本发明属于家禽生物制品研发技术领域，具体涉及一种H5亚型禽流感病毒的增殖方法。
背景技术：
2003年以来，高致病性禽流感病毒在我国和世界许多国家广泛流行，不仅给养禽业造成巨大的损失，同时对人类的健康也构成了巨大的威胁。为了更好的预防禽流感病毒的传播，农业部批准8家企业进行H5亚型禽流感疫苗的生产。现在禽流感病毒的繁殖方法主要是依靠鸡胚进行，提高病毒含量主要通过浓缩的方法实现，但浓缩也明显提高了产品的成本，增加了污染的几率。因此，提高制苗用毒株的病毒含量才能保证疫苗优质高效。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种H5亚型禽流感病毒的增殖方法，能够有效的提高尿囊液中病毒的含量，从而弥补现有技术的不足。
本发明的H5亚型禽流感病毒的增殖方法，包括如下的步骤：
1)取H5亚型禽流感病毒用病毒稀释液进行稀释后接种10日龄的SPF鸡胚，在36℃培养，然后收获72h未死亡鸡胚的尿囊液，收集尿囊液，置-40℃保存；
所述的H5亚型禽流感病毒，为Re-6、Re-7、Re-8株中的任一种或几种；
所述的病毒稀释液，是添加氨基酸混合物和维生素混合物的磷酸缓冲液；
其中氨基酸混合物的配比如下：40％天冬氨酸、30％脯氨酸、30％谷氨酰胺；
维生素混合物的配比如下：40％维生素B3、30％维生素B1和30％维生素B7。
所述的磷酸缓冲液的一种配比如下：NaH2PO4·2H2O 1.56g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，Nacl 9g，加水至1000ml；
作为实施例的优选，在病毒稀释液中氨基酸混合物的质量百分比为0.3％，维生素混合物的质量百分比为0.5％；
2)将步骤1)收集的尿囊液再用病毒稀释液进行10倍倍比稀释，选取10-6～10-9范围稀释度的病毒液接种10日龄SPF鸡胚，置35.5℃培养，收获72h未死亡胚尿囊液，再取高稀释度且HA效价最高的尿囊液混合后作为种子液。
3)按照步骤3)的方法对步骤2)收集的种子液连续传代4次，再取高稀释度且HA效价为10log2、9log2、10log2的尿囊液混合，获得最终制备疫苗用的病毒液；
本发明方法制备的病毒液，可以不经过浓缩就直接来制备疫苗：
所述的疫苗制备方法如下：
1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份的司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；
2)水相制备：将病毒液灭活后加入水相中，取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入病毒液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；
3)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟，乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟完成制备。
本发明提供一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗，旨在节约疫苗制备成本，提高生产效率，从而克服现有制苗用毒株病毒含量比较低，制备多联多价疫苗需要浓缩才能达到单苗的技术缺陷。
具体实施方式
申请人在研究中发现，将氨基酸和维生素添加到磷酸溶液中制成的病毒稀释液可提高病毒的增殖效果。用该稀释液稀释病毒后进行病毒的增殖、纯化，可使病毒含量提高7～10倍，无需浓缩即可实现多联多价疫苗的生产，免疫效果也很显著；从而促成了本发明。
本发明用了3株禽流感的病毒毒株，分别为Re-6、Re-7、Re-8株。这3株病毒经过纯化后获得HA效价高、免疫原性好的病毒株，纯化后Re-6、Re-7、Re-8株的病毒含量分别为108.5EID50/0.1ml、108.38EID50/0.1ml、108.5EID50/0.1ml；HA效价分别为10log2、9log2、10log2。其中Re-6、Re-7、Re-8株是目前用作制备H5亚型禽流感病毒疫苗的常用病毒株。
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1
本实施例的禽流感病毒增殖方法，包括如下的步骤：
1、病毒稀释液的配制：每1000ml磷酸缓冲液中加氨基酸组合3g、维生素组合5g，0.22um滤器过滤除菌，备用。
pH7.0的磷酸缓冲液配方为：NaH2PO4·2H2O 1.56g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，Nacl 9g，加水至1000ml。
氨基酸组合配方为：天冬氨酸40％、脯氨酸30％和谷氨酰胺30％。
维生素组合配方为：维生素B1 30％、维生素B3 40％和维生素B7 30％。
2、病毒的扩繁，方法如下：
1)取Re-6、Re-7、Re-8株，分别用上述稀释液作10000倍稀释后接种10日龄SPF鸡胚，0.1ml/枚，置36℃培养，收获72h未死亡胚尿囊液，收集尿囊液，测定HA分别为8log2、8log2、8log2，均标记为E0，置-40℃保存；
2)病毒无限稀释法纯化：将繁殖后病毒液用上述稀释液进行10倍倍比稀释，选取10-6～10-9 4个稀释度的病毒液接种10日龄SPF鸡胚10枚，0.1ml/枚，置35.5℃培养，收获72h未死亡胚尿囊液，再取高稀释度且HA效价高(分别为9log2、9log2、9log2)的尿囊液混合后作为基础种子，标记为E1。
3)将得到的基础种子E1代按照步骤2)方法连续传代4代(标记为E2～E5)后，获得HA效价为10log2、9log2、10log2的尿囊液，经测定病毒含量为108.5EID50/0.1ml、108.38EID50/0.1ml、108.5EID50/0.1ml，置-40℃保存；
增殖病毒及与原毒对比试验：
将步骤3)得到的尿囊液和未用本实施例方法扩繁的病毒分别用上述稀释液适当稀释后，分别接种10日龄非免疫鸡胚100枚，0.1ml/枚，置35.5℃培养，收获72h未死亡胚的尿囊液，测定半成品HA效价及病毒含量。
由上述结果可见，用本发明方法纯化后的毒株，经测定，其病毒含量比未纯化前高7-10倍。本发明的方法应用上述3株禽流感病毒进行试验，证明该方法纯化禽流感病毒的重复性好很好。
实施例2
将上述收获后的病毒液分别制备疫苗进行免疫效力对比试验
(一)抗原液准备
1、实施例1中扩繁纯化前的病毒液各100ml。
2、实施例1中扩繁纯化前的病毒液各300ml浓缩至100ml。
3、实施例1中扩繁纯化后的病毒液各100ml。
(二)抗原液病毒含量测定将(一)抗原液分别测定HA效价及EID50。由试验结果可见，未纯化的病毒液即使浓缩3倍其病毒含量也很难达到纯化后的病毒的病毒含量。
(三)抗原液的灭活将上述病毒液分别用0.05％的甲醛溶液灭活16小时，置2～8℃保存。经灭活检验合格后进行疫苗制备。
(四)疫苗制备
1、油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份的司本-80，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；
2、水相制备：将灭活的三种病毒液加入水相中，取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入病毒液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解；
3、乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟制备。
结果表明，免疫效力由高到低依次为纯化后的病毒液制备疫苗、未纯化病毒液浓缩3倍制备疫苗、未纯化病毒原液制备疫苗。