本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种培养肝细胞的培养基及其制备方法。
背景技术：
肝脏作为人体中最重要的器官之一，承担着合成、分泌、代谢、解毒等多种复杂的功能。一旦由各种原因造成肝细胞的大量坏死，将会出现肝衰竭，导致机体代谢紊乱和毒性物质的堆积，而这反过来又加重了肝细胞的损伤，影响肝细胞的再生，进而形成肝衰竭的恶性循环。急性肝功能衰竭是一种严重的肝脏疾病，死亡率高达60～90％。目前，对此最有效的治疗方法为肝脏移植。然而，由于供体器官缺乏、费用高昂、需长期使用免疫抑制剂等原因，往往在等待供体过程中，病人由于病情进展而迅速死亡，极大地限制了肝移植手术的广泛开展。因此，以培养肝细胞为基础的生物型人工肝技术成为终末期肝病患者向原位肝移植顺利过渡、以及给急性肝功能衰竭患者受损肝脏提供得以再生和修复时机的重要手段。
中国专利申请CN102311938A公开了一种用于肝细胞培养的无血清培养基，其包含基础培养基和添加组分，其中，所述添加组分包括：胰岛素0.1～10μg/mL、转铁蛋白0.5～10μg/mL、亚硒酸钠5～10μg/L、表皮生长因子1～100ng/mL、肝细胞生长因子1～100ng/mL、纤粘连蛋白0.1～1μg/mL、地塞米松0.1～10nmol/mL和胰高血糖素0.05～5μg/mL。
中国专利申请CN105087465A公开了一种肝细胞无血清培养基，其包括以下组分：基础培养基500mL；丝胶蛋白0.05～0.5％；地塞米松0.1～1000nmol/mL；肝细胞生长因子5～20ng/mL；表皮生长因子10～50ng/mL；青链霉素100U/mL。
目前，虽然已经研发出用于肝细胞培养的无血清培养基，但是，存在价格昂贵，不利于日常应用、广泛推广及肝细胞的产业化培养等问题。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种培养肝细胞的培养基。本发明提供的培养肝细胞的培养基成分明确且价格较低，有利于日常应用、广泛推广及肝细胞的产业化培养。本发明提供的培养肝细胞的培养基不含有胎牛血清，不含任何动物来源成份，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，
本发明的技术方案是：
一种培养肝细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇4-7mg/L，硫辛酸0.2-0.4mg/L，细胞生长因子20-35μg/L，硫酸软骨素0.2-0.5mg/L，生物素13-16μM，胰岛素0.9-1.3mg/L，过氧化氢酶10-17mg/L，牛磺酸0.1-0.3g/L，肉豆蔻酸6-8mg/L，纤粘连蛋白14-22μg/L。
进一步地，所述培养肝细胞的培养基包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇5mg/L，硫辛酸0.3mg/L，细胞生长因子28μg/L，硫酸软骨素0.4mg/L，生物素15μM，胰岛素1.1mg/L，过氧化氢酶14mg/L，牛磺酸0.2g/L，肉豆蔻酸7mg/L，纤粘连蛋白17μg/L。
进一步地，所述基础培养基为F12或RMPI 1640培养基。
进一步地，所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子按重量比2-5∶7-11组成。
进一步地，所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子按重量比3∶10组成。
另外，本发明还提供了所述培养肝细胞的培养基的制备方法，步骤如下：
S1向基础培养基中加入细胞生长因子、牛磺酸和纤粘连蛋白，搅拌20-30分钟，加入胆固醇、硫辛酸、硫酸软骨素、生物素、胰岛素和肉豆蔻酸，继续搅拌23-35分钟，加入过氧化氢酶，搅拌20分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.7-7.3，用0.2-0.25微米滤膜过滤除菌，即得。
优选地，所述步骤S1搅拌23分钟。
优选地，所述步骤S1继续搅拌32分钟。
优选地，所述步骤S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.9。
优选地，所述步骤S2用0.22微米滤膜过滤除菌。
本发明提供的培养肝细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加的添加剂包括细胞生长因子、胆固醇、硫辛酸、硫酸软骨素和生物素等。在本发明的各种培养基的成分中，基础培养基能够提供肝细胞的生存和最低的生理活动。在本发明中，胆固醇作为一种脂类，参与形成细胞膜。在本发明中，硫辛酸与本发明所用其他原料协同作用，能够提高肝细胞的细胞活率，另外，硫辛酸还起到抗氧化的作用。在本发明中，生物素能参与肝细胞的代谢，对肝细胞的生长和代谢起控制作用，并且与硫辛酸协同作用，起到抗氧化的作用，能消除氧自由基对细胞的损害。在本发明中，过氧化氢酶能够清除自由基，保护肝细胞免受超氧自由基损害等。在本发明中，牛磺酸能够促进肝细胞的增殖，与本发明所用其他原料协同作用，能够显著提高的肝细胞的增殖倍数。在本发明中，胰岛素可通过作用于肝细胞表面的胰岛素受体，增强肝细胞对能源的摄入和利用，同时促进肝细胞内的RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，从而增强肝细胞的活力与功能。在本发明中，纤粘连蛋白能够促进肝细胞的黏附，及其贴壁生长。在本发明中，细胞生长因子能够促进肝细胞的增殖，以及调节肝细胞的功能。在本发明中，肉豆蔻酸能够促进肝细胞的生长。研究发现，在培养基中加入硫酸软骨素，能增加细胞的信使核糖核酸和脱氧核糖核酸的生物合成以及具有促进细胞代谢的作用，与其他原料配合使用，能够达到更好的提高肝细胞的增殖倍数和细胞活率的效果。
本发明培养肝细胞的培养基搭配合理，各成分间协同作用，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，促进肝细胞的增殖，提高肝细胞的细胞活率。
与现有技术相比，本发明提供的培养肝细胞的培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的培养肝细胞的培养基成分明确且价格较低，有利于日常应用、广泛推广及肝细胞的产业化培养。
