启动子、重组间质干细胞及其制备方法和应用与流程

【技术领域】

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种启动子、重组间质干细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

骨关节炎(oa，osteoarthritis)又名退行性骨关节炎，为关节软骨的退行性变，并在关节边缘有骨刺形成。随着人类平均寿命的延长,骨关节炎的发病率越来越高。炎症会导致软骨的退变，而软骨退变又能刺激炎症的恶化，从而使得病情愈加严重。

治疗骨关节炎的方法主要有物理治疗和药物治疗，物理治疗主要针对轻度患者，达到减轻疼痛和维持关节功能的目的。药物治疗采用的药物主要有：镇痛药，cox-2抑制剂，类固醇，滑液补充剂等。然而，这些治疗方法的效率有限，特异性不明显，不能有效改善病情。

技术实现要素：

为克服现有骨关节炎治疗方法效果较差的技术问题，本发明提供一种启动子、重组间质干细胞及其制备方法和应用。

本发明为解决上述技术问题的一技术方案是提供一种启动子，所述启动子的序列如seqidno:2所示。

本发明还提供一种重组间质干细胞的制备方法，包括：提供tnfα抗体基因及上述的启动子，构建得到慢病毒表达质粒；其中，所述tnfα抗体基因的序列如seqidno:1所示；将所述慢病毒表达质粒进行慢病毒包装，获得病毒液；在所述病毒液中感染间充质干细胞，得到所需的重组间质干细胞。

优选地，所述慢病毒表达质粒的构建包括：步骤s11：将所述tnfα抗体基因和所述启动子克隆进穿梭质粒pgfp，获得穿梭质粒tnfα-gfp；步骤s12：以所述穿梭质粒tnfα-gfp作为载体，加入所述tnfα抗体基因得到tnfα-ab质粒载体；步骤s13：转化所述tnfα-ab质粒载体并进行质粒抽提得到所述慢病毒表达质粒。

优选地，所述tnfα抗体基因通过采用核酸内切酶xho1和核酸内切酶xba1对所述穿梭质粒tnfα-gfp进行双酶切得到。

优选地，所述双酶切的时间为3-24h。

优选地，所述步骤s12为利用tnfα抗体基因以及穿梭质粒tnfα-gfp进行连接反应，获得tnfα-ab质粒载体；所述连接反应的反应体系中所述穿梭质粒tnfα-gfp的浓度为2-3ng/μl，所述tnfα抗体基因摩尔数为所述穿梭质粒tnfα-gfp摩尔数的2-4倍。

优选地，所述步骤s12还包括在反应体系中加入dna连接酶和连接缓冲液；所述反应体系中dna连接酶的体积百分比为2-3％，连接缓冲液的体积百分比为8-12％。

优选地，转化所述tnfα-ab质粒载体具体包括以下步骤：将所述tnfα-ab质粒载体加入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，混合均匀后得到混合溶液；将该混合溶液冰浴20-50min，经40-45℃热休克作用30-90s后再冰浴1-4min；然后将混合溶液置于培养基中培养，得到含有所述慢病毒表达质粒的培养液。

本发明还提供一种重组间质干细胞，该重组间质干细胞整合有启动子和tnfα抗体基因；所述启动子的序列如seqidno:2所示，所述tnfα抗体基因的序列如seqidno:1所示。

本发明还提供一种重组间质干细胞的应用，将上述重组间质干细胞用于制备治疗骨关节炎的药物。

相对于现有技术，本发明所提供的一种启动子，该启动子可以在炎症因子tnfα存在的情况下正向激活表达tnfα抗体基因，利用该启动子能得到用于治疗骨关节炎且治疗效果好的重组间质干细胞。

本发明还提供的一种重组间质干细胞的制备方法，利用上述启动子制备得到重组间质干细胞，该重组间质干细胞在炎症环境下会被炎症因子tnfα激活，能稳定地结合到炎症位点，从而增强间充质干细胞的抗炎与免疫调节能力，因而能用于治疗骨关节炎且治疗效果好。

本发明还提供一种重组间质干细胞，该重组间质干细胞中整合有启动子和tnfα抗体基因，在炎症环境下会被炎症因子tnfα激活，能稳定地结合到炎症位点，从而增强间充质干细胞的抗炎与免疫调节能力，因而能用于治疗骨关节炎且治疗效果好。

