微生物复合菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及环境微生物领域，具体而言，涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用。

背景技术：

石油污染多数发生在海洋环境中，会对海洋及其周围的生态环境造成非常严重的危害，不仅引起大面积海域缺氧从而导致海生动植物的死亡，还会造成海滩荒芜，破坏海产养殖和盐田生产，毁坏滨海旅游区，降低海洋生态系统的服务功能和价值；此外，许多石油烃类通过食物链进入鱼虾贝类体内，影响其经济价值，并通过食物富集进入人体，危害人类健康。因此，石油污染时海洋生态环境的最大威胁。

石油烃成分非常复杂，没有任何一种微生物能降解石油中的所有组分。现有的用于降解含油废水中的石油组分的微生物具有去除效率低、降解芳香烃不全面、环境适应性和功能稳定性差等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种微生物复合菌剂，其能够同时全面有效地降解石油烃中大量存在的直链烃、支链烃及芳香烃，能够提高受石油污染的海水中的石油烃的去除率，从而有利于海洋环境的保护。

本发明的另一目的在于提供上述微生物复合菌剂的制备方法，以获得一种能够同时全面有效地降解石油烃中大量存在的直链烃、支链烃及芳香烃的微生物复合菌剂，且该制备方法所需环境条件温和且操作简单、方便。

本发明的另一目的在于提供上述微生物复合菌剂在降解石油烃的应用，以使得能够更有效、快速、全面地降解石油烃。

本发明的另一目的在于提供上述微生物复合菌剂在降解污水中的石油烃的应用，以能够快速有效地降解污水中的石油烃，提高受石油污染的污水中的石油烃的去除率，达到较佳的污水处理效果。

本发明是这样实现的：

一种微生物复合菌剂，微生物复合菌剂的微生物主体包括柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)、海绵假单胞菌(Pseudomonas pachastrellae)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)以及除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)。

上述微生物复合菌剂的制备方法，包括：将柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)、海绵假单胞菌(Pseudomonas pachastrellae)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)以及除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)接种于菌剂培养基进行共同培养，得到微生物复合菌剂。

上述微生物复合菌剂在降解石油烃的应用。

上述微生物复合菌剂在降解污水中的石油烃的应用。

本发明实施例的微生物复合菌剂及其制备方法以及其在降解污水中的石油烃的应用的有益效果是：微生物复合菌剂中的四种微生物主体柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌之间能够相互协同，且能够相互提高在海水中的生存能力，使得彼此在海水中的稳定性能更好，进而达到能够更加全面高效地降解石油烃中大量存在的直链烃、支链烃及芳香烃的效果。此外，该微生物复合菌剂制备过程简单，设备需求简要，操作简易，需要的环境条件温和，适于工业推广和应用。微生物复合菌剂在降解石油烃方面的应用能够有效地解决海洋石油污染的环境问题，在促进中国石油行业的发展、环保技术的革新、打破行业技术壁垒具有重要的研究价值和巨大市场应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明的实施例4提供的柴油食烷菌种子液处理的含油培养基中13种直链烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图2为本发明的实施例4提供的海绵假单胞菌种子液处理的含油培养基中13种直链烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图3为本发明的实施例4提供的威尼斯不动杆菌种子液处理的含油培养基中13种直链烃的相对剩余量的4天的变化趋势图；