(2)本发明提供的培养肝细胞的培养基，不含有胎牛血清，不含任何动物来源成份，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，促进细胞黏附、生长和增殖，显著提高肝细胞的增殖倍数和细胞活率。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明所用RMPI 1640培养基可购自Hyclone公司，F12培养基可购自Hyclone公司，硫酸软骨素可购自嘉兴恒杰生物制药有限公司。
实施例1、一种培养肝细胞的培养基
所述培养肝细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇4mg/L，硫辛酸0.2mg/L，细胞生长因子20μg/L，硫酸软骨素0.2mg/L，生物素13μM，胰岛素0.9mg/L，过氧化氢酶10mg/L，牛磺酸0.1g/L，肉豆蔻酸6mg/L，纤粘连蛋白14μg/L。
所述基础培养基为F12培养基。
所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子按重量比2∶11组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入细胞生长因子、牛磺酸和纤粘连蛋白，搅拌20分钟，加入胆固醇、硫辛酸、硫酸软骨素、生物素、胰岛素和肉豆蔻酸，继续搅拌23分钟，加入过氧化氢酶，搅拌20分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.7，用0.2微米滤膜过滤除菌，即得。
实施例2、一种培养肝细胞的培养基
所述培养肝细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇7mg/L，硫辛酸0.4mg/L，细胞生长因子35μg/L，硫酸软骨素0.5mg/L，生物素16μM，胰岛素1.3mg/L，过氧化氢酶17mg/L，牛磺酸0.3g/L，肉豆蔻酸8mg/L，纤粘连蛋白22μg/L。
所述基础培养基为RMPI 1640培养基。
所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子按重量比5∶7组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入细胞生长因子、牛磺酸和纤粘连蛋白，搅拌30分钟，加入胆固醇、硫辛酸、硫酸软骨素、生物素、胰岛素和肉豆蔻酸，继续搅拌35分钟，加入过氧化氢酶，搅拌20分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至7.3，用0.25微米滤膜过滤除菌，即得。
实施例3、一种培养肝细胞的培养基
所述培养肝细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇5mg/L，硫辛酸0.3mg/L，细胞生长因子28μg/L，硫酸软骨素0.4mg/L，生物素15μM，胰岛素1.1mg/L，过氧化氢酶14mg/L，牛磺酸0.2g/L，肉豆蔻酸7mg/L，纤粘连蛋白17μg/L。
所述基础培养基为RMPI 1640培养基。
所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子按重量比3∶10组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入细胞生长因子、牛磺酸和纤粘连蛋白，搅拌23分钟，加入胆固醇、硫辛酸、硫酸软骨素、生物素、胰岛素和肉豆蔻酸，继续搅拌32分钟，加入过氧化氢酶，搅拌20分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.9，用0.22微米滤膜过滤除菌，即得。
对比例1、一种培养肝细胞的培养基
所述培养肝细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇5mg/L，硫辛酸0.3mg/L，细胞生长因子28μg/L，硫酸软骨素0.4mg/L，生物素15μM，胰岛素1.1mg/L，过氧化氢酶14mg/L，牛磺酸0.2g/L，肉豆蔻酸7mg/L，纤粘连蛋白17μg/L。
所述基础培养基为RMPI 1640培养基。
所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子按重量比1∶1组成。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子按重量比1：1组成。
对比例2、一种培养肝细胞的培养基
所述培养肝细胞的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胆固醇5mg/L，硫辛酸0.3mg/L，细胞生长因子28μg/L，硫酸角质素0.4mg/L，生物素15μM，胰岛素1.1mg/L，过氧化氢酶14mg/L，牛磺酸0.2g/L，肉豆蔻酸7mg/L，纤粘连蛋白17μg/L。
所述基础培养基为RMPI 1640培养基。
所述细胞生长因子由表皮生长因子和肝细胞生长因子按重量比3∶10组成。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将硫酸软骨素替换为硫酸角质素。
试验例一、本发明培养肝细胞的培养基对肝细胞的培养效果
1、试验对象：本发明实施例1-3所得培养肝细胞的培养基，以及对比例1和对比例2所得培养肝细胞的培养基。
2、试验方法：
将肝细胞分别接种于实施例1-3所得培养基，以及对比例1和对比例2所得培养基，在5％CO2及37℃环境中传代培养，传代过程中使用0.25％胰蛋白酶-EDTA进行消化后，按1∶1体积比加入大豆胰蛋白酶抑制剂(1mg/mL)并重悬，然后以1000rpm离心5min，弃去上清，以各自培养基重悬后加入培养瓶中继续传代培养，每24h更换培养基。不同培养基对肝细胞的细胞增殖结果如表1所示，不同培养基的细胞活率如表2所示。
表1：不同培养基对肝细胞的细胞增殖结果
由表1可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明所得实施例1-3所得培养肝细胞的培养基中肝细胞的细胞数，明显大于生长在对比例1和对比例2所得培养肝细胞的培养基中肝细胞的细胞数。这说明，本发明培养肝细胞的培养基可以明显促进肝细胞的增殖，本发明培养肝细胞的培养基的扩增效果好。
表2：不同培养基的细胞活率
由表2可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3所得培养肝细胞的培养基中肝细胞的细胞活率，明显高于生长在对比例1和对比例2所得培养肝细胞的培养基中肝细胞的细胞活率。