本发明还提供一种重组间质干细胞的应用，将上述重组间质干细胞用于制备治疗骨关节炎的药物，所得到的药物治疗骨关节炎的效果好。

【附图说明】

图1是本发明中重组间质干细胞的制备方法的流程示意图。

图2是本发明中重组间质干细胞的制备方法的步骤s1的流程示意图。

图3是本发明中穿梭质粒pgfp的图谱。

图4是本发明中穿梭质粒tnfα-gfp的图谱。

图5是本发明中第三代慢病毒包装质粒的图谱。

图6是本发明中加入翻译序列和绿色荧光蛋白序列的启动子的结构示意图。

图7是本发明中慢病毒感染msc后的效率鉴定图。

图8是本发明中rt-pcr检测msc在慢病毒感染后，tnfα-ab的表达情况。

图9是westernblotting检测细胞中tnfα-ab的表达情况。

图10是he染色检测经治疗后组织炎症浸润情况是否改善。

图11为elisa技术经治疗后炎症小鼠脾脏细胞的增殖检测。

图12为elisa技术检测经治疗后炎症小鼠炎症因子的表达。

图13为real-timepcr技术检测经治疗后炎症小鼠mrna水平上炎症因子的表达。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的，技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一

本发明提供一种启动子，所述启动子的序列如seqidno:2所示。该启动子可以在炎症因子tnfα存在的情况下正向激活表达tnfα抗体基因，利用该启动子能得到用于治疗骨关节炎且治疗效果好的重组间质干细胞。

本发明所提供的启动子在炎症因子tnfα存在的情况下正向激活表达tnfα抗体基因的作用机理是：炎症因子tnfα有多个下游信号通路，其中最重要的一个下游信号通路是nf-κb转录因子的激活；而炎症因子tnfα激活nf-κb通路有众多信号分子参与，如tnfr相关因子、受体相互作用蛋白(rip，receptor-interactingprotein)、丝裂原活化蛋白激酶3(map3k，mitogen-activatedproteinkinaseki-nase3)、ikk复合物、白介素10(il-10)等；本发明在众多信号分子中筛选出与炎症因子tnfα关系密切的il-10，通过将il-10与cag启动子相结合从而得到所述启动子。因此当炎症因子tnfα表达升高时，可激活il-10的表达，据此设计的启动子可正向激活表达tnfα抗体基因。

实施例二

如图1所示，一种重组间质干细胞的制备方法，包括：

步骤s1：提供tnfα抗体基因及上述的启动子，构建得到慢病毒表达质粒；其中，所述tnfα抗体基因的序列如seqidno:1所示；

步骤s2：将所述慢病毒表达质粒进行慢病毒包装，获得病毒液；

步骤s3：在所述病毒液中感染间充质干细胞，得到所需的重组间质干细胞。其中，间充质干细胞(msc)可以直接购买，或者是从动物骨髓中进行提取。在本发明的具体操作中是从c57/bl6小鼠骨髓中提取得到msc，c57/bl6小鼠购于香港大学实验动物中心。

利用上述启动子制备得到重组间质干细胞，该重组间质干细胞在炎症环境下会被炎症因子tnfα激活，能稳定地结合到炎症位点，从而增强间充质干细胞的抗炎与免疫调节能力，因而能用于治疗骨关节炎且治疗效果好。

优选的，请一并参阅图2，步骤s1也即所述慢病毒表达质粒的构建包括：

步骤s11：将所述tnfα抗体基因和所述启动子克隆进穿梭质粒pgfp，获得穿梭质粒tnfα-gfp；

步骤s12：以所述穿梭质粒tnfα-gfp作为载体，加入所述tnfα抗体基因得到tnfα-ab质粒载体；

步骤s13：转化所述tnfα-ab质粒载体并进行质粒抽提得到所述慢病毒表达质粒。

通过将tnfα抗体基因和启动子克隆进穿梭质粒pgfp，并以获得的穿梭质粒tnfα-gfp为载体，再加入tnfα抗体基因，从而得到稳定的含有tnfα抗体基因和启动子的tnfα-ab质粒载体；并且能让所述启动子工作及表达tnfα抗体基因；经转化tnfα-ab质粒载体并进行质粒抽提得到所需的慢病毒表达质粒。

其中穿梭质粒pgfp由广州复能基因有限公司提供，所述穿梭质粒pgfp的图谱如图3所示。穿梭质粒tnfα-gfp的图谱如图4所示，图4中的il-cagpromoter即为所述启动子。

