一株西瓜雌性突变株及西瓜雌性系的检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株西瓜雌性突变株及西瓜雌性系的检测方法。

背景技术：

西瓜(Citrullus lanatus)为葫芦科黄瓜属一年生蔓生草本植物，是一种国内外广泛栽培的重要经济作物。我国自汉代以来就有种植西瓜的历史，是世界上最早栽培西瓜的国家之一，也是目前世界上西瓜栽培面积最大、产量最高的国家。

葫芦科作物具有被子植物中的全部性型，是植物性别分化机理研究的模式作物，其中黄瓜及甜瓜性别决定机理研究比较清楚，而在西瓜中的研究比较滞后。西瓜植株的性型有：雌雄异花同株、雄花完全花同株(雄完株系)、雌性系和完全花系。前人的研究表明黄瓜及甜瓜雌性系产生是由于一个C2H2类的转录因子ClWIP1的突变产生的。而西瓜雌性系是一种极为罕见的性型，目前仅有我国报道发现了西瓜雌性系自然突变体XHBFGM。它是雌雄异花同株性型材料XHBMB自然变异所得的。雌性系在育种中具有相当大的作用，它有利于降低育种人工成本、提高种子纯度，具有很高的经济价值。故开展西瓜雌性系控制基因研究具有相当大的理论和实践意义。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测西瓜性型的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测西瓜性型的方法是检测待测西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否发生缺失，

若待测西瓜ClWIP1基因的两条同源染色体的第656-664位均没有发生缺失或两条同源染色体中的一条同源染色体的第656-664位发生缺失，且另一条没有发生缺失，则待测西瓜为或候选为雌雄异花同株西瓜品种；

若待测西瓜ClWIP1基因的两条同源染色体的第656-664位均发生缺失，则待测西瓜为或候选为雌性系西瓜品种。

上述方法中，所述检测待测西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否发生缺失的方法为(1)或(2)：

(1)直接测序西瓜个体的基因组DNA；

(2)测序含有ClWIP1基因的第656-664位的PCR扩增产物；根据PCR扩增产物鉴定或辅助鉴定待测西瓜性型的方法：

若PCR扩增产物含有DNA片段甲，则待测西瓜为或候选为雌雄异花同株西瓜品种；

若PCR扩增产物仅含有DNA片段乙，则待测西瓜为或候选为雌雄异花同株西瓜品种；

所述PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：

1)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的引物对A；

2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；

所述序列A为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸；

所述DNA片段甲的核苷酸序列为序列5；

所述DNA片段乙的核苷酸序列为序列6。

本发明的第二个目的是检测待测西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否发生缺失的物质的新用途。

本发明提供了检测待测西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否发生缺失的物质在如下(a1)-(a6)中至少一种中的应用：

(a1)鉴定或辅助鉴定待测西瓜性型；

(a2)制备鉴定或辅助鉴定待测西瓜性型的产品；

(a3)鉴定或辅助鉴定待测西瓜为雌雄异花同株西瓜品种还是雌性系西瓜品种；

(a4)制备鉴定或辅助鉴定待测西瓜为雌雄异花同株西瓜品种还是雌性系西瓜品种的产品；

(a5)选育雌性系西瓜品种；

(a6)选育雌雄异花同株西瓜品种。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测西瓜性型的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测西瓜性型的产品是检测待测西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否发生缺失的物质。

上述应用或上述产品中，所述检测待测西瓜ClWIP1基因的第656-664位是否发生缺失的物质为如下1)或2)：

1)由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成的引物对A；

2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；

所述序列A为将序列3删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；

所述序列B为将序列4删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸。

本发明的第四个目的是提供一种选育雌性系西瓜品种的方法。

本发明提供的选育雌性系西瓜品种的方法是选育ClWIP1基因的两条同源染色体的第656-664位均发生缺失的西瓜。

本发明的第五个目的是提供一种选育雌雄异花同株西瓜品种的方法。

本发明提供的选育雌雄异花同株西瓜品种的方法是选育ClWIP1基因的两条同源染色体的第656-664位均没有发生缺失或两条同源染色体中的一条同源染色体的第656-664位发生缺失，且另一条没有发生缺失的西瓜。