图4为本发明的实施例4提供的除烃海杆菌种子液处理的含油培养基中13种直链烃的相对剩余量的4天的变化趋势图；

图5为本发明的实施例4提供的微生物复合菌剂处理的含油培养基中13种直链烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图6为本发明的实施例4提供的柴油食烷菌种子液处理的含油培养基中2种支链烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图7为本发明的实施例4提供的海绵假单胞菌种子液处理的含油培养基中2种支链烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图8为本发明的实施例4提供的威尼斯不动杆菌种子液处理的含油培养基中2种支链烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图9为本发明的实施例4提供的除烃海杆菌种子液处理的含油培养基中2种支链烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图10为本发明的实施例4提供的微生物复合菌剂处理的含油培养基中2种支链烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图11为本发明的实施例4提供的柴油食烷菌种子液处理的含油培养基中12种芳香烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图12为本发明的实施例4提供的海绵假单胞菌种子液处理的含油培养基中12种芳香烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图13为本发明的实施例4提供的威尼斯不动杆菌种子液处理的含油培养基中12种芳香烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图14为本发明的实施例4提供的除烃海杆菌种子液处理的含油培养基中12种芳香烃的相对剩余量的3天的变化趋势图；

图15为本发明的实施例4提供的微生物复合菌剂处理的含油培养基中12种芳香烃的相对剩余量的3天的变化趋势图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的微生物复合菌剂及其制备方法以及其应用进行具体说明。

微生物复合菌剂的微生物主体包括柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)、海绵假单胞菌(Pseudomonas pachastrellae)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)以及除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)。

其中，柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)、海绵假单胞菌(Pseudomonas pachastrellae)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)以及除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)均获取于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)。柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)的菌株编号为2216L-B-5，保藏登记号为1A00001；海绵假单胞菌(Pseudomonas pachastrellae)的菌株编号为HLB AS-3，保藏登记号为1A00102；威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)的菌株编号为WP02421，保藏登记号为1A00294；除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)的菌株标号为DLFJ 7-4，保藏登记号为1A03971。

柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌的保藏可以是将四种菌株接入对应的培养基中制得菌液并将每种菌株的菌液和40％甘油以1：1-1：1.5体积比进行混合后，放置于-70℃冰箱。

其中，对应柴油食烷菌的培养基是1001号培养基，包括：乙酸钠0.5-1.5g/L、蛋白胨8-12g/L、酵母粉1-3g/L、普通肉汁0.1-0.8g/L、硝酸铵0.1-0.3g/L、柠檬酸三钠0.1-0.8g/L、磷酸二氢钾0.2-0.8g/L以及人工合成海水，pH为7.0-7.8。

对应海绵假单胞菌的海绵假单胞菌培养基是0472号培养基包括：酵母粉3-7g/L、蛋白胨8-12g/L、氯化钠20-35g/L以及去离子水；pH为6.5-7.5。

对应威尼斯不动杆菌的威尼斯不动杆菌培养基是0033号培养基包括：酵母粉3-7g/L、蛋白胨8-12g/L、氯化钠5-15g/L；溶剂为去离子水，pH为6.5-7.5。

对应除烃海杆菌的除烃海杆菌培养基是0821号培养基包括：乙酸钠3-8g/L、蛋白胨0.2-0.8g/L、酵母粉0.2-0.8g/L、葡萄糖0.2-0.8g/L、蔗糖0.2-0.8g/L、柠檬酸钠0.02-0.08g/L、DL-苹果酸0.02-0.08g/L、硝酸铵0.8-1.5g/L、氯化铵0.1-0.5g/L、磷酸二氢钾0.2-0.8g/L以及人工合成海水，pH为7.0-8.0。

其中，人工合成海水为：氯化钠20-28g/L、六水硫酸镁8-14g/L、硫酸钠3-5g/L、六水氯化钙1-3g/L、氯化钾0.5-1.0g/L、溴化钾0.05-0.2g/L、硼酸0.01-0.05g/L、九水硅酸钠4-8mg/L、六水氯化锶0.02-0.08g/L、氟化钠1-5mg/L、硝酸铵1-6mg/L、磷酸铁0.5-1.5mg/L；溶剂为去离子水；pH为6.8-7.8。