优选地，所述tnfα抗体基因通过采用核酸内切酶xho1和核酸内切酶xba1对所述穿梭质粒tnfα-gfp进行双酶切得到。利用所述穿梭质粒tnfα-gfp获得tnfα抗体基因，保证在整个制备过程中所用的tnfα抗体基因的一致性，从而保证最终所得的重组间质干细胞的性能稳定性。并且根据穿梭质粒tnfα-gfp的基因序列，对内切酶进行选择，即选用核酸内切酶xho1和核酸内切酶xba1进行双酶切，从而保证得到完整且稳定的tnfα抗体基因。当然在另外一些实施例中，由于已经给出tnfα抗体基因的序列，也可以直接合成或者利用pcr扩增技术得到所述tnfα抗体基因。

优选地，所述双酶切的时间为3-24h。这样能保证酶切的效果，即酶切完全。其中更好的是双酶切的时间为6-12h。

优选地，所述步骤s12为利用tnfα抗体基因以及穿梭质粒tnfα-gfp进行连接反应，获得tnfα-ab质粒载体；所述连接反应的反应体系中所述穿梭质粒tnfα-gfp的浓度为2-3ng/μl，所述tnfα抗体基因摩尔数为所述穿梭质粒tnfα-gfp摩尔数的2-4倍。

通过确定穿梭质粒tnfα-gfp的浓度以及tnfα抗体基因与穿梭质粒tnfα-gfp的摩尔数之间的用量比，所述连接反应较为稳定，且能有效减少反应产物中的杂质，在这里杂质指的是除所需的tnfα-ab质粒载体以外的物质。更好的是，所述穿梭质粒tnfα-gfp的浓度为2.5ng/μl，所述tnfα抗体基因摩尔数为所述穿梭质粒tnfα-gfp摩尔数的3倍。

优选地，所述步骤s12还包括在反应体系中加入dna连接酶和连接缓冲液；所述反应体系中dna连接酶的体积百分比为2-3％，连接缓冲液的体积百分比为8-12％。通过确定dna连接酶及连接缓冲液的体积百分比，保证反应的快速性和稳定性。其中，dna连接酶为t4dnaligase，连接缓冲液为10×ligationbuffer；在较优的实施例中，所述反应体系中dna连接酶的体积百分比为2.5％，连接缓冲液的体积百分比为10％。

具体的，以连接反应的反应体系总体积是20μl为例，在反应体系中包括50ng穿梭质粒tnfα-gfp、2μl10×ligationbuffer、0.5μlt4dnaligase，然后加双蒸水或超纯水至20μl即可。

优选地，转化所述步骤s13中tnfα-ab质粒载体具体包括以下步骤：将所述tnfα-ab质粒载体加入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，混合均匀后得到混合溶液；将该混合溶液冰浴20-50min，经40-45℃热休克作用30-90s后再冰浴冷却1-4min；然后将混合溶液置于培养基中培养，得到含有所述慢病毒表达质粒的培养液。首先，通过选用大肠杆菌dh5α感受态细胞，既能保证tnfα-ab质粒载体的表达，并且不会对tnfα-ab质粒载体的转化造成负面影响，该处的负面影响指的是大肠杆菌dh5α感受态细胞中不存在能降解tnfα-ab质粒载体的特异的内切酶体系，以及不对tnfα-ab质粒载体的dna进行修饰等。其次，通过将混合溶液冰浴20-50min后热休克，紧接着置于冰上1-4min的操作，保证转化效率。

具体的，可以直接将连接反应后得到的反应产物直接加入大肠杆菌dh5α感受态细胞中。如，取12μl所述反应产物加到50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；再进行热休克，42℃金属浴50s，迅速再次冰浴1-2min，加入500μl已温育至37℃无抗性的lb培养基；在37℃，200rpm的条件下摇床培养1h，培养后以8000rpm的转速离心，去部分上清后涂布于含腺苷一磷酸(amp，adenosinemonophosphate)的lb平板上，37℃下倒置培养过夜；挑取单克隆菌落于无抗性的lb培养基中，按体积比1:300加入amp，于37℃，200rpm的条件下摇床培养12h，得到培养液。

在转化得到所述培养液后进行质粒抽提即可获得所述慢病毒表达质粒。质粒抽提是为了去除rna、蛋白质等杂质，得到相对纯净的慢病毒表达质粒。具体的，可以是使用质粒小提试剂盒lot#l0802进行质粒抽提，步骤如下：

