一种微型化黄瓜植株相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及基因工程和黄瓜的蛋白和基因，属于分子遗传育种领域，具体涉及一种微型化黄瓜植株相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

黄瓜(cucumissativusl.2n＝2x＝14)属葫芦科甜瓜属一年生蔓生草本植物，是世界上十大蔬菜作物之一。尽管黄瓜的地理分布十分广泛，但其遗传基础狭窄，导致现有可用于各种表型基因研究的材料较为缺乏，阻碍了黄瓜功能基因组学和遗传研究工作的快速发展。在用ems构建的黄瓜突变体库中，发现一个可稳定遗传的单基因控制黄瓜植株微型化的突变体。该突变体可以用于选育优良的黄瓜新品种类型，同时也是研究黄瓜果实遗传和进化的理想材料。随着新一代测序技术的发展，对微型化突变体和野生型单株进行高通量简化基因组混池测序，在七号染色体上初定位到一个14.11-17.63mb的区间，通过ems诱变原则(g→a和c→t)以及δsnp指数≥0.8，最终定位到控制黄瓜植株微型化的基因mp1。

植物细胞微管骨架的排布方式对细胞的生长发育及形态建成具有重要意义。微管的这种动态组织行为不仅需要自身组成的微管蛋白，还需要微管结合蛋白(microtubule-associatedproteins，maps)的参与，它是一类能够特异地与微管结合，并参与调节微管结构与功能的结合蛋白。植物微管结合蛋白在植物组织中广泛发挥作用，如调节微管的组装和动力学，形成和支持微管骨架并用这个骨架来进行物质转运等。剑蛋白(katanin)是微管结合蛋白之一，由p⁶⁰亚基和p⁸⁰亚基组成的异源二聚体，是一种微管切割因子。p⁶⁰亚基属于aaaatp酶(atpaseassociatedwithvariouscelluaractivities)家族，能切割微管。p⁸⁰亚基参与剑蛋白在微管组织中心的定位和p⁶⁰亚基的微管切割活性的调节。mp1编码了一个p⁶⁰剑蛋白，它在植物生长过程中起重要作用，包括各向异性的细胞延伸、激素信号的传递和根毛的形成等(lloydandchan，2004)。在p⁶⁰剑蛋白突变体中，拟南芥根伸长区细胞周质微管的排列方向发生了明显改变(burkandye，2002)，meier等(2002)在表达赤霉素-荧光素酶报告基因的转基因(一个p⁶⁰剑蛋白突变体的等位基因)luel突变体中检测到赤霉素异常表达。mp1在黄瓜中的克隆，将有助于阐明p⁶⁰剑蛋白在黄瓜细胞微管结构与功能方面的作用，在黄瓜新品种选育和株型研究中具有非常重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种黄瓜植株微型化相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白属于p⁶⁰剑蛋白，在氨基酸取代的情况下，能使微管细胞骨架缺失，细胞排列异常，导致黄瓜植株微型化的现象，可以为黄瓜的株型改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：定位到一个黄瓜植株微型化的相关蛋白，命名为mp1，来源于黄瓜，mp1是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中seqidno：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表seqidno：2所示的氨基酸序列中经过取代一个氨基酸且与黄瓜植株微型化相关的由a)衍生的蛋白质。

seqidno：2氨基酸序列由521个氨基酸残基组成，属于aaaatp酶家族，能切割微管，使细胞骨架缺失，植株表现出微型化。

上述b)中的mp1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的mp1的编码基因可以通过将序列表中seqidno：1所示的dna序列中进行一个碱基对的非同义突变。

编码所述mp1的基因也属于本发明的保护范围。

mp1基因具体可分为1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中seqidno：1所示的dna分子；

2)在严格条件下可与序列表seqidno：1限定的dna序列杂交且编码上述与植株微型化相关蛋白的dna分子；

3)与1)的基因有90％以上的同源性，且编码上述与植株微型化相关蛋白的dna分子。

seqidno：1序列由1566个碱基组成，自5端第1-3位为起始密码子，编码具有序列表中seqidno：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质；该氨基酸序列为aaaatp酶类，具有七个外显子和六个内含子。基因的碱基序列的1058bp位的胞嘧啶(c)被胸腺嘧啶(t)取代，编码的氨基酸残基序列的353位丝氨酸(ser)突变为苯丙氨酸(phe)。

含有mp1基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明的优点在于一种黄瓜植株微型化相关蛋白及其编码基因与应用，该蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示，属于aaaatp酶家族，与微管切割相关；该蛋白的编码基因如序列表seqidno：1所示的碱基序列，该碱基序列若在1058bp位的胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，编码的氨基酸残基序列的353位ser突变为phe，这样该蛋白抑制微管细胞正常发育，使微管细胞骨架缺失，排列异常，具体在植株表型为植株微型化，突变体植株高度只有正常野生型植株高度的20％左右，果实长度也只有正常野生型果实长度的10％左右，同时叶片和种子均明显变短。该蛋白及其编码基因的应用，可以为黄瓜株型的改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。

