一种抗肿瘤过继免疫活性细胞CIK的制备方法与流程

文档序号:12411434阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种抗肿瘤过继免疫活性细胞CIK的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)外周血单个核细胞(PBMC)的采集及制备:

1.1)通过静脉穿刺,肝素钠(4万U/L)抗凝采集外周血50‐100ml;于超净工作台内将血液样本和生理盐水以1:1体积比混合稀释,人外周血淋巴细胞分离液(FICOLL配置)分离PBMC,淋巴细胞分离液与稀释血样以1:2体积比加入离心管,室温下,2000‐2500rpm离心20‐30min;

1.2)离心后收集白膜层,即PBMC部分;加入生理盐水调整体积至45‐50ml并混匀,于1500‐1800rpm离心5‐10min,以上步骤重复洗涤细胞2‐3次后得到PBMC;

2)CIK细胞的制备:

2.1)调整细胞密度为1×106/ml‐2×106/ml,接种于含终浓度为75‐150ng/ml IL‐6及75‐150ng/ml IL‐21的CIK基础培养基中,37℃,5%CO2培养箱中常规孵育;

2.2)18‐24h后,将细胞移至含有终浓度为850‐1200U/ml IFN‐γ的CIK基础培养基中常规培养;

2.3)18‐24h后,向培养体系中加入终浓度为350‐650ng/ml人胸腺球蛋白500‐650U/ml IL‐2及5.5‐13.5ng/ml IL‐27;

2.4)此后每隔3‐4d补充等量含有终浓度500‐650U/ml IL‐2及5.5‐13.5ng/ml IL‐27的CIK基础培养基中,持续培养9‐11d。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤过继免疫活性细胞CIK的制备方法,其特征在于,所述步骤(2.1)中CIK细胞基础培养基是含终浓度5-13ml/L自体血浆的改良型RPMI-1640培养基。

3.根据权利要求1所述的抗肿瘤过继免疫活性细胞CIK的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)外周血单个核细胞的采集及制备

1.1)抽取4例肿瘤患者外周血液样本。通过静脉穿刺,肝素钠(4万U/L)抗凝分别采集外周血80ml。超净工作台内将采集好的血液样本和生理盐水1:1体积比混合稀释,淋巴细胞分离液Ficoll‐Paque PREMIUM分离PBMC,淋巴细胞分离液与稀释血样以1:2体积比加入离心管,室温下,2500rpm离心20min;

1.2)离心后收集各个患者血样的白膜层,即PBMC部分,加入生理盐水调整体积至50ml并混匀,于1800rpm离心5min,以上步骤重复洗涤细胞2次后得到PBMC。

2)CIK细胞的制备

2.1)调整细胞密度为1×106/ml,接种于含终浓度为100ng/ml IL‐6及100ng/ml IL‐21的CIK细胞基础培养基中,37℃,5%CO2培养箱中常规孵育;

2.2)待24h后,将细胞移至含有终浓度为1000U/ml IFN‐γ的CIK细胞基础培养基中常规培养;

2.3)待24h后向培养体系中加入终浓度为500ng/ml人胸腺球蛋白、500U/ml IL‐2及10ng/ml IL‐27;

2.4)此后每隔3d补充等量含有终浓度为500U/ml IL‐2及10ng/ml IL‐27的CIK细胞基础培养基,持续培养9d,可得到高增殖力,高细胞毒活性的抗肿瘤过继免疫活性细胞CIK。

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