在一个较佳的实施例中，微生物复合菌剂中的微生物主体柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌接种于菌剂培养基中以菌液形式存在，并在微生物复合菌剂中的浓度各自独立地为10⁷-10⁹cfu/mL。当柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌四种菌株在微生物复合菌剂中的浓度均位于10⁷-10⁹cfu/mL浓度范围时，能够更好地对进行石油烃进行快速有效的降解，同时四种菌株之间的组合配伍，能够相互进行协同配合，提高各个菌株的存活能力以及活性，进而达到更好地降解效果。需要说明的是，在其他实施例中，微生物复合菌剂中的微生物主体柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌可以是以非菌液形式存在，例如干燥菌剂。

当四种菌株的浓度部分或者全部小于10⁷-10⁹cfu/mL的浓度范围时，该微生物复合菌剂对石油烃的降解效果和降解速率均降低，达不到快速降解的要求，增加工艺成本。当四种菌株的浓度部分或者全部大于10⁷-10⁹cfu/mL的浓度范围时，微生物复合菌剂在降解石油烃的过程中会引入过多的杂质，从而导致含有石油烃的污水的COD含量增加。

以下将对上述微生物复合菌剂的制备方法做进一步说明，微生物复合菌剂的制备方法包括：

S1、第一次活化培养

具体地，第一次活化培养是将柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌分别接种于活化菌株液体培养基(液体HLB)中进行培养，即将-70℃保存的上述四种菌株的甘油管菌种分别接种于装有2-5mL活化菌株液体培养基的15mL培养管中，将培养管置于20-28℃、180-220r/min的振荡摇床中培养48-120小时。

其中，活化菌株液体培养基包括胰蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L和氯化钠25-35g/L以及去离子水；PH值为6-7.5。

S2、第二次活化培养

第二次活化培养是将经过第一次活化培养得到的菌液分别接种于活化菌株固体培养基(固体HLB)中进行培养，即将经过第一次活化培养得到的菌液划线于活化菌株固体培养基中置于20-28℃恒温培养箱中复壮培养24-96h。

其中，活化菌株固体培养基包括胰蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L、氯化钠5-35g/L和琼脂粉1.2-2.0g/L以及去离子水；PH值为6-7.5。

通过上述第一次活化培养和第二次活化培养大大地提高了四种菌株的活性和繁殖能力，使得其能够具有更好的生物性能。此外，上述选取的活化菌株液体培养基和活化菌株固体培养基的组分以及配比，能够更好地为四种菌种的活化提供营养，以达到最好的活化效果。

S3、过夜培养。

具体地，将第二次活化培养后的平板上的菌落各自接种于装有2-5mL液体HLB的15mL培养管置于20-28℃、180-200r/min的振荡摇床中过夜培养。进一步将菌液进行过夜培养使得菌株能够很好地达到对数期，从而具有很好的生物性能。

S4、种子液培养

在将柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌接种于菌剂培养基进行共同培养之前，先将过夜培养后的四种菌液分别均以1％的接种量接种于种子液培养基进行种子液培养，分别得到柴油食烷菌种子液、海绵假单胞菌种子液、威尼斯不动杆菌种子液以及除烃海杆菌种子液。进一步地，种子液培养基的起始pH为6.0-8.0，培养在20-28℃、180-200r/min的振荡摇床中的条件下进行，培养时间为12-16h。将培养后获得的柴油食烷菌种子液、海绵假单胞菌种子液、威尼斯不动杆菌种子液以及除烃海杆菌种子液在5000-8000转/分下离心3-6分钟分别收集柴油食烷菌菌体、海绵假单胞菌菌体、威尼斯不动杆菌菌体以及除烃海杆菌菌体。

其中，种子液培养基包括二水合柠檬酸钠15-25g/L、氯化铵0.8-1.5g/L、三水合磷酸氢二钾0.2-0.8g/L、磷酸二氢钾0.1-0.4g/L以及人工合成海水。种子液培养基中的人工合成海水的成分与0821号培养基中的人工合成海水的成分相同，使得柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌在种子液的培养中能够更加适应特有的海洋环境，以最终使得制备得到的微生物复合菌剂能够更好地降解受石油污染海水中的石油烃。