1)柱平衡，吸附柱加入500μl平衡液，12000rpm离心1min；

2)取过夜的培养液3ml，分两次加入1.5mlep管中，12000rpm离心1min，尽量吸出上清液，收集菌体细胞；

3)向沉淀中加250μl溶液p1，用枪彻底悬浮沉淀；

4)加入250μl溶液p2，温和上下翻转6～8次，使菌体充分溶解；

5)加入350μl溶液p3，立即温和上下翻转6～8次直至出现絮状沉淀，12000rpm离心10min；

6)将上清加入吸附柱中，12000rpm离心30s，重复该步操作一次；

7)加入600μl的漂洗液，12000rpm离心30s，重复该步操作一次；

8)12000rpm离心2min，去除漂洗液，室温开盖晾干；

9)加入40μlddh2o洗脱，静置2min中，12000rpm离心2min，得到慢病毒表达质粒tnfα-gfp。

其中，所用的平衡液、溶液p1、溶液p2、溶液p3及漂洗液均为质粒小提试剂盒lot#l0802内提供。

进一步的是，在步骤s2中，慢病毒包装是将所述慢病毒表达质粒与包装载体一同转染包装细胞，即可得到所需病毒液。具体的可以是选用239ft细胞作为包装细胞，并且使用lipofectamine2000试剂盒进行慢病毒包装。优选地，在进行慢病毒包装，也即转染前24h，消化293ft细胞并计数，以5×10⁶接种于10cm培养皿中，使其转染时293ft细胞融合率达80％～90％。

然后可以按照lipofectamine2000说明书的步骤，将慢病毒表达质粒tnfα-gfp及穿梭质粒pgfp分别加入慢病毒包装质粒后，转染包装细胞293ft。质粒用量分别为(10μgpgfp+6.52μgpmdl+2.52μgprsv-rev+3.52μgpmd2.g)及(36μgtnfα-gfp+12μgpmdl+6μgprsv-rev+18μgpmd2.g)。转染48h后，收获包装细胞293ft产生的病毒上清，置于4℃温度下暂存。加入新鲜293ft培养基，再培养24h，第二次收集病毒上清，与第一次收集的病毒上清混合，经0.45μm滤膜过滤并按照peg-it说明书将病毒浓缩。分装浓缩后的病毒液，置于-80℃温度下保存。

其中，慢病毒包装质粒为addgene公司提供的第三代慢病毒包装质粒，该第三代慢病毒包装质粒的图谱如图5所示。

如前文所述，间充质干细胞(msc)可以是从动物骨髓中进行提取。msc的提取可以是通过骨髓冲洗法获取：通过贴壁培养法去杂细胞，大约传代4次后，显微镜下可见msc为较规则的长梭形，排列有方向性，呈现漩涡状、辐射状生长趋势。

在步骤s3中间充质干细胞的感染具体可以为：消化msc细胞并计数，以1×10⁶每孔的密度接种于6孔板中，将病毒上清及polybrene(终浓度为8μg/ml)加入6孔板中。

实施例三

一种重组间质干细胞，整合有启动子和tnfα抗体基因；所述启动子的序列如seqidno:2所示，所述tnfα抗体基因的序列如seqidno:1所示。即采用上述重组间质干细胞的制备方法制备得到。该重组间质干细胞中整合有启动子和tnfα抗体基因，在炎症环境下会被炎症因子tnfα激活，能稳定地结合到炎症位点，从而增强间充质干细胞的抗炎与免疫调节能力，因而能用于治疗骨关节炎且治疗效果好。

实施例四

一种重组间质干细胞的应用，将上述重组间质干细胞用于制备治疗骨关节炎的药物，所得到的药物治疗骨关节炎的效果好。所述重组间质干细胞可以单独给药，或者以药物组合物的形式给药。可以理解，所述药物组合物包含重组间质干细胞和载体或赋形剂。其制剂形式取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造，所述重组间质干细胞存在于细胞相容的介质中，如0.9％生理盐水中或制成缓控制剂等。

设置一个实验组、一个空载体对照组及一个空白对照组进行测试。实验组为以本发明中利用所述慢病毒表达质粒感染的msc，也就是进行重组后得到的所述重组间质干细胞，记为msc-tnfα-ab。空载体对照组为利用穿梭质粒pgfp感染的msc，记为msce。空白对照组为未进行慢病毒感染的msc，记为msc。

并且为方便确认通过所述慢病毒表达质粒制得的病毒液中能成功感染所述间充质干细胞，可以是在所述启动子中设计一段翻译序列及荧光蛋白序列。如图6所示，在所述启动子中加入翻译序列(ires)和绿色荧光蛋白序列(gfp，greenfluorescentprotein)。这样在间充质干细胞感染成功后的细胞，通过显微镜可以观察到细胞发出绿色荧光。具体的，在感染48h后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(gfp)的表达情况。即在488nm波长激发光下，可见绝大多数细胞发出绿色荧光。

