拟南芥基因REM16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及拟南芥基因REM16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用。
背景技术：
：微丝解聚因子（ADF/cofilin）广泛存在于真核细胞中，对维持细胞的形态结构、细胞运输、能量转换、信息传递、细胞分裂及分化等起着非常重要的作用。前期研究表明，拟南芥微丝解聚因子ADF1表达量变化会影响植物的开花期，ADF1表达量的降低导致开花延迟。野生型拟南芥约在35±1天开花，有17片莲座叶；而ADF1基因沉默植株开花较野生型延迟2周，莲座叶数目增加至26片。其后，人们通过基因敲除深入解析ADF在植物生长发育中的分子功能。拟南芥adf4突变体具有更长的下胚轴和表皮细胞。拟南芥ADF9的突变体（adf9-1，adf9-2）植株的顶端优势增强，其花序的二级分枝数目少于野生型，但分枝的长度比野生型长；长日照生长条件下突变体开花时间早于野生型，同时莲座叶数目比野生型少，而短日照生长条件下跟野生型相比没有明显差异。此外，ADF9能调控开花转换时期相关基因的表达量。这些研究表明，ADF蛋白直接参与植物生长发育及花期调控，但其调控的目标基因、参与的关键调控因子及分子调控机制等都不清楚。技术实现要素：本发明提供了拟南芥基因REM16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用。本发明以拟南芥ADF1为诱饵，通过酵母双杂交从拟南芥cDNA文库中筛选得到了十几个ADF1互作蛋白分子，获得本发明所述的基因REM16(基因编号为AT3G53310)，并通过实验证明了其调控拟南芥花期的功能。为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明提供了一种拟南芥基因REM16的过表达载体pCambia1300-221-HA，所述过表达载体pCambia1300-221-HA的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:2所示，所述过表达载体含有如序列表SEQIDNo:1所示的基因REM16，所述过表达载体pCambia1300-221-HA用于调控拟南芥花期提前。进一步的：将基因REM16和带有XbaI和KpnI酶切位点的pCambia1300-221-HA载体分别进行KpnI和XbaI的双酶切，再按照基因片段和载体4：1的比例在T4连接酶的催化下进行16℃过夜连接20h制得。本发明提供了一种拟南芥基因REM16的基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0，所述基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0的核苷酸序列如序列表SEQIDNo:3所示，所述基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0用于调控拟南芥花期延迟。本发明还提供了拟南芥基因REM16在调控拟南芥开花期中的应用。进一步的：所述调控开花期的拟南芥中含有如序列表SEQIDNo:1所示的过表达载体pCambia1300-221-HA或如序列表SEQIDNo:2所示的基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0。进一步的：所述拟南芥基因REM16具有花期调控的功能，基因REM16过表达植株表现为早花性状，基因REM16沉默植株表现为晚花性状。进一步的：所述基因REM16过表达植株开花时间比野生型植株早4-6天，莲座叶数目比野生型少2片；而所述基因REM16沉默植株开花时间比野生型植株晚2-3天，莲座叶数目和野生型没有显著变化。进一步的：所述基因REM16过表达植株中涉及光周期途径GI、CO以及开花下游的开花整合子和花分生组织决定基因FT、LFY、AP1的表达量均高于野生型植株，春化途径FLC的表达量低于野生型植株，赤霉素途径RGA、RGL1的表达量与野生型比没有明显差异。进一步的：所述基因REM16沉默植株中涉及光周期途径GI、CO以及开花下游的开花整合子和花分生组织决定基因FT、LFY、AP1的表达量均低于野生型植株，春化途径FLC的表达量高于野生型植株，赤霉素途径RGA、RGL1的表达量与野生型比没有明显差异。本发明的优点和有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明通过花序侵染法的方法获得拟南芥基因REM16的过表达和基因沉默转基因载体及其转基因株系，通过研究过表达和基因沉默转基因植株表型，并将其与相同条件下生长的野生型植株开花时间及莲座叶数目进行比较。