一种样本直接加入的HCMVDNA一步法测定试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种样本直接加入的hcmvdna一步法测定试剂盒。

背景技术：

巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)亦属于疱疹病毒可，cmv感染在我国广泛流行。研究显示1-14岁儿童感染率可高达83％以上，其中婴儿期发病率最高。cmv病毒的感染率高，与多种疾病的发生发展密不可分，常见的疾病有肝炎、特发性血小板减少性紫癜、器官移植后感染、造血干细胞移植后感染等。由于cmv感染率高，且与多种疾病密切相关，因此临床上急需要一种能准确对病毒量进行定值的方法，加快检测的效率使检测更为方便快捷。

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)是一种根据生物体内dna复制性质而设计的体外快速扩增特定dna序列的技术。pcr反应体系主要由核酸引物、4种dntps、dna聚合酶、模板dna和pcr反应缓冲液体系组成。自美国cetus公司人类遗传室karymullis及其同事于1985年发明聚合酶链式反应(pcr)以来，pcr技术及其衍生技术就被快速开发出来，并在多种核酸检测中得到了广泛的运用。尤其是病毒或其他病原体的检测，当知道待检病原某一特定基因片段时，即可利用特异性的引物对样品中微量的目标dna进行pcr扩增，使其达到检测量，通过适当的检测手段进行检测，即可确定病原体的存在与否。

实时荧光定量pcr技术，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用dna扩增过程中荧光信号的积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与普通的pcr相比。实时荧光定量pcr技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，实现了pcr的定量分析。目前，实时荧光定量pcr技术在医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究及临床检测中得到了广泛应用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供了一种样本直接加入的hcmvdna一步法测定试剂盒。

为了解决上述问题，本发明提供的方案为：

一种样本直接加入的hcmvdna一步法测定试剂盒，其特征在于试剂盒主要包括(1)预先包装在pcr扩增八联管中的核酸扩增试剂(包括cmv-pcr反应液和酶混合液)；(2)核酸释放剂；(3)定量校准品和质控品(包括临界阳性质控品、强阳性质控品及阴性质控品)。

在本发明中，发明人预先将核酸扩增试剂(包括cmv-pcr反应液和酶混合液)分装到pcr扩增八联管中，并用熔点低于42℃呈凝固状态的石蜡油封闭。在使用时将核酸释放剂加在凝固的石蜡油上方，与同时加入的检测样本、校准品、质控品充分反应。

所述的cmv-pcr的反应液中包括cmv的引物和探针及特异性内标的引物和探针，序列如下：

cmv-f：5’-tgccagggcggccaggtg-3’(seqidno：1)

cmv-r：5’-agaggacaccgacga-3’(seqidno：2)

cmv-probe：5’-hex-attccgacaacgaaatccacaatc-bhq1-3’(seqidno：3)

ic-f：5’-cagcgaaggccgaaaaga-3’(seqidno：4)

ic-r：5’-catccaacgaactcaccactgt-3’(seqidno：5)

ic-probe：5’-fam-agccatgcccttagtag-bhq2-3’(seqidno：6)

由上述cmv的引物及探针扩增出的dna序列为：tgccagggcggccaggtgaacacggccggattgtggatttcgttgtcggaatcctcgtcggtgtcctct(seqidno：7)；由上述内标(ic)的引物及探针扩增出的dna序列为：cagcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggactagcaaattgaggggggtagcaacagtggtgagttcgttggatg(seqidno：8)。其中，cmv及内标ic的5’端标记了不同的荧光探针报告集团，其中cmv的荧光探针报告集团为hex，猝灭集团为bhq1；内标(ic)的荧光探针报告集团为fam，猝灭集团为bhq2。

作为优选，cmv-pcr反应液引物、探针、tris碱、氯化镁、氯化钾和dntp。

作为优选，所述的扩增试剂(包括cmvpcr反应液和酶混合液)预先包被在pcr扩增管中，采用低于42℃呈凝固状态的石蜡油封闭。

作为优选，核酸释放剂的组成包括：0.2～0.4n氢氧化钠、0.3～0.6m氯化钾、0.01～0.05％n-月桂酰肌氨酸钠、5mmedta、0.3～0.6mtris-hcl和1～2％曲通x-100中的一种或多种。