其次，将获得的柴油食烷菌菌体、海绵假单胞菌菌体、威尼斯不动杆菌菌体以及除烃海杆菌菌体按0.5-2％接种量重悬入菌剂培养基置于20-28℃、180-200r/min的振荡摇床中进行共同培养8-13h，使得柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌在微生物复合菌剂的浓度各自都在10⁷-10⁹cfu/mL范围内。

较佳地，菌剂培养基包括二水合柠檬酸钠15-25g/L、氯化铵0.8-1.5g/L、三水合磷酸氢二钾0.2-0.8g/L、磷酸二氢钾0.1-0.4g/L以及人工合成海水。菌剂培养基中的人工合成海水的成分与除烃海杆菌培养基中的人工合成海水的成分相同，从而使得柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌能够共同在特有的海洋环境中进行生长，以最终使得制备得到的微生物复合菌剂能够更好地适应海水环境，进而能够更好地针对受石油污染的海水中的石油烃进行降解。

需要说明的是，微生物复合菌剂的制备方法并不限于上述步骤，也可以直接将柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌不经过活化培养或过夜培养等，也能够在一定程度上达到对石油烃进行降解的效果。上述微生物复合菌剂的制备过程中，菌株的活化和种子液的培养等可以根据实际的需要进行步骤的删减和调整。

本发明实施例还提供了上述微生物复合菌剂在降解石油烃的应用。上述微生物复合菌剂特别适用于降解石油烃中的芳香烃、直链烷烃和支链烷烃。

本发明实施例还提供了微生物复合菌剂在降解污水中的石油烃的应用。上述微生物复合菌剂特别适用于降解受石油污染的海水。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

首先，将-70℃保存的获取于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)的保藏登记号为1A00001的柴油食烷菌、保藏登记号为1A00102的海绵假单胞菌、保藏登记号为1A00294的威尼斯不动杆菌以及保藏登记号为1A03971的除烃海杆菌的甘油管菌种分别接种于装有5mL液体HLB的15mL培养管中，将培养管置于28℃、220r/min的振荡摇床中培养120小时。然后，将得到的菌液划线于活化菌株固体培养基中置于28℃恒温培养箱中复壮培养96h，将平板上的菌落各自接种于装有5mL液体HLB的15mL培养管置于28℃、200r/min的振荡摇床中过夜培养。

其次，将过夜培养后得到的菌液分别均以1％的接种量接种于起始pH为8.0的种子液培养基中，置于28℃、200r/min的振荡摇床中培养16h，将培养后获得的各种子液在8000转/分下离心6分钟收集菌体。然后，将柴油食烷菌菌体、海绵假单胞菌菌体、威尼斯不动杆菌菌体以及除烃海杆菌菌体均按2％接种量共同重悬入菌剂培养基中，置于28℃、200r/min的振荡摇床中培养13h，得到微生物复合菌剂。该微生物复合菌剂中，柴油食烷菌的浓度8.765×10⁸cfu/mL；海绵假单胞菌的浓度8.338×10⁸cfu/mL；威尼斯不动杆菌的浓度8.956×10⁸cfu/mL；除烃海杆菌的浓度8.114×10⁸cfu/mL。

其中，液体HLB包括胰蛋白胨12g/L、酵母提取物6g/L和氯化钠35g/L以及去离子水，PH值为7.5；活化菌株固体培养基包括胰蛋白胨12g/L、酵母提取物6g/L、氯化钠35g/L和琼脂粉2.0g/L以及去离子水，PH值为7.5；种子液培养基包括二水合柠檬酸钠25g/L、氯化铵1.5g/L、三水合磷酸氢二钾0.8g/L、磷酸二氢钾0.4g/L以及人工合成海水；菌剂培养基包括二水合柠檬酸钠25g/L、氯化铵1.4g/L、三水合磷酸氢二钾0.7g/L、磷酸二氢钾0.4g/L以及人工合成海水。