附图说明

图1黄瓜植株微型化突变体mp1的株高表型，左边为突变体mp1，中间为中间型，右边为野生型。

图2黄瓜植株微型化突变体mp1的成熟瓜表型，左边为突变体mp1，中间为中间型，右边为野生型。

图3黄瓜植株微型化突变体mp1的叶片表型，左边为突变体mp1，中间为中间型，右边为野生型。

图4黄瓜植株微型化突变体mp1的种子表型，左边为突变体mp1，右边为野生型。

具体实施方式

以下结合附图、实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1突变体的表型及遗传分析

从ems(ethylmethylsulfonate)诱变的长春密刺突变体库中筛选到一个黄瓜植株微型化的突变体mp1。突变体与野生型相比，它的株高显著降低，生长势减弱、育性降低，叶片变小变深绿，无侧枝，卷须变短，果实变短，种子变小变圆(图1、2、3、4)。

以突变体mp1为父本，与野生型长春密刺杂交，获得子一代f1植株，f1植株与野生型相比，株高变矮，果实长度变短，出现了中间型。f1代自花授粉所得的f2中，正常植株、中间型与突变体的分离比为113∶255∶117≈1∶2∶1，正常植株对突变体是不完全显性突变，表明该突变体是隐性单基因突变体，命名该基因为mp1。

实施例2mp1基因的定位

利用获得的f2群体中的突变单株和野生型单株进行混池测序，突变体dna池用超声波方法随机打断，依照illuminapaired-enddnasampleprepkit建议的方法建库。然后选取长度为200-300bp之间的片段，采用hiseq2000平台(pe101)进行重测序。测序原始数据经过质量监控，去除低质量及接头污染的数据后，通过soap2软件，将数据比对到黄瓜参考基因组9930上，得到比对到唯一位置的reads。然后利用这些数据，采用soapsnp软件寻找突变体与9930参考基因组间的单核苷酸多态性(snp)，并根据snp指数在染色体上作出突变体池的图。采用同样的方法测序并分析野生型长春密刺个体重测序数据，得到野生型长春密刺与9930之间的snp位点，作出野生型池的snp指数图。然后将突变体/9930snp与野生型长春密刺/9930snp相比较，根据δsnp指数在染色体上作图。根据滑动窗口法的计算，将初定位区间定位到七号染色体14.11-17.63mb的区域上。理论上，造成突变性状的突变位点snp指数应该等于1，即为纯合位点；由于遗传连锁，其附近的snp位点指数应该等于或接近1。在初定位区域内寻找成簇分布的snp位点，再根据ems诱变通常产生的突变，即g→a或c→t突变，一共找到了37个snp位点。大多数的snp位点处在内含子以及基因间区，有一个snp处在csa7m414410.1的3端非翻译区，只有5个snp位点处在基因的外显子上，但是只有一个snp是非同义的纯合突变，原本的胞嘧啶(c)被胸腺嘧啶(t)取代，导致编码的丝氨酸(ser)突变为苯丙氨酸(phe)，从而确定导致突变的候选基因mp1。

实施例3mp1基因克隆和鉴定

mp1基因突变位于距离起始密码子1058bp处，碱基c突变为t。为了验证测序的结果，对cucurbitgenomicsdatabase中编号为csa7m435510.1基因的cdna进行测序，证实编码区cdna的胞嘧啶(c-1058)突变为胸腺嘧啶(t)，造成编码的丝氨酸(ser-353)突变为苯丙氨酸(phe)，与测序结果相符，证实该基因的突变导致植株微型化，定名为基因mp1。

mp1基因全长cdna的获得：

黄瓜长春密刺和mp1叶片总rna的提取采用trizol方法，并在25℃条件下进行dna消化30分钟，从总rna中吸取2mg为模板采用takara公司的反转录试剂盒primescript^tmrtreagentkit合成第一链cdna。以此cdna为模板，用引物csa7m435510.1-f(5’-atggggagcaatacactggtg-3’)和引物csa7m435510.1-r(5’-tgcagacccaaattctgaaaac-3’)采用takara公司的高保真酶gxldnapolymerase进行pcr扩增反应，反应条件如下：

反应体积26ul，其中含有：

用双蒸水补足至26ul体积。

反应程序如下：98℃，变性1分钟，然后98℃变性15秒，60℃退火30秒，68℃延伸2分钟，扩增35个循环；最后在68℃下延伸5分钟。

扩增产物用omega公司的dna凝胶回收试剂盒按产品说明书进行纯化，然后纯化的产物用rtaq酶(takara)进行加a反应，反应条件如下：

反应体积10ul，其中含有

反应程序：72℃连接10分钟。

将加a后的产物与pmd19-t载体(takara)在16℃下连接4小时，构建重组载体pmd19-mp1。42℃热击60秒将重组载体pmd19-mp1转化大肠杆菌dh5α(takara)，转化物在含有氨苄青霉素的lb平板培养基上生长，挑取克隆，提取质粒，送交genscript测序。测序结果表明，扩增到的片段的核苷酸序列如序列表1所示，将该片段命名为mp1基因，mp1基因全长1566bp，其编码的氨基酸序列见序列表中序列2所示。