经过实验分析证明，拟南芥基因REM16(AT5G25520)具有花期调控的功能，过表达REM16基因引起转基因拟南芥植株中开花相关基因表达变化而促进拟南芥提早开花，与野生型植株的开花时间相比表现为早花性状；沉默REM16基因引起转基因拟南芥植株中开花相关基因表达变化而延迟拟南芥开花，与野生型植株相比表现为晚花性状。通过分析转基因株系开花相关基因的表达从而确定REM16基因调控开花的功能。本发明的技术方案对于植物花期调控具有重要意义。附图说明图1为野生型与突变体REM16基因表达量分析（**：P<0.01）。图2为野生型与突变体开花时间及莲座叶比较，其中：(a)为野生型与突变体开花时间比较；(b)为野生型与突变体开花时间统计分析；(c)为野生型与突变体莲座叶数目统计分析(**：P<0.01)。图3为野生型与突变体开花相关基因表达量分析(**：P<0.01)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例来对本发明的技术方案做进一步详细的说明。本发明实验中用到的试剂等购自TAKARA、Promega、Sigma等公司。实验中用到的LB培养基配方：0.5%酵母粉、1%NaCl、1%蛋白胨。其它试剂配方：见《分子克隆》第三版。实施例1、REM16基因的克隆1、拟南芥的种植拟南芥种子的表面消毒：将50粒待灭菌的拟南芥种子放入1.5ml离心管中，加入1ml75%的乙醇（含有0.03%体积比的TritonX-100）震荡消毒1min，再用70%的乙醇震荡消毒1min（两次），最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入1/2MS培养基中，冰箱中4℃春化3d后取出置于光照培养箱中培养。培养条件如下：16h光照/8h黑暗交替光照，温度22℃，光强100μmol·m-2·s-1。然后，待光照生长7-10天将拟南芥幼苗移到土中，覆盖保鲜膜3-7天揭膜，后于培养室中培养，条件同光照培养箱。2、拟南芥总RNA提取(1)将拟南芥材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研磨过程中要保证材料浸在液氮中；(2)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速加入1mlTrizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；(3)4℃，12,000rpm，离心11min，将0.8ml上清液转移到新的1.5ml离心管中；再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min直到分层。(4)4℃，12,000rpm，离心11min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中；再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，-20℃放置30mim。(5)4℃，12,000rpm，离心11min，弃上清，用0.9ml75%的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，12,000rpm，离心5min；(6)弃上清，开盖于超净工作台中干燥RNA约2-5min，加入40µlRNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA10min；(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A260/A280达到1.8-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。3、RNA的反转录详见TaKaRa的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒（RR047A）说明书。4、PCR扩增以上述反转录合成的cDNA为模板，PCR法扩增基因片段。(1)PCR引物由上海桑尼生物技术服务有限公司合成：引物REM16-For:5’-ATGGCTGACGATAGCGAAT-3’（SEQIDNo:4）；引物REM16-Rev:5’-TCAAGCATCTCTACGCAAGACATG-3’（SEQIDNo:5）。(2)PCR反应体系组分体积(µl)/管10×PCRBuffer2.5dNTPMixture1拟南芥cDNA3正向引物（10μΜ）1反向引物（10μΜ）1rTaq0.15ddH2O18.5总体积25PCR反应条件：94oC预变性5min；94oC变性30s，62oC退火30s，72oC延伸50s，27个循环；72oC延伸7min。5、PCR产物回收PCR反应后1%的琼脂糖凝胶电泳检测（110V17min），后在凝胶成像仪上观察结果并拍照。