进一步，人工合成海水为：氯化钠28g/L、六水硫酸镁14g/L、硫酸钠5g/L、六水氯化钙3g/L、氯化钾1.0g/L、溴化钾0.2g/L、硼酸0.05g/L、九水硅酸钠8mg/L、六水氯化锶0.08g/L、氟化钠5mg/L、硝酸铵6mg/L、磷酸铁1.5mg/L；溶剂为去离子水；pH为7.8。

实施例2

首先，将-70℃保存的获取于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)的保藏登记号为1A00001的柴油食烷菌、保藏登记号为1A00102的海绵假单胞菌、保藏登记号为1A00294的威尼斯不动杆菌以及保藏登记号为1A03971的除烃海杆菌的甘油管菌种分别接种于装有2mL液体HLB的15mL培养管中，将培养管置于20℃、180r/min的振荡摇床中培养48小时。然后，将得到的菌液划线于活化菌株固体培养基中置于20℃恒温培养箱中复壮培养24h，将平板上的菌落各自接种于装有2mL液体HLB的15mL培养管置于20℃、180r/min的振荡摇床中过夜培养。

其次，将过夜培养后得到的菌液分别均以1％的接种量接种于起始pH为6.0的种子液培养基中，置于20℃、180r/min的振荡摇床中培养12h，将培养后获得的各种子液在5000转/分下离心3分钟收集菌体。然后，将柴油食烷菌菌体、海绵假单胞菌菌体、威尼斯不动杆菌菌体以及除烃海杆菌菌体均按0.5％接种量共同重悬入菌剂培养基中，置于20℃、180r/min的振荡摇床中培养8h，得到微生物复合菌剂。该微生物复合菌剂中，柴油食烷菌的浓度7.765×10⁷cfu/mL；海绵假单胞菌的浓度8.338×10⁷cfu/mL；威尼斯不动杆菌的浓度5.954×10⁷cfu/mL；除烃海杆菌的浓度3.513×10⁷cfu/mL。

其中，液体HLB包括胰蛋白胨8g/L、酵母提取物4g/L和氯化钠25g/L以及去离子水，PH值为6；活化菌株固体培养基包括胰蛋白胨8g/L、酵母提取物4g/L、氯化钠5g/L和琼脂粉1.2g/L以及去离子水，PH值为6；种子液培养基包括二水合柠檬酸钠15g/L、氯化铵0.8g/L、三水合磷酸氢二钾0.2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L以及人工合成海水；菌剂培养基包括二水合柠檬酸钠15g/L、氯化铵0.9g/L、三水合磷酸氢二钾0.3g/L、磷酸二氢钾0.1g/L以及人工合成海水。

进一步，人工合成海水为：氯化钠20g/L、六水硫酸镁8g/L、硫酸钠3g/L、六水氯化钙1g/L、氯化钾0.5-1.0g/L、溴化钾0.05-0.2g/L、硼酸0.01g/L、九水硅酸钠4mg/L、六水氯化锶0.02g/L、氟化钠1mg/L、硝酸铵1mg/L、磷酸铁0.5mg/L；溶剂为去离子水；pH为6.8。

实施例3

首先，将-70℃保存的获取于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)的保藏登记号为1A00001的柴油食烷菌、保藏登记号为1A00102的海绵假单胞菌、保藏登记号为1A00294的威尼斯不动杆菌以及保藏登记号为1A03971的除烃海杆菌的甘油管菌种分别接种于装有4mL液体HLB的15mL培养管中，将培养管置于25℃、200r/min的振荡摇床中培养72小时。然后，将得到的菌液划线于活化菌株固体培养基中置于25℃恒温培养箱中复壮培养48h，将平板上的菌落各自接种于装有4mL液体HLB的15mL培养管置于25℃、190r/min的振荡摇床中过夜培养。