本发明的第六个目的是提供一种雌性系西瓜的培育方法。

本发明提供的雌性系西瓜的培育方法为使西瓜ClWIP1基因的两条同源染色体的第656-664位均发生缺失，得到雌性系西瓜。

本发明的最后一个目的是提供上述方法获得的雌性系西瓜的新用途。

本发明提供了上述雌性系西瓜在如下(b1)-(b3)中任一种中的应用：

(b1)西瓜育种；

(b2)降低西瓜育种人工成本；

(b3)提高西瓜种子纯度。

上述方法或上述应用或上述产品中，

所述雌雄异花同株西瓜为同一株上同时着生雌花及雄花的西瓜；

所述雌性系西瓜为同一株上25节位以下全部着生雌花的西瓜。

上述方法或上述应用或上述产品中，

所述ClWIP1基因的第656-664位为自ClWIP1基因起始密码子起的第656-664位，也即为西瓜基因组2号染色体的第33348744-33348752位。

本发明在长期的育种实践中发现了一株西瓜雌性系突变体TGS409，是来源于雌雄异花同株性型材料TS409的自然变异。通过比较全基因组重测序信息及对后代分离群体验证，发现ClWIP1基因中9个碱基的缺失突变导致了TGS409雌性株表型的出现，并基于获得的InDel差异位点设计了可以方便检测含有ClWIP1缺失突变位点的分子标记。通过实验证明：本发明的分子标记可迅速检测以TGS409为转育材料的西瓜雌性系表型，对西瓜雌性系TGS409中突变后的ClWIP1基因进行鉴定，可用于后代转育西瓜雌性株育种材料，大大降低了西瓜制种成本、提高了种子纯度。

附图说明

图1为西瓜雌性系基因ClWIP1的DNA全长在正常野生型的雌雄异花同株材料及TGS409雌性系突变体的序列差异比对图。

图2为引物gy-IF和引物gy-IR对亲本及F2群体的PCR扩增图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、西瓜雌性系突变体TGS409及分子标记的获得

一、西瓜雌性系突变体TGS409的发现与保藏

本发明在长期的育种实践中发现了一株西瓜雌性系突变体TGS409，是来源于雌雄异花同株性型材料TS409的自然变异。通过比较全基因组重测序信息及对后代分离群体验证，发现ClWIP1基因第656-664位存在9个碱基的缺失突变导致了TGS409雌性株表型的出现。

西瓜雌性系突变体TGS409于2016年09月01日保藏于北京农作物种质资源库(http://www.bvrc.com.cn:6041/GR_Program/Web/)，保藏编号为西瓜No.32129。

二、分子标记的获得及初步验证

1、供试材料选取

(1)供试体材料包括：野生型TS409(雌雄异花同株)和验证群体；验证群体为父本卡红Calhum Gray(http://www.bvrc.com.cn:6041/GR_Program/Web/)，保藏编号为西瓜No.21414)和母本TGS409(雌性系性型，gygy)为亲本进行杂交，获取F₁代群体及F2代群体。

(2)群体单株的性型鉴定

对234个单株组成的F₁代及F2代群体的性型进行鉴定，其中，雌雄异花同株西瓜为同一株上同时着生雌花及雄花的西瓜；雌性系西瓜为同一株上25节位以下全部着生雌花的西瓜。

鉴定结果表明：F1群体单株均为典型雌雄异花同株性型，F2群体中有178株雌雄异花同株性型单株和56株雌性系性型单株，经卡方检测符合3：1分离比率。故西瓜TGS409中的雌性系性型是受隐性单基因控制。

