酶酶活力单位。
实施例1 重组菌的构建及鉴定
通过PCR扩增或者直接化学合成的方式，得到含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列的核苷酸片段，然后将该核苷酸片段连接到PMD18-T载体上，再转化到大肠杆菌中，得到重组菌；从重组菌中提取质粒。
根据要突变的S340和A352的前后序列，设计两对引物，引物上相应的位点核苷酸为突变后的核苷酸。利用 HS PCR酶(购于TaKaRa公司)采用全质粒PCR的方法进行PCR，PCR产物线性化处理后转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞。
分别利用针对S340、A352位点突变设计的引物以质粒为模板进行PCR，可得到单位点突变的S340I和A352G核苷酸片段；先利用针对S340位点突变设计的引物以质粒为模板进行PCR，再以针对A352位点突变设计的引物以PCR得到的产物为模板进行PCR，可得到发生了两个位点突变的S340I-A352G的核苷酸片段。
将得到的核苷酸片段分别再连接到表达载体pPIC9K中形成重组质粒，然后重组质粒线性化后电转入Pichiapastoris GS115感受态细胞。筛选正确的转化子即为重组基因工程菌。Pichia pastoris GS115/pPIC9K-S340I、Pichiapastoris GS115/pPIC9K-A352G、Pichia pastoris GS115/pPIC9K-S340I-A352G。
实施例2 重组菌产葡萄糖氧化酶的纯化和蛋白电泳鉴定
采用实施例1中获得的重组基因工程菌为生产菌株，活化后将在30℃、200rpm条件下在YPD生长培养基(装液量50mL)培养到OD600＝1.5的种子以3％(v/v)的接种量转入基本发酵培养基(装液量50mL)，于30℃、200rpm条件下发酵培养。在基本发酵培养基中培养至OD600＝1.4时，离心收集全部菌体，生理盐水洗涤2次，将菌体全部转入50mL(500mL三角瓶)液体诱导培养基BMMY中，置于30℃、200r/min摇床培养，每24h补加发酵液体积1％的甲醇，诱导产酶。以表达野生型(即，未经突变的出发GOD)葡萄糖氧化酶的P.pastoris GS115为对照菌株。
基本发酵培养基为BMGY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM pH 6.0的磷酸缓冲液。
诱导培养基为BMMY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB 13.4g，100mM pH 6.0的磷酸缓冲液。
发酵结束后获得发酵液，离心获得发酵上清，对酶进行纯化，纯化方法是阴离子层析，采用梯度洗脱的方法，最终获得较纯的葡萄糖氧化酶。
实施例3 葡萄糖氧化酶的固定化方法
采用无载体交联技术(CLEAs)固定化原酶与突变酶。取100μL酶液，加入等体积的10U/mL通用过氧化物酶，接着，缓慢滴加聚乙二醇2000至终浓度为75％(w/v)，然后加入交联剂体积分数为25％的戊二醛，至终浓度为70mmol·L-1。将混合物放入摇床，30℃交联一段20h时间，取出混合物，用缓冲液(10mM丙二酸钠缓冲液pH 5.0)洗涤，离心后收集上清，并重复上述操作，直到上清中无法检测到酶活，将固定化酶放入缓冲液中(终体积10mL)，4℃保存备用。
实施例4 酶的耐氧化性测定
用Brandford试剂盒将原酶和突变酶的酶液统一到同一蛋白浓度，采用无载体交联技术固定化原酶与突变酶。
将固定化后的原酶(对照酶)和三个突变酶S340I、A352G、S340I-A352G放在不同浓度H2O2(10、20、50、100、500mM)处理，处理温度为35℃，处理时间为2h，缓冲液为丙二酸钠缓冲液(pH 5.0，10mM)。处理后，离心，倒掉上清，并用缓冲液洗沉淀直到上清中无法检测到H2O2以彻底除去H2O2。将沉淀用等体积的缓冲液溶解，离心并充分重悬后测定剩余酶活。相对酶活是经H2O2处理后的酶活与初始酶活的比值，定义初始酶活力为100％。
结果如表1所示。
表1 不同浓度H2O2处理后的酶活保留率
结果显示，S340I-A352G在100mmol·L-1和500mmol·L-1H2O2存在下的酶活保留率是对照酶的2.1、3.2倍，耐氧化性显著提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
<110> 曹书华
<120> 一种提高葡萄糖氧化酶耐氧化性的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580