作为优选，所述的核酸释放剂加在凝固石蜡油上方，与同时加入的检测样本、校准品、质控品充分反应。

作为优选，本发明所述方法包括以下步骤：

步骤1)将预先包装好核酸扩增试剂的pcr扩增管，置于干热器43℃复温1-2分钟，放置在室温冷却1分钟，使液体石蜡油凝固；

步骤2)去掉pcr扩增管上的覆盖膜，直接加入10μl核酸释放剂和20μl待测样品，盖好八联管盖、颠倒混匀3-5次，避光放置5-10分钟；。

步骤3)将pcr扩增管置于干热器72℃复温1-2分钟，倒置将管底液体轻轻弹下，使管底核酸释放剂和样本与底部pcr反应液彻底混匀；

步骤4)瞬间离心，直接进行荧光定量pcr；

步骤5)结果分析。根据试剂盒中配套的标准品的ct值，对待测样品中的病毒量进行准确定值。

作为优选，所述待测样品包括但不限于血清、血浆或尿液等，优选为血清或血浆。

本发明的有益效果为：

本发明为了实现高效、快捷的检测样本中cmv病毒含量，根据cmv病毒的基因组序列，设计了该病毒的特异性引物和探针。同时，为了监测实验过程是否得当，本发明还纳入了非质粒型内标，该内标选自非人源性病毒序列，不会对标本造成污染，且能稳定表达于整个实验过程。为了有效缩短实验进程，减少外界环境对实验造成的污染，本发明创造性的将核酸扩增试剂预先分装到pcr扩增八联管中，并用熔点低于42℃的石蜡油将其封闭在管底。在使用时只需加入核酸释放剂与待测样品即可。经实验证明，本方法不仅可以缩短实验进程，且能对样品中的cmv病毒进行准确定量。特异性引物可同时扩增待测样品或配置的标准品，都能精准特异的反应样品中的病毒含量，并互不发生干扰。

一种样本直接加入的ebvdna一步法测定试剂盒。作为优选，本发明试剂盒包括了cmv病毒的标准品，可用于绘制标准曲线，并对标本中的病毒含量进行准确定量。

附图说明

图1为本发明实施例1的方法检测cmvdna的结果图；

图2为本发明实施例2的方法检测cmvdna的结果图；

图3为利用本发明方法检测cmvdna的敏感性结果图；

图4为利用本发明方法检测cmvdna的重复性结果图；

具体实施方式

本发明公开了一种样本直接加入的hcmvdna一步法测定试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本发明中使用的术语“核酸释放剂”又名“裂解液”，即“lysisbuffer”，是指为了使样品中的核酸游离在裂解体系中所需加入的一种配制液体。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实验材料与仪器

以下实施例中所用的pcr扩增仪器为上海宏石医疗科技有限公司生产的实时荧光定量pcr仪。待测样本采用经临床化验测定的cmvdna血清样品进行检测。

实施例1：cmv实时荧光定量pcr检测

将临床诊断明确且经过检测cmvdna定量值为1×10²iu/ml的患者血清样本按照如下步骤进行实时荧光定量pcr检测。

(1)cmv及内标特异性引物及探针的设计

用于检测cmv及内标(ic)的引物和探针序列如下：

cmv-f：5’-tgccagggcggccaggtg-3’(seqidno：1)

cmv-r：5’-agaggacaccgacga-3’(seqidno：2)

cmv-probe：5’-hex-attccgacaacgaaatccacaatc-bhq1-3’(seqidno：3)

ic-f：5’-cagcgaaggccgaaaaga-3’(seqidno：4)

ic-r：5’-catccaacgaactcaccactgt-3’(seqidno：5)

ic-probe：5’-fam-agccatgcccttagtag-bhq2-3’(seqidno：6)

由上述cmv的引物及探针扩增出的dna序列为：tgccagggcggccaggtgaacacggccggattgtggatttcgttgtcggaatcctcgtcggtgtcctct(seqidno：7)；由上述内标(ic)的引物及探针扩增出的dna序列为：cagcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggactagcaaattgaggggggtagcaacagtggtgagttcgttggatg(seqidno：8)。其中，cmv及内标ic的5’端标记了不同的荧光探针报告集团，其中cmv的荧光探针报告集团为hex，猝灭集团为bhq1；内标(ic)的荧光探针报告集团为fam，猝灭集团为bhq2。