2、基因组DNA的提取

将步骤1中的供试材料分别进行DNA提取处理，得到供试材料基因组DNA；DNA提取处理为参照Murry等(1980)的方法(Murray M,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980,8:668-673.)的基础上改进而成；具体步骤如下：

a.取1.5克叶片，在液氮中研磨成粉末，再加入9ml 2％CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巯基乙醇)，混匀，于65℃水浴1小时，得到混合物A；

b.将混合物A停止水浴，加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液，混匀，冰浴20分钟；再加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)抽提两次，得到上清液A；

c.向上清液A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA；再用洗涤缓冲液(76％乙醇，10mM乙酸铵)洗涤一次，吹干，再加TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)溶解，得到溶液A；

d.向溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100μg/ml，再混匀37℃水浴1小时；再用等体积氯仿/异戊醇(24：1)抽提一次，得到上清液B；

e.向上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀；

f.用70％乙醇洗涤DNA沉淀，吹干，加适量ddH₂O溶解DNA，得到供试材料基因组DNA；

再用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以OD₂₆₀值测定供试材料基因组DNA的浓度，再用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测供试材料基因组DNA的提取质量；

3、InDel位点的发现

根据西瓜全基因组信息，设计全长引物对西瓜雌性系突变体TGS409及野生株TS409的ClWIP1基因进行序列比对，获取TGS409及TS409间的InDel位点，根据ClWIP1基因全长测序结果，对西瓜雌性系材料TGS409及雄花完全花材料TS409进行全基因组序列比对，发现TGS409与TS409间的InDel位点，并设计特异性引物。PCR扩增反应选用的多态性标记引物由上海生工公司北京合成部合成。具体步骤如下：

分别以西瓜雌性系突变体TGS409和野生型TS409(雌雄异花同株)为模板，采用上游序列gy-F和下游序列gy-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即ClWIP1基因序列；

ClWIP1全长序列扩增引物：

上游序列gy-F为：5’-ATGACTGATCCTTACCCCATCAAC-3’(序列1)；

下游序列gy-R为：5’-TCATGTTTCAATCTCAGAAGCTGG-3’(序列2)。

PCR扩增反应的反应体系(50μL)：5μL 10×TransStart Taq Buffer；5μL浓度为2.5mM的dNTPs；2U TransStart Taq DNA Polymerase DNA聚合酶；2μL 10mM上游引物，2μL 10mM下游引物；20ng模板DNA；ddH₂O补足到50μL；其中，Taq DNA聚合酶、反应缓冲液及dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；

反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃30s，55℃30s，72℃1min30s，共38个循环；阶段3：72℃延伸10min；阶段5:4℃保存；其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler；

PCR扩增产物检测：取PCR扩增产物与载样缓冲液(6×Loading Buffer，北京全式金生物技术有限公司)混匀，再加入1.2％的琼脂糖凝胶中，180V/90A进样，90V/100A电泳；其中，琼脂糖为：Agarose RA(购自amresco公司)；缓冲液为：1×TAE缓冲液；电泳仪为购自JINGYI公司的JY600电泳仪；针对目的条带送由北京市诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。

测序结果表明：野生型TS409(雌雄异花同株)PCR扩增得到大小为2834bp的条带，突变体TGS409(雌性系)PCR扩增得到大小为2825bp的条带，PCR扩增产物的比对结果如图1所示。从图中可以看出：和野生型TS409(雌雄异花同株)相比，西瓜雌性系突变体TGS409中ClWIP1基因第656-664位(也即为西瓜基因组2号染色体的第33348744-33348752位，西瓜全基因序列信息来源于西瓜基因组信息网站，网站为http://www.icugi.org)存在9个碱基的缺失，进而导致表现为雌性系。

4、InDel引物的设计及初步验证

(1)InDel引物的设计

根据TGS409及TS409间的InDel位点，设计特异性引物用于ClWIP1基因的缺失分析，ClWIP1基因特异InDel扩增引物序列如下：

上游序列gy-IF为：5’-GATGATCATCATCAATTAGAAG-3’(序列3)；

下游序列gy-IR为：5’-GAATCAAAAAGGTGATGAACAC-3’(序列4)。

(2)InDel引物的初步验证

分别以突变体TGS409(雌性系)和野生型TS409(雌雄异花同株)为模板，采用上游序列gy-IF和下游序列gy-IR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增反应的反应体系(13μL)：1.3μL含15mM MgCl₂的10×EasyTaq PCR Buffer；0.8μL浓度为2.5mM的dNTPs；0.4U long PCR Taq DNA聚合酶；0.5μL 10mM上游引物，0.5μL 10mM下游引物；20ng模板DNA；ddH₂O补足到13μL；其中，Taq DNA聚合酶、反应缓冲液及dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；