然后参照TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0试剂盒说明书将PCR产物回收，回收到拟南芥基因REM16(AP2/B3-liketranscriptionalfactorfamilyprotein)，所述基因REM16CDS序列如序列表SEQIDNo:1所示。6、连接将以上回收得到的REM16基因片段通过TA克隆连接到克隆载体pMD18-TVector上，16oC过夜。连接体系如下：组分体积(µl)/管SolutionI5pMD18-TVector1DNA回收产物4总体积107、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(1)DH5α菌种的活化：从-80℃超低温冰箱中取出保存的DH5α菌种，划线后37℃倒置培养；(2)挑取单菌落接种于10mLLB（-）液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养12h；(3)按1:100取接种于50mlLB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600值为0.4-0.6；(4)将菌液转移至50mL离心管中，冰上放置10min，4℃，2500g离心5min，弃上清；(5)加入20mL预冷的0.1MMgCL2悬浮菌体，4℃，2500g离心5min，弃上清；(6)加入50mL预冷的0.1MCaCL2悬浮菌体，冰浴20min，4℃，2500g离心5min，弃上清；(7)加入10mL预冷的0.1MCaCL2悬浮菌体，再加入1mL甘油充分混匀，每个EP管分装100µL后用液氮速冻于-80℃冰箱中保存备用。转化感受态细胞(1)从-80℃超低温冰箱中取出感受态细胞于冰上融化，将10µL重组质粒加入到感受态细胞中，吸打混匀，冰浴30min；(2)42℃热激90s，立即冰浴5min；(3)加入900µLLB（-）培养基，37℃，200rpm，1.5h；(4)4000g室温离心5min，弃800µL上清，剩余液体重悬菌体，涂布于带有Amp抗性的LB固体培养基上，将平板于37℃正向放置30min至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养12h过夜。8、重组质粒的获得及鉴定将TA克隆后挑单菌落进行菌液PCR验证，阳性菌液送样到上海桑尼生物技术有限公司进行DNA测序验证，将测序正确的菌液提取质粒用于后续实验。实施例2、35S::REM16CDS表达载体构建1、目的基因的获得引物设计及PCR反应的体系和条件：（1）以测序正确的重组质粒为模板，KpnI–REM16-For和XbaI-REM16Rev为引物PCR扩增861bp的REM16全长基因编码（CDS）序列，所用引物序列如下：KpnI-REM16-For：5’-CGGGGTACCCCGATGGCTGACGATAGCGAAT-3’（SEQIDNo:6）；XbaI-REM16-Rev：5’-GCTCTAGAGCTCAAGCATCTCTACGCAAGACATG-3’（SEQIDNo:7）；PCR反应体系和条件同实施例1。2、表达载体的构建将上一步的胶回收产物和带有XbaI和KpnI酶切位点的pCambia1300-221-HA载体分别进行KpnI和XbaI的双酶切，再按照4:1的比例在T4连接酶的催化下进行过夜连接。反应体系及条件如下：酶切反应体系和条件：组分体积(µL)/管XbaI1KpnI110×Mbuffer2胶回收产物/载体8ddH2O8总体积2037℃温育2.5h，然后分别将酶切产物回收。通过T4连接酶将目的基因REM16片段与双元载体pCambia1300-221-HA16℃过夜连接20h，连接体系如下：组分体积(µL)/管10×T4DNAligaseBuffer2.5RTE4酶切回收产物4pCambia1300-221-HA酶切回收产物1T4DNAligase1ddH2O1.5总体积10连接完成后转化大肠杆菌，然后挑单菌落摇菌提取重组质粒进行双酶切和菌液PCR验证，将含有重组质粒的阳性菌株送上海桑尼生物技术有限公司测序，得到的测序结果经过NCBIblast分析，阳性质粒中确实含有REM16的CDS序列。至此得到了35S::REM16CDS表达载体pCambia1300-221-HA（序列如SEQIDNo:2所示）。实施例3、REM16-RNAi载体构建1、含有固定接头（attB1，attB2）的目的片段的获得将测序正确的包含目的片段REM16基因的18-T重组质粒稀释1000倍，以稀释后的质粒为模板，按照上述克隆条件，以加attB接头的上下游引物为引物，克隆目的片段。凝胶回收目的片段。2、BP重组反应体系和条件组分体积(µL)/管带接头的attB-PCR回收产物3pDONR221vector(150ng/µL)2BP酶2TEBuffer，PH8.0to1025℃培养20h，每个反应加入1µlProteinaseK，37℃水浴10min。