本发明涉及一种金属β-内酰胺酶的三肽抑制剂，尤其涉及该肽在制备抗菌药物及预防、治疗耐药菌感染中的用途。
背景技术：
产生β-内酰胺酶是导致细菌尤其是革兰氏阴性菌耐药的重要机制之一，它们能水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环，导致抗生素失活。β-内酰胺酶可以分为丝氨酸β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶(MBLs)。根据氨基酸序列的同源性以及对金属Zn离子的依赖性，MBLs又进一步分为B1，B2和B3亚类。目前发现B1类有18个同源家族，B2类有3个同源家族，B3类有9个同源家族。由于金属β-内酰胺酶能够水解包括碳青霉稀类抗生素在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素，而且目前没有有效的抑制剂上市，因此MBLs是目前临床上抗感染治疗的重大挑战，受到了广泛关注。
B1类MBLs中的IMP、VIM以及近几年流行的NDM型金属β-内酰胺酶临床检出率最高。2010年8月《柳叶刀-传染病》杂志上报道了在印度、巴基斯坦和英国共分离得到180株含有blaNDM-1质粒基因的细菌，实验发现，它们除了替加环素和多黏菌素以外，对其他所有抗生素都具有高度耐药性。不断进化的突变株使得临床治疗更加艰难，因此开发广谱MBLs抑制剂成为医学领域的一大挑战。
技术实现要素：
本发明以多药耐药细菌所产生的金属β-内酰胺酶为靶标，并针对该类酶催化水解抗生素的活性中心设计合成了一个三肽，本发明的三肽可联合抗生素治疗多药耐药细菌感染。
本发明的金属β-内酰胺酶三肽抑制剂为广谱金属β-内酰胺酶抑制肽，其特征在于长度为3个氨基酸，拓扑结构为线性，化学结构式为：
本发明所涉及的金属β-内酰胺酶三肽抑制剂用固相合成法制备，方法简单，技术成熟，产物质量容易控制，能满足大规模工业化生产的需要。
药效学试验证明本发明的三肽对典型的金属β-内酰胺酶，如NDM-1、IMP-1和VIM-2等，具有明显的抑制作用。
药效学试验证明本发明的三肽与β-内酰胺类抗生素具有良好的协同作用，能明显抑制耐药菌生产并且大幅度降低β-内酰胺类抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。所述的β-内酰胺类抗生素优选头孢呋辛钠。
本发明的三肽也可以和药学上可接受的盐结合，同样具有其药效。这些盐包括(但不局限于)与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐。其他盐包括与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。药学上可接受的盐优选钠盐。
本发明公开了一种抗菌药物组合物，其中含有该三肽或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。
上述药物组合物可以制成注射剂、片剂、注射用无菌粉末、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。上述各种剂型均可以根据药学领域的常规方法制备。可以通过注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化学介导的方法导入肌肉、内皮、皮下、静脉、粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入肌体。
一般地，本发明的三肽使用剂量在0.001～10克/天，也可以根据疾病的情况偏离这个剂量范围。
下面是本发明的三肽的部分药效学试验及结果：
一、三肽对NDM-1型金属β-内酰胺酶抑制活性(IC50)的测定：
以头孢呋辛钠为报告底物，在274nm波长下测定NDM-1型金属β-内酰胺酶水解底物后吸光度的变化。测定缓冲液为50mM HEPES，250mM NaCl，2μM ZnCl2，pH＝7.25，温度30℃。
(1)首先将金属β-内酰胺酶(终浓度10μM)于缓冲液中孵育5min，使得Zn2+充分占据活性中心；
(2)加入10μL不同浓度的三肽抑制剂，30℃孵育5min，使抑制剂与酶充分结合；
(3)将体系转入石英比色皿中，加入8μL头孢呋辛钠(终浓度160μM)的同时立即测定体系吸光度的变化，记录数据。
由于底物头孢呋辛钠被酶水解后其吸光度下降，因而通过测定吸光度的变化可以表征底物的水解程度。计算不同浓度的三肽抑制剂对NDM-1水解底物的抑制率，以三肽抑制剂的浓度对抑制率拟合曲线，计算得到本发明的三肽分子对NDM-1型金属酶的IC50值为86.46μM，表明其对NDM-1型金属酶有较好的抑制作用。
二、三肽抑制剂对IMP-1型金属β-内酰胺酶抑制活性(IC50)的测定：
以头孢呋辛钠为报告底物，在274nm波长下测定IMP-1型金属β-内酰胺酶水解底物后吸光度的变化。测定缓冲液为50mM HEPES，250mM NaCl，2μM ZnCl2，pH＝7.25，温度30℃。具体操作步骤同实施例1。计算不同浓度的三肽抑制剂对IMP-1水解底物的抑制率，以三肽抑制剂的浓度对抑制率拟合曲线，计算得到三肽分子对IMP-1型金属酶的IC50值49.6μM，说明此三肽分子对IMP-1型金属酶有较好的抑制作用。
三、三肽分子与β-内酰胺类抗生素协同抗NDM-1型工程菌活性的测定：
为了能够安全进行协同抗菌实验，使用相对安全的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1菌株作为耐药菌株，将E.coli BL21(DE3)/pET28a菌株作为阴性对照。采用二倍稀释法测定最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)，通过MIC值的变化反映抑制肽与抗生素的协同抗菌作用。
具体方法如下：
将超低温冰箱中保存的工程菌菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1以及对照菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基中，于37℃恒温培养箱中倒置培养12小时。用接种环挑取单菌落分别转接到灭菌的液体LB培养基中，于37℃，200rpm条件下震荡培养至对数生长期。用紫外分光光度计测定600nm波长处菌液的吸光度值(OD600)，根据1OD＝1×109CFU/mL的换算关系，分别将表达金属β-内酰胺酶的工程菌菌株以及对照菌株稀释至终浓度1×106CFU/mL。
对照组(1)：E.coli BL21(DE3)/pET28a菌。在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的终浓度为512～2μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液，混合均匀。