其次，将过夜培养后得到的菌液分别均以1％的接种量接种于起始pH为7.0的种子液培养基中，置于25℃、190r/min的振荡摇床中中培养15h，将培养后获得的各种子液在7000转/分下离心5分钟收集菌体。然后，将柴油食烷菌菌体、海绵假单胞菌菌体、威尼斯不动杆菌菌体以及除烃海杆菌菌体均按1％接种量共同重悬入菌剂培养基中，置于25℃、190r/min的振荡摇床中培养11h，得到微生物复合菌剂。该微生物复合菌剂中，柴油食烷菌的浓度1.724×10⁸cfu/mL；海绵假单胞菌的浓度8.988×10⁷cfu/mL；威尼斯不动杆菌的浓度2.954×10⁸cfu/mL；除烃海杆菌的浓度4.114×10⁸cfu/mL。

其中，液体HLB包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠30g/L以及去离子水，PH值为6.8；活化菌株固体培养基包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠20g/L和琼脂粉1.7g/L以及去离子水，PH值为6.5；种子液培养基包括二水合柠檬酸钠20g/L、氯化铵1.2g/L、三水合磷酸氢二钾0.6g/L、磷酸二氢钾0.2g/L以及人工合成海水；菌剂培养基包括二水合柠檬酸钠21g/L、氯化铵1.2g/L、三水合磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.2g/L以及人工合成海水。

进一步，人工合成海水为：氯化钠25g/L、六水硫酸镁12g/L、硫酸钠4g/L、六水氯化钙2g/L、氯化钾0.8g/L、溴化钾0.1g/L、硼酸0.03g/L、九水硅酸钠6mg/L、六水氯化锶0.05g/L、氟化钠4mg/L、硝酸铵4mg/L、磷酸铁1.1mg/L；溶剂为去离子水；pH为7。

实施例4

首先，将-70℃保存的获取于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)的保藏登记号为1A00001的柴油食烷菌、保藏登记号为1A00102的海绵假单胞菌、保藏登记号为1A00294的威尼斯不动杆菌以及保藏登记号为1A03971的除烃海杆菌的甘油管菌种分别接种于装有3mL液体HLB的15mL培养管中，将培养管置于24℃、190r/min的振荡摇床中培养100小时。然后，将得到的菌液划线于活化菌株固体培养基中置于24℃恒温培养箱中复壮培养68h，将平板上的菌落各自接种于装有3mL液体HLB的15mL培养管置于26℃、188r/min的振荡摇床中过夜培养。

其次，将过夜培养后得到的菌液分别均以1％的接种量接种于起始pH为6.8的种子液培养基中，置于24℃、195r/min的振荡摇床中培养13h，将培养后获得的各种子液在6000转/分下离心5分钟收集菌体。然后，将柴油食烷菌菌体、海绵假单胞菌菌体、威尼斯不动杆菌菌体以及除烃海杆菌菌体均按1.5％接种量共同重悬入菌剂培养基中，置于25℃、185r/min的振荡摇床中培养10h，从而得到微生物复合菌剂。该微生物复合菌剂中，柴油食烷菌的浓度1.765×10⁸cfu/mL；海绵假单胞菌的浓度9.318×10⁷cfu/mL；威尼斯不动杆菌的浓度2.954×10⁸cfu/mL；除烃海杆菌的浓度5.758×10⁷cfu/mL。

其中，液体HLB包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠28g/L以及去离子水，PH值为7.2；活化菌株固体培养基包括胰蛋白胨9g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠15g/L和琼脂粉1.6g/L以及去离子水，PH值为6.7；种子液培养基包括二水合柠檬酸钠19g/L、氯化铵1.3g/L、三水合磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.3g/L以及人工合成海水；菌剂培养基包括二水合柠檬酸钠18g/L、氯化铵1.1g/L、三水合磷酸氢二钾0.7g/L、磷酸二氢钾0.2g/L以及人工合成海水。