反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃15s，55℃20s，72℃30s，共34个循环；阶段3：72℃延伸4min；阶段5:4℃保存；其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler；

PCR扩增产物检测：取13μl PCR产物中加入3μl上样缓冲液(6×Loading Buffer)，移液器混匀后点入8％的聚丙烯酰胺凝胶中。140V/500mA电泳电泳1h 30min即可。其中，8％聚丙烯酰胺胶配方：dd H₂O 10mL、10×TBE 2mL、20％Acr-Bis 8mL、Temed、20μL、10％APS 200μL。

测序结果表明：野生型TS409(雌雄异花同株)PCR扩增得到大小为263bp的条带，其核苷酸序列如序列5所示；突变体TGS409(雌性系)PCR扩增得到大小为254bp的条带，其核苷酸序列如序列6所示。上述引物扩增结果与信息学分析结果相同，即包含ClWIP1基因DNA全部序列的片段的单株为雌雄异花同株，而ClWIP1基因的第656-664位缺失的单株表现为雌性系。下面通过F1和F2群体进行验证。

三、分子标记的群体验证

以F2代群体为实验材料，采用引物gy-IF和gy-IR进行单株PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增方法和PCR产物检测方法均参照步骤4中的(2)。

检测结果表明：F2群体中178株雌雄异花同株性型的单株的扩增产物均含有大小为263bp的条带，核苷酸序列均如序列5所示；F2群体中56株雌性系性型的单株的扩增产物均仅含有大小为254bp的条带，核苷酸序列均如序列6所示，部分材料的扩增结果如图2所示。上述结果表明：基因型与表型的吻合率为100％。该结果显示，在TGS409雌性系性中ClWIP1基因的第656-664位发生9个碱基的缺失是导致雌性系产生的分子基础。因此可以根据ClWIP1基因的第656-664位是否发生9个碱基的缺失判断待测西瓜的性型：

若待测西瓜ClWIP1基因的两条同源染色体的第656-664位均没有发生缺失或两条同源染色体中的一条同源染色体的第656-664位发生缺失，且另一条没有发生缺失，则待测西瓜为或候选为雌雄异花同株西瓜品种；

若待测西瓜ClWIP1基因的两条同源染色体的第656-664位均发生缺失，则待测西瓜为或候选为雌性系西瓜品种。

序列表

<110> 北京市农林科学院 京研益农（北京）种业科技有限公司

<120> 一株西瓜雌性突变株及西瓜雌性系的检测方法

<160> 6

<210> 1

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atgactgatc cttaccccat caac 24

<210> 2

<211> 24bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

tcatgtttca atctcagaag ctgg 24

<210> 3

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gatgatcatc atcaattaga ag 22

<210> 4

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

gaatcaaaaa ggtgatgaac ac 22

<210> 5

<211> 263bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gatgatcatc atcaattaga agatcaagtt cctaatccta attattcttc ttctaattcc 60

aatattatta ctagtgctgc tactactact actggactta ataagggtca atattggatt 120

ccaactcctg ctcagattct tattggtcca actcagtttt cttgccctct ttgcttcaag 180

actttcaata gatacaacaa catgcaggta tttattttat tttttattct tcaatcttaa 240

tgtgttcatc acctttttga ttc 263

<210> 6

<211> 254bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

gatgatcatc atcaattaga agatcaagtt cctaatccta attattcttc ttctaattcc 60

aatattatta ctagtgctgc tactactact actggactta ataagggtca atattggatt 120

ccaactcctg ctcagattct tattggtcca actcagtttt cttgccctct ttgcttcaag 180

actttcaata acatgcaggt atttatttta ttttttattc ttcaatctta atgtgttcat 240

cacctttttg attc 254