一、慢病毒感染后的效率鉴定

对上述实验组、空载体对照组和空白对照组进行感染测试，结果如图7所示，在msc-tnfα-ab和msce中出现绿色荧光蛋白(gfp)的表达，在msc中无gfp的表达。

二、tnfα抗体基因(tnfα-ab)的表达鉴定

对上述实验组、空载体对照组和空白对照组进行tnfα抗体基因(tnfα-ab)的表达鉴定。具体操作为：

分别收集1×10⁶的msc，msce及msc-tnfα-ab，按照qiagen公司的rneasyminikit(目录号74104)提取细胞总rna，根据takaoa公司的primescriptfirststoandcdnasynthesiskit(目录号6110a)逆转录试剂盒说明书，将总rna逆转录为cdna，用takaoataq^tm(目录号r001a)并以60℃为退火温度进行pcr。

pcr所用引物序列如下：

小鼠msc-tnfα-ab基因产物长度(257bp)：

f：5’-gctagagtggctctcgca-3’(seqidno:3)

r：5’-cgaaggggcggaacttaa-3’(seqidno:4)

小鼠β-actin基因(genbank登录号：nm_007393.3)(产物长度448bp)：

f：5’-agagggaaatcgtgcgtgac-3’(seqidno:5)

r：5’-tgctggaaggtggacagtgag-3’(seqidno:6)

结果显示，相比空白对照组msc以及空载体对照组msce，实验组msc-tnfα-ab病毒感染后的msc-tnfα-ab细胞中tnfα-ab表达水平显著提高(图8)，证明实验组msc-tnfα-ab病毒感染msc效果良好，可使其稳定过表达tnfα-ab。

三、检测构建的msc-tnfα-ab可被炎症因子tnfα特异调节启动

为检测体外msc细胞培养中在加入炎症因子tnfα后tnfα-ab的表达情况。

1.msc-tnfα-ab细胞培养：

msc-tnfα-ab细胞培养基为：在dmef/f12培养基中含有10％胎牛血清(fbs)，100u/ml青链霉素，1％非必须氨基酸，0.1％β-巯基乙醇，5ng/ml的egf，5ng/ml的fgf。

1)在进行无菌培养前，将实验室所需材料高压灭菌；紫外灯照射30min；穿戴细胞间专用实验服和手套，用75％酒精擦拭双手；显微镜下，观察细胞状态，细胞密度汇合至70％以上则需传代，关闭紫外灯，打开风机，同时用酒精棉球擦拭超净台，点燃酒精灯。

2)在打开培养皿盖，去除细胞培养上清，pbs洗涤后，去除pbs。

3)将胰酶加入培养皿内，在培养箱放置13min。显微镜下随时观察，见到细胞的突起消失，变圆时，立即加入等体积完全培养基终止消化。注意不要消化时间过长，否则细胞会被胰酶消化掉。

4)终止后移液器轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中，吸取细胞悬液并转移至ep管中，400xg离心3min。重悬细胞，并根据实验目的和细胞习性按不同比例分皿继续培养。

5)传代后观察，传代或换液24～48h，注意细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝或其他悬浊物。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。

2.westernblot检测msc-tnfα-ab被炎症因子tnfα激活情况

选取50μmol/l浓度的tnfα炎症因子处理对数期的msc-tnfα-ab细胞，置于光镜下观察，细胞体外生长良好，细胞呈梭形，轮廓清楚。为了确定tnfα-ab的表达情况，选取了msc组(对照组)，tnfα-组(未加炎症因子tnfα刺激)和tnfα+组(已加炎症因子tnfα刺激)同时进行了总蛋白提取。所述蛋白提取使用ripa(sigma，目录号r0278)试剂，按照说明书进行。

调整细胞密度为70％-80％，pbs洗细胞两遍，加入8ml无酚红dmem(gibco，目录号21063-029)。将细胞裂解后收集蛋白，所得细胞蛋白经(boadford(bio-oad)，目录号5000202)方法进行定量后，用于常规westernblotting(蛋白质印迹法)实验。检测靶蛋白为tnfα-ab，内参照为β-actin(santacruz，目录号sc-47778)，westernblot结果显示tnfα+组tnfα-ab表达明显(图9)。

tnfα是重要的炎症因子之一，加入tnfα炎症因子处理msc-tnfα-ab细胞符合炎症浸润的实际情况。实验表明，经过本发明改造过的新型细胞系，在无tnfα炎症因子刺激时，不会表达tnfα-ab。而在tnfα炎症因子的刺激下，发挥其正反馈调节上调tnfα-ab的表达非常明显，这说明本发明的细胞系msc-tnfα-ab达到预期的实验目的。