进一步，人工合成海水为：氯化钠23g/L、六水硫酸镁12g/L、硫酸钠4g/L、六水氯化钙2g/L、氯化钾0.8g/L、溴化钾0.13g/L、硼酸0.02g/L、九水硅酸钠6mg/L、六水氯化锶0.05g/L、氟化钠3mg/L、硝酸铵4mg/L、磷酸铁1.1mg/L；溶剂为去离子水；pH为7.2。

试验例

分别将实施例4中得到的各菌株的种子液以及获得的微生物复合菌剂分别以1％转接量接入菌剂处理实验培养基，置于20-28℃、180-200r/min的振荡摇床中单独培养3天。从0h开始，每24小时取一次样，以有机溶剂萃取后进行GC-MS对被降解物质定性分析，并测定相对剩余油量，得到降解率。其中GC-MS条件为：气相色谱(Agilent 7890A)；质谱检测器(Agilent HP5975C)；色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样温度和检测温度分别是300，230℃，进样量1ul，采取不分流进样，辅助加热区、四级杆温度分别为280，150℃，载气为氮气，流速为1ml/min。升温程序：60℃保持1min，以5℃/min速度升温至300℃保持20min。MS采用全扫描，扫描范围(m/z)为40-600。

其中，菌剂处理实验培养基(简称为D)：氯化铵1.2g/L、二水合柠檬酸钠4g/L、0#柴油1.1％(v/v)、三水合磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.3g/L以及人工合成海水。其中，人工合成海水的成分与实施例3中的人工合成海水的成分相同。

通过GC-MS对上述5种情况进行处理的菌剂处理实验培养基内被降解物质定性分析，并测定菌剂处理实验培养基内相对剩余油量后做出图1-图15。

图1-图4依次表示了将实施例4中的柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌、除烃海杆菌对应的种子液单独处理含油的菌剂处理实验培养基3天的直链烃的相对剩余量的变化趋势。图5表示了将实施例4中获得的微生物复合菌剂处理含油的菌剂处理实验培养基3天的直链烃的相对剩余量的变化趋势。其中，图1-图5中的1-13为C11-C24不含C23的13种直链烃。

参见图1-图5可以看出，经过三天处理的含油的菌剂处理实验培养基中，柴油食烷菌对13种直链烃的去除率平均达到80％以上；海绵假单胞菌对13种直链烃的去除率平均达到85％以上；威尼斯不动杆菌对13种直链烃的去除率平均达到90％以上，但接菌24后对13种直链烃的去除率平均不到40％；除烃海杆菌对13种直链烃的去除率平均达到80％以上；微生物复合菌剂对13种直链烃的去除率平均达到95％以上。相对四种菌株单独作用于石油烃，微生物复合菌剂对13种直链烃的去除率大于四种菌株单独作用时的去除率，并且微生物复合菌剂在接菌24小时后对13种直链烃的去除率平均达到95％以上，从而微生物复合菌剂相对四种菌株单独作用时，其对直链烃的降解效率更快。从而微生物复合菌剂在降解石油烃的应用上，相对于四种菌种单独应用在降解石油烃时，在降解石油烃中的直链烃方面具有更好的去除率和降解效率，进而微生物复合菌剂在降解污水中的石油烃方面可以得到很好的应用，并进一步地应用于受石油污染的污水中。

图6-图9依次表示了将实施例4中的柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌、除烃海杆菌对应的种子液单独处理含油的菌剂处理实验培养基3天的支链烃的相对剩余量的变化趋势。图10表示了将实施例4中获得的微生物复合菌剂处理含油的菌剂处理实验培养基3天的支链烃的相对剩余量的变化趋势。图6-图10中的1和2分别为C15和C19的两种支链烃。