(2)病毒核酸的提取及实时荧光定量pcr

步骤1)将预先包装好核酸扩增试剂的pcr扩增管，置于干热器43℃复温1-2分钟，放置在室温冷却1分钟，使液体石蜡油凝固；

步骤2)去掉pcr扩增管上的覆盖膜，直接加入10μl核酸释放剂和20μl待测样品，盖好八联管盖、颠倒混匀3-5次，避光放置5-10分钟；。

步骤3)将pcr扩增管置于干热器72℃复温1-2分钟，倒置将管底液体轻轻弹下，使管底核酸释放剂和样本与底部pcr反应液彻底混匀；

步骤4)瞬间离心，直接进行荧光定量pcr；

步骤5)结果分析。根据试剂盒中配套的标准品的ct值，对待测样品中的病毒量进行准确定值。

其中，所述cmv-pcr反应液具体组成成分如下：pcrmastermix20ul，5umcmv-f0.5ul，5umcmv-r0.5ul，5umcmv-probe0.5ul，5umic-f0.5ul，5umic-r0.5ul，5umic-probe0.5ul及ddh2o5.5ul。

其中，所述pcrmastermix组成成分包括：500mmtris-hcl(ph8.0)、500mmkcl、15mmmgcl2及10mmdntps。

其中，所述核酸释放剂的组成包括：0.2n氢氧化钠、0.3m氯化钾、5mmedta、0.01％n-月桂酰肌氨酸钠、0.3tris-hcl和1％曲通x-100中的一种或多种。

(3)结果分析

实验结果如图1所示，结果表明，按照本实例的检测方法，可以有效准确检测出cmvdna定量值为1×i0²iu/ml的cmv患者血清标本。

实施例2：cmv实时荧光定量pcr检测

将临床诊断明确且经过检测cmvdna定量值为1×10²iu/ml的患者血清样本按照如下步骤进行实时荧光定量pcr检测。

(1)cmv及内标特异性引物及探针的设计

用于检测cmv及内标(ic)的引物和探针序列如下：

cmv-f：5’-tgccagggcggccaggtg-3’(seqidno：1)

cmv-r：5’-agaggacaccgacga-3’(seqidno：2)

cmv-probe：5’-hex-attccgacaacgaaatccacaatc-bhq1-3’(seqidno：3)

ic-f：5’-cagcgaaggccgaaaaga-3’(seqidno：4)

ic-r：5’-catccaacgaactcaccactgt-3’(seqidno：5)

ic-probe：5’-fam-agccatgcccttagtag-bhq2-3’(seqidno：6)

由上述cmv的引物及探针扩增出的dna序列为：tgccagggcggccaggtgaacacggccggattgtggatttcgttgtcggaatcctcgtcggtgtcctct(seqidno：7)；由上述内标(ic)的引物及探针扩增出的dna序列为：cagcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggactagcaaattgaggggggtagcaacagtggtgagttcgttggatg(seqidno：8)。其中，cmv及内标ic的5’端标记了不同的荧光探针报告集团，其中cmv的荧光探针报告集团为hex，猝灭集团为bhq1；内标(ic)的荧光探针报告集团为fam，猝灭集团为bhq2。

(2)病毒核酸的提取及实时荧光定量pcr

步骤1)将预先包装好核酸扩增试剂的pcr扩增管，置于干热器43℃复温1-2分钟，放置在室温冷却1分钟，使液体石蜡油凝固。

步骤2)去掉pcr扩增管上的覆盖膜，直接加入10μl核酸释放剂和20μl待测样品，盖好八联管盖、颠倒混匀3-5次，避光放置5-10分钟。

步骤3)将pcr扩增管置于干热器72℃复温1-2分钟，倒置将管底液体轻轻弹下，使管底核酸释放剂和样本与底部pcr反应液彻底混匀，

步骤4)瞬间离心，直接进行荧光定量pcr。其中荧光定量pcr反应程序为37℃，2min；95℃，15分钟；然后进行45～50循环的95℃，15秒钟和60℃，45秒钟；在60℃检测荧光信号。