四、he染色鉴定炎症组织

小鼠骨关节炎是经典的移植模型，本实施例应用该移植模型。

1.制备骨关节炎炎症浸润小鼠模型

将纯化的天然胶原溶于11m的醋酸制成浓度为1mg/ml的溶液，与等量的福氏佐剂或不完全佐剂混合成稳定的乳剂；用1ml乳剂分4～6个部位注射小鼠背部皮内，注射部位会出现小溃疡(在7～10天后自愈)；21天后，将15mg胶原溶于15ml1m的醋酸中，注入小鼠腹腔再次免疫。

初次注射后14～60天后，出现关节红肿，通常发生于关节远端，后足踝关节是最常累积的部位。急性期病理改变可分为两期，免疫10天后，关节内只有一些纤维沉积物而滑膜细胞无改变；12天后，肉眼可见踝关节红肿，膝关节出现红肿，光镜下滑膜细胞增多，滑膜层数增至3～7层，并向软骨骨面爬行，滑膜及滑膜下组织有纤维沉积。电镜下则见滑膜细胞变圆，细胞间接触减少，丝状伪足增多，细胞内溶酶体和内质网增大、增多；19天后进入第二期，增生的滑膜由6～10μm增厚至200～250μm，形成血管翳，其中有大量单核细胞、多形核巨细胞、巨噬细胞，在微血管周围形成微脓肿，可见到单核细胞侵入软骨连接处的软组织；6～7周后，炎症进入慢性期，水肿仍存在，浸润的细胞以cd+4的t细胞为主，关节内出现瘢痕，颗粒状增生组织，软骨及软骨下骨被破坏，最后导致骨关节炎形成。

2.移植检测

分别将2×106msc-tnfα-ab，msc，以及等体积的pbs(control组)移植到患处。一周以后将小鼠麻醉，颈椎脱臼处死，采集小鼠组织，4％多聚甲醛固定后进行常规石蜡包埋和he染色，观察移植部位细胞的保存情况和免疫细胞的浸润情况。he染色分析显示，control组炎症细胞浸润明显。msc-tnfα-ab组明显降低了炎症细胞的浸润，mscs组炎症缓解情况介于两组之间，随机选取每只受体小鼠的三张切片并在高倍视野下计数(400倍)，统计受体小鼠的炎症细胞数。

结果显示，pbs组浸润的平均炎症细胞数为235±70.4，msc-tnfα-ab组浸润的平均炎症细胞数为103.4±29.6，mscs组浸润的平均炎症细胞数为112.8±15.2。该数据表明，msc-tnfα-ab移植组更明显的降低炎症反应，缓解炎症症状，已经达到本发明的预期治疗效果(图10)。

五、炎症因子变化检测

本发明采集了受体小鼠脾脏，分离小鼠脾脏细胞进行了脾细胞增殖检测，cd4+t细胞，cd3+t细胞，th1以及th2细胞亚群分析检测，以及炎症因子mrna水平和血清中常规炎症因子蛋白水平的检测。

将小鼠脾细胞体外培养72h，在到达12h前，加入1×brdu。并进行brdu和mtt检测。结果如图11所示，图11中(a)为进行brdu检测的450nm波长得到的光密度(od值)，图11中(b)为进行mtt检测的570nm波长得到的光密度(od值)。结果显示：在细胞增殖方面，control组炎症细胞增殖明显，msc-tnfα-ab组具有较低的增殖水平，msc组处于两者之间。这表明mscs-tnfab能够有效的抑制炎症细胞的增殖情况(图11)。

本发明分析检测脾细胞种t细胞的亚群变化。检测发现，msc-tnfα-ab组治疗的受体小鼠脾细胞种th细胞和th2以及整体cd4+t细胞亚群比例明显降低，结果表示，msc-tnfα-ab治疗明显抑制了小鼠体内t细胞数目，降低了th1细胞和th2细胞亚群比例.