对照组(2)：表达金属β-内酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1。在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的终浓度为512～2μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液，混合均匀。
对照组(3)：表达金属β-内酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1。在无菌96孔板中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和终浓度为200μM的三肽抑制剂，混合均匀。
实验组均使用能表达金属β-内酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1。
实验组(1)：在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的浓度为512～2μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和终浓度为200μM的三肽抑制剂，混合均匀。
实验组(2)：在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的浓度为512～2μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和终浓度为100μM的三肽抑制剂，混合均匀。
实验组(3)：在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的浓度为512～2μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和终浓度为50μM的三肽抑制剂，混合均匀。
实验组(4)：在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的浓度为512～2μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和终浓度为25μM的三肽抑制剂，混合均匀。
实验组(5)：在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的浓度为512～2μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和终浓度为12.5μM的三肽抑制剂，混合均匀。
实验组(6)：在无菌96孔板中加入依次倍比稀释的浓度为512～2μg/mL的抗生素头孢呋辛钠，然后向各孔中加入终浓度1×106CFU/mL的菌液和终浓度为6.25μM的三肽抑制剂，混合均匀。
以上各组于37℃缓慢震荡培养16小时，测定波长为600nm处的吸光度值。检测不到细菌生长的孔中头孢呋辛钠的终浓度为最小抑菌浓度(MIC)，三肽分子Phe-Cys-Pro对含有NDM-1的耐药菌株联合抑菌效果如表1所示。
表1三肽Phe-Cys-Pro与头孢呋辛钠协同抗NDM-1工程菌的测定结果
a-：三肽Phe-Cys-Pro本身无抗菌活性。
由表1结果可知，对照组(1)中头孢呋辛钠对敏感菌株E.coli BL21(DE3)具有良好的抑制作用(MIC＜2μg/mL)；对照组(2)为耐药菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1，头孢呋辛钠几乎不能抑制该菌株的生长(MIC＝256μg/mL)，同时也证明了该菌株为耐药菌；对照组(3)中含有终浓度为200μM的Phe-Cys-Pro而不含抗生素，培养16小时后菌液十分浑浊，证明该三肽抑制剂本身无抗菌作用。
从实验组(1)～(6)的MIC可以看出，当Phe-Cys-Pro与抗生素头孢呋辛钠联合使用时，通过协同作用能明显提高头孢呋辛钠的抗菌活性，当三肽抑制剂浓度为200μM时，头孢呋辛钠的抗菌活性(MIC值)提高了16倍(256/16)；当三肽抑制剂浓度为25μM时，头孢呋辛钠的抗菌活性(MIC值)提高了2倍(256/128)。
具体实施方式
实施例1
Phe-Cys-Pro的制备
1.称取2.0g MBHA(4-甲苯氢胺)树脂于洁净干燥的反应管中，加入适量DMF(二甲基甲酰胺)，活化30min左右，然后称取Fmoc(芴甲氧羰酰基)保护的Phe 1mmol，DMAP(4二甲氨基吡啶)150mg，加98％的DIC(N，N’-二异丙基碳二亚胺)1ml到反应管中，DMF做溶剂反应3h。反应完毕用DMF洗4～6次，加入适量吡啶和乙酸酐，体积比为1∶1，反应30min。反应完毕用DMF洗4～6次。然后用20％的哌啶溶液脱掉氨基酸的Fmoc，脱两次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
2.称取Fmoc保护的Cys 3mmol，HBTU(苯并三氮唑N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)3mmol于反应管中，加入DIEA(N，N-二异丙基乙胺)0.5mL，反应40min，用DMF洗4～6次，取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入20％的哌啶溶液脱Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
3.称取Fmoc保护的C端氨基酸Pro 3mmol，HBTU 3mmol于反应管中，加入DIEA 0.5mL，反应40min，用DMF洗4～6次，取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入20％的哌啶溶液脱Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色。
4.最后用三氟乙酸切割液切割2h，反应液抽滤，得多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉淀，离心，然后再用乙醚洗3～5次，得白色固体，经C18反相制备柱脱盐，冻干，取少量进行MS分析。HPLC测定三肽的纯度为95.56％，MS鉴定其分子量为365.10，与理论分子量365.45基本一致。
实施例2
含Phe-Cys-Pro抑制肽的抗菌药物组合物的制备(胶囊)
按照100个胶囊的用量，称取以上各辅料分别研细过筛后混合均匀，然后用等量递加法加入头孢呋辛钠和Phe-Cys-Pro，充分研磨，使其分散均匀，再过80目筛，然后灌制成胶囊。