步骤5)结果分析。根据试剂盒中配套的标准品的ct值，对待测样品中的病毒量进行准确定值。

其中，所述cmv-pcr反应液具体组成成分如下：pcrmastermix20ul，5umcmv-f0.5ul，5umcmv-r0.5ul，5umcmv-probe0.5ul，5umic-f0.5ul，5umic-r0.5ul，5umic-probe0.5ul及ddh2o5.5ul。

其中，所述pcrmastermix组成成分包括：500mmtris-hcl(ph8.0)、500mmkcl、15mmmgcl2及10mmdntps中的一种或多种。

其中，所述核酸释放剂的组成包括：0.4n氢氧化钠、0.6m氯化钾、5mmedta、0.05％n-月桂酰肌氨酸钠、0.6tris-hcl和2％曲通x-100中的一种或多种。

(3)结果分析

实验结果如图2所示，结果表明，按照本实例的检测方法，可以有效准确检测出cmvdna定量值为1×10²iu/ml的cmv患者血清标本。

实施例3：本发明实时荧光定量pcr检测的敏感性及内标稳定性测试

用cmvdna为阴性的血清样本作为稀释液，将临床诊断明确且经过检测cmvdna定量值为1×10⁶iu/ml的患者样本依次进行稀释，分别获得cmvdna浓度为50iu/ml、10²iu/ml、1×10³iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×10⁵iu/ml的样品。利用与实施例1相同的方法对上述样品进行实时荧光定量pcr检测，观察检测的敏感性。

实验结果如图3所示：从右至左的实性曲线依此代表浓度为50iu/ml、1×10²iu/ml、1×10³iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×10⁵iu/ml、1×10⁶iu/ml的样品。结果表明，本发明可检测出浓度范围在50iu/ml～1×10⁶iu/ml的cmvdna样品，同时表明本发明方法的灵敏度可低至50iu/ml。虚性曲线为内标，从低至高的各种cmv病毒浓度的内标的ct值均在30左右，说明内标稳定表达不受病毒浓度的影响。

实施例4：本发明实时荧光定量pcr检测的重复性测试及变异系数分析

用cmvdna为阴性的血清样本作为稀释液，将临床诊断明确且经过检测cmvdna定量值为1×10⁶iu/ml的cmv患者血清进行稀释，获得cmvdna浓度为50iu/ml、1×10²iu/ml、1×10³iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×10⁵iu/ml、1×10⁶iu/ml的样品。将其用于重复性测试。利用与实施例1相同的方法对上述样品分别进行3复孔检测。观察检测的重复性及变异系数。同时用市面上出售的cmv检测商品试剂盒对样品进行检测，比对两种方法的重复性及变异系数。

结果如图4和表1所示，图4为应用本发明对浓度为50iu/ml、1×10²iu/ml、1×10³iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×10⁵iu/ml、1×i0⁶iu/ml的样品进行重复性检查，如图4所示，其实验结果重复性良好，各浓度曲线基本在同一ct值处。另外，各浓度所对应的内标曲线，如图4虚线所示亦表达稳定，ct值在30左右。表1为将本发明及市面上出售的cmv检测试剂盒对1×10⁶iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×10²iu/ml各浓度标本进行3复孔重复检测，观察ct值并计算cv(％)。结果表明，本发明检测各浓度ct值均优于市面上出售的cmv检测试剂盒的各浓度ct值，各个浓度的变异度均低于市面上出售的cmv检测试剂盒的变异度。从而得出结论：本发明方法的检测重复性及变异系数优于市面上出售的cmv检测试剂盒。

表1cmvdna实时荧光定量pcr检测的重复性测试及变异系数分析结果

以上所述的市面上出售的cmv检测试剂盒适用于尿液、血清样本。其操作步骤如下：

(1)取100ul血清样本，加入等体积的浓缩液，12000rpm离心5min。

(2)弃上清，往沉淀中加入50ul核酸释放剂。

(3)用移液枪挑起沉淀吸打混匀。

(4)每个pcr反应管中加入上述处理的后的待测样本。

(5)静置10min后，每管加入pcr反应液40ul，吸打混匀后盖上管盖并2000rpm离心30s。

(6)pcr扩增。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。