为了进一步确定炎症细胞的表达情况，本发明检测是否整体t细胞的比例有所降低，cd3是t细胞的表面标记物，本发明检测了被治疗小鼠脾细胞cd3+的t细胞比例以及foxp3的调节性t细胞(treg)。结果显示，msc-tnfα-ab组cd3t细胞比例明显降低，由23.1％下降至17.4％，treg比例明显上升，由2.9％上升至4.32％。以上结果表明，msc-tnfα-ab能够有效抑制t细胞比例，促进调节性t细胞增加。此外本发明通过real-timepcr和elisa技术分别检测了脾脏和血清中常规炎症因子白介素2(il-2)，白介素4(il-4)，il-10，γ干扰素(ifn-γ)，转化生长因子-β(tgf-β)和foxp3的表达；即图12中(a)为利用elisa技术检测得到的il-2浓度，图12中(b)为利用elisa技术检测得到的il-4浓度，图12中(c)为利用elisa技术检测得到的il-10浓度，图12中(d)为利用elisa技术检测得到的ifn-γ浓度，图12中(e)为利用elisa技术检测得到的foxp3浓度。elisa实验使用试剂盒(uscn，目录号e91866mu)，按照说明书进行。其中il-2，ifn-γ为th1细胞炎症因子，tgf-β能够有效促进t细胞向treg分化并诱导treg表达foxp3和il-10。检测发现，msc-tnfα-ab抑制了血清中il-2，il-4的表达，促进了il-10，ifn-γ和tgf-β1的表达(图12)。

在mrna水平上，msc-tnfα-ab组抑制了il-2，il-4的表达，促进了il-10，foxp3和tgf-β1的表达(图13)。具体的，图13中(a)为il-2的相对mrna水平，图13中(b)为il-4的相对mrna水平，图13中(c)为il-10的相对mrna水平，图13中(d)为foxp3的相对mrna水平，图13中(e)为ifn-γ的相对mrna水平，图13中(a)为il-2的相对mrna水平，图13中(a)为tgf-β1的相对mrna水平。

以上结果表明，msc-tnfα-ab治疗抑制了促炎症因子的表达和释放，促进抑炎症因子的表达和释放。

作为一种新型干细胞治疗方法，本发明构建的新型细胞系msc-tnfα-ab可明显减缓炎症反应及抑制多种炎症因子，为骨关节炎的炎症浸润反应起到了有效的缓解作用。

上述实验中所需试剂见表1。

表1慢病毒包装质粒及穿梭质粒信息

上述实验中293ft及小鼠骨髓msc培养基成分见表2。

表2慢病毒制备及msc感染所需的试剂信息

上述实验中293ft及小鼠骨髓msc培养基成分见表3。

表3293ft细胞及小鼠骨髓msc培养基配方

与现有技术相比，本发明所提供的一种启动子，所述启动子的序列如seqidno:2所示。该启动子可以在炎症因子tnfα存在的情况下正向激活表达tnfα抗体基因，利用该启动子能得到用于治疗骨关节炎且治疗效果好的重组间质干细胞。

本发明还提供一种重组间质干细胞的制备方法，包括：提供tnfα抗体基因及上述的启动子，构建得到慢病毒表达质粒；其中，所述tnfα抗体基因的序列如seqidno:1所示；将所述慢病毒表达质粒进行慢病毒包装，获得病毒液；在所述病毒液中感染间充质干细胞，得到所需的重组间质干细胞。利用上述启动子制备得到重组间质干细胞，该重组间质干细胞在炎症环境下会被炎症因子tnfα激活，能稳定地结合到炎症位点，从而增强间充质干细胞的抗炎与免疫调节能力，因而能用于治疗骨关节炎且治疗效果好。

进一步的是，所述慢病毒表达质粒的构建包括：步骤s11：将所述tnfα抗体基因和所述启动子克隆进穿梭质粒pgfp，获得穿梭质粒tnfα-gfp；步骤s12：以所述穿梭质粒tnfα-gfp作为载体，加入所述tnfα抗体基因得到tnfα-ab质粒载体；步骤s13：转化所述tnfα-ab质粒载体并进行质粒抽提得到所述慢病毒表达质粒。通过将tnfα抗体基因和启动子克隆进穿梭质粒pgfp，并以获得的穿梭质粒tnfα-gfp为载体，再加入tnfα抗体基因，从而得到稳定的含有tnfα抗体基因和启动子的tnfα-ab质粒载体；并且能让所述启动子工作及表达tnfα抗体基因。

进一步的是，所述步骤s12中的tnfα抗体基因通过采用核酸内切酶xho1和核酸内切酶xba1对所述穿梭质粒tnfα-gfp进行双酶切得到。利用所述穿梭质粒tnfα-gfp获得tnfα抗体基因，保证在整个制备过程中所用的tnfα抗体基因的一致性，从而保证最终所得的重组间质干细胞的性能稳定性。并且根据穿梭质粒tnfα-gfp的基因序列，对内切酶进行选择，即选用核酸内切酶xho1和核酸内切酶xba1进行双酶切，从而保证得到完整且稳定的tnfα抗体基因。