参见图6-图10可以看出，经过三天处理的含油的菌剂处理实验培养基中，柴油食烷菌对2种支链烃的去除率平均达到80％以上；海绵假单胞菌对2种支链烃的去除率平均达到90％以上；威尼斯不动杆菌对2种支链烃的去除率平均达到90％以上；除烃海杆菌对2种支链烃的去除率平均达到80％以上；微生物复合菌剂对2种支链烃的去除率平均达到95％以上。相对四种菌株单独作用于石油烃，微生物复合菌剂对2种支链烃的去除率大于四种菌株单独作用时的去除率，并且微生物复合菌剂在接菌24小时后对2种支链烃的去除率平均达到95％以上，从而微生物复合菌剂相对四种菌株单独作用时，其对支链烃的降解效率也更快。从而微生物复合菌剂在降解石油烃的应用上，相对于四种菌种单独应用在降解石油烃时，在降解石油烃中的支链烃方面具有更好的去除率和降解效率，进而微生物复合菌剂在降解污水中的石油烃方面可以得到很好的应用，并进一步地应用于受石油污染的污水中。

图11图14依次表示了将实施例4中的柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌、除烃海杆菌对应的种子液单独处理含油的菌剂处理实验培养基3天的芳香烃的相对剩余量的变化趋势。图15表示了将实施例4中获得的微生物复合菌剂处理含油的菌剂处理实验培养基3天的芳香烃的相对剩余量的变化趋势。图11-图15中的1-12为C9-C12的9种芳香烃。

参见图11-图15可以看出，经过三天处理的含油的菌剂处理实验培养基中，柴油食烷菌对12种芳香烃的去除率平均达到80％以上；海绵假单胞菌对12种芳香烃的去除率平均达到80％以上；威尼斯不动杆菌最终对12种芳香烃的去除率平均达到82％以上，但是接菌24小时后对12种芳香烃的去除率仅平均不到20％；除烃海杆菌对12种芳香烃的去除率平均达到80％以上，但接菌48小时后对12种芳香烃的去除率平均不到70％；微生物复合菌剂对12种芳香烃的去除率平均达到98％以上。相对四种菌株单独作用于石油烃，微生物复合菌剂对12种芳香烃的去除率远远大于四种菌株单独作用时的去除率，并且微生物复合菌剂在接菌24小时后对2种芳香烃的去除率平均达到95％以上，从而微生物复合菌剂相对四种菌株单独作用时，其对芳香烃的降解效率也更快。从而微生物复合菌剂在降解石油烃的应用上，相对于四种菌种单独应用在降解石油烃时，在降解石油烃中的芳香烃方面具有更好的去除率和降解效率，进而微生物复合菌剂在降解污水中的石油烃方面可以得到很好的应用，并进一步地应用于受石油污染的污水中。

由上述分析可以得出，微生物复合菌剂处理各种烃类效果优于任何单菌株，对链烃的去除率可达95％以上，对芳香烃的去除高达98％以上，并且降解效率远远高于单菌株作用时的降解效率。从而微生物复合菌剂在降解石油烃的应用上，相对于四种菌种单独应用在降解石油烃时，在降解石油烃中的链烃和芳香烃方面均具有更好的去除率和降解效率，进而微生物复合菌剂在降解污水中的石油烃方面可以得到很好的应用，并进一步地应用于受石油污染的污水中。

综上所述，微生物复合菌剂中的四种微生物主体柴油食烷菌、海绵假单胞菌、威尼斯不动杆菌以及除烃海杆菌之间能够相互协同，且能够相互提高在海水中的生存能力，使得彼此在海水中的稳定性能更好，进而达到能够更加全面高效地降解石油烃中大量存在的直链烃、支链烃及芳香烃的效果。此外，该微生物菌剂制备过程简单，设备需求简要，操作简易，需要的环境条件温和，适于工业推广和应用；其在降解石油烃方面的应用能够有效地解决海洋石油污染的环境问题，在促进中国石油行业的发展、环保技术的革新、打破行业技术壁垒具有重要的研究价值和巨大市场应用前景。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。