进一步的是，所述双酶切的时间为3-24h。这样能保证酶切的效果，即酶切完全。

进一步的是，所述步骤s12为利用tnfα抗体基因以及穿梭质粒tnfα-gfp进行连接反应，获得tnfα-ab质粒载体；所述连接反应的反应体系中所述穿梭质粒tnfα-gfp的浓度为2-3ng/μl，所述tnfα抗体基因摩尔数为所述穿梭质粒tnfα-gfp摩尔数的2-4倍。通过确定穿梭质粒tnfα-gfp的浓度以及tnfα抗体基因与穿梭质粒tnfα-gfp的摩尔数之间的用量比，所述连接反应较为稳定，且能有效减少反应产物中的杂质。

进一步的是，所述步骤s12还包括在反应体系中加入dna连接酶和连接缓冲液；所述反应体系中dna连接酶的体积百分比为2-3％，连接缓冲液的体积百分比为8-12％。通过确定dna连接酶及连接缓冲液的体积百分比，保证反应的快速性和稳定性。

进一步的是，转化所述tnfα-ab质粒载体为：将所述tnfα-ab质粒载体加入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，混合均匀后得到混合溶液；将该混合溶液冰浴20-50min，经40-45℃热休克作用30-90s后于零度环境下冷却1-4min；然后将混合溶液置于培养基中培养，得到含有所述慢病毒表达质粒的培养液。首先，通过选用大肠杆菌dh5α感受态细胞，既能保证tnfα-ab质粒载体的表达，并且不会对tnfα-ab质粒载体的转化造成负面影响。其次，通过将混合溶液冰浴20-50min后热休克，紧接着置于冰上1-4min的操作，保证转化效率。

本发明还提供一种重组间质干细胞，整合有启动子和tnfα抗体基因；所述启动子的序列如seqidno:2所示，所述tnfα抗体基因的序列如seqidno:1所示。该重组间质干细胞中整合有启动子和tnfα抗体基因，在炎症环境下会被炎症因子tnfα激活，能稳定地结合到炎症位点，从而增强间充质干细胞的抗炎与免疫调节能力，因而能用于治疗骨关节炎且治疗效果好。

本发明还提供一种重组间质干细胞的应用，将上述重组间质干细胞用于制备治疗骨关节炎的药物。所得到的药物治疗骨关节炎的效果好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等均应包含本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中基恒润国际控股有限公司

<120>启动子、重组间质干细胞及其制备方法和应用

<150>hk16105540.6

<151>2016-05-16

<160>6

<210>1

<211>465

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgctacgctcttcgtcccagaactcatcggataagcctgtcgcgcacgtggtagccaat60

caccaagtggaagagcagctagagtggctctcgcaacgcgccaatgcgctactggctaac120

ggtatggacctgaaggacaatcaactggtagttccggcagacggtctatacctggtatac180

tccaggtgcttttcaagggacaaggttgccctgactatgtgctgctaacgcacactgttt240

cacggttcgctatttcgtaccaggaaaaggttaacctgctatccgcggttaaatccccgt300

gcccaaaggacactcccgaaggggcggaacttaagccttggtacgaacctatttacctgg360

gtggagttttccaacttgaaaaaggcgaccagctttcagccgaagtaaatcttcccaagt420

catcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatg465

<210>2

<211>707

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>启动子

<400>2

tgggatctgagcttcttcgtgaaacacggggcagaggaggcaccagaactctcctctgac60

caactgccccacagcacacatatcctcaaaggatagtcttgaatacgtgatggaagaatt120

aaagagagtgaggtctgaagaaaatcagccctctcggggtttcctttgggtaactgagtg180

ctaaggtgacttccgagtcagcaagaaatatcggacgttcaacccaggttgagtggagga240

aacaattatttctcaatcctaatatgttctggaatagcccatttatccacgtcattatga300

cctgggagtgcgtgaatggaatccacagatgagggcctctgtacatagaacagctgtctg360

cctcaggaaatacaacttttagtattgagaagctaaaaagaaaaaaaaattaaaagagag420

gtagcccatactaaaaatagctgtaatgcagaagttcattccgaccagttctttagcgct480

tacaatgcaaaaaaaagggaaaggaaaaaaaaaaagaaagaaattaaactcaaaaattgc540

atggtttagaagagggaggaggagcctgaataacaaaaacctttgccaggaaggccccac600

tgagccttcagtataaaagggggaccaagaacaggaggtctacatttagagacttgctct660

tgcactaccaaagccacaaggcagccttgcagaaaagagagctccat707

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gctagagtggctctcgca18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgaaggggcggaacttaa

18

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

agagggaaatcgtgcgtgac20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tgctggaaggtggacagtgag20