转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落，菌液PCR验证，提取阳性菌株质粒。3、LR重组反应体系和条件：组分体积(µL)/管Entryclone(上一步BP反应质粒)3pB7GWIWG2(II).0vector(150ng/µL)2LR酶2TEBuffer，PH8.0To1025℃培养20h，每个反应加入1µlProteinaseK，37℃水浴10min。转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落，菌液PCR验证，提取阳性菌株质粒，即为拟南芥基因REM16的基因沉默载体pB7GWIWG2(II).0（序列如SEQIDNo:3所示）。实施例4、拟南芥的转化与转基因植株的筛选1、农杆菌感受态细胞的制备(1)从超低温冰箱中取保存的农杆菌GV3101菌液用接种环划板活化，获单菌落；(2)用接种环挑取单菌落，接种于5ml液体YEP（-）培养基中，28℃，200rpm培养12h；(3)将液体培养物接种到新的液体YEP（-）培养基中，震荡培养至OD600为0.4-0.6；(4)将菌液冰浴0.5h，4℃，5000rpm，5min；(5)弃上清，用10mL0.15M预冷的NaCl悬浮菌体，4℃，5000rpm，5min；(6)弃上清，用10mL20mM预冷的CaCl2重悬菌体，分装成200μl/管于1.5mL离心管中，用液氮中迅速冷冻后于超低温冰箱中保存备用。2、将构建好的载体转化农杆菌GV3101（冻融法）(1)从-80℃超低温冰箱中取出农杆菌感受态细胞于冰上慢慢融化，加入10μl重组质粒，冰浴0.5h，液氮中冷冻60s，后置于37℃水浴5min；(2)加入950μl液体YEP（-）培养基，28℃，200rpm，培养3h；(3)12000rpm，1min收集菌体，留取100μl上清液回溶菌体；(4)将菌液涂于LB（含抗生素）固体培养基上，先28℃正置培养0.5h，后倒置培养2-3天；(5)菌液PCR反应验证。3、拟南芥的转化参考Clough等人的拟南芥转化的农杆菌介导的花浸染法。取验证过的阳性克隆菌于含有50mg/l利福平（Rif）和相应抗性的LB液体培养基中，28℃、220rpm震荡培养至OD600至1.0-1.8。6000rpm离心5min收集菌体，用含有5%蔗糖，0.04%SilwetL-77侵染液悬浮菌体，此时OD600在0.8左右。将拟南芥花序浸到侵染液中10-15s。然后将侵染好的拟南芥植株放入暗箱中上面覆膜保湿，暗培养24h后放于培养室中长日照培养。4、转基因植物的筛选及鉴定将侵染获得的第一代种子命名为T1代，将拟南芥种子经表面消毒后将铺在1/2MS+30mg/l潮霉素(Hyg)或5mg/l草铵膦(PPT)培养基上，置于4℃冰箱中春化处理3-4天，再于培养箱中16h光照/8h黑暗交替光照培养10天，阳性苗会一直存活并且颜色较绿，阴性苗会逐渐变黄致死。最后将阳性苗移栽到土中放于培养室中16h光照/8h黑暗交替光照培养至收获T2代种子（单株收）。将收获的T2代种子铺抗性板进行纯合体鉴定，若阳性苗与阴性苗比例为3:1则为纯合株系，按照之前的筛选方法再将纯合的阳性苗移苗到土壤中在培养室培养至收获的T3代种子（单株收），在抗性平板上筛选培养，此时幼苗应该为全绿证明是纯合体。在长日照生长10d的拟南芥幼苗，取幼苗提取总RNA经反转录得到cDNA，将cDNA稀释五倍作为模板，经过荧光定量PCR技术的分析，实验结果如图1所示，REM16过表达植株中涉及REM16基因表达量显著高于野生型植株，而REM16基因沉默植株中REM16基因表达量明显低于野生型植株。实施例5、转基因植株表型以及不同REM16表达量影响开花相关基因的分析1、开花时间及莲座叶数目统计分析选取长日照条件下（16h光照/8h黑暗）生长正常的拟南芥野生型（WT）植株与突变体植株各40株，进行开花时间及莲座叶数目统计分析。统计结果如图2所示，由图分析可知，生长至5周时，野生型（WT）拟南芥植株已完成由营养生长向生殖生长的转变，花朵开放，莲座叶数目大约为10片；REM16过表达植株开花时间比野生型早4-6天，莲座叶数目比野生型少约2片；而REM16基因沉默植株开花时间比野生型晚2-3天，莲座叶数目和野生型没有显著变化。由此确定拟南芥基因REM16(AT5G25520)具有花期调控的功能，过表达突变体表现为早花性状，基因沉默突变体表现为晚花性状。2、不同REM16基因的表达量影响开花相关基因表达的分析在长日照生长10d的拟南芥幼苗，取幼苗提取总RNA经反转录得到cDNA，将cDNA稀释五倍作为模板，经过荧光定量PCR技术的分析，实验结果如图3所示，REM16过表达植株中涉及光周期途径GI、CO以及开花下游的开花整合子和花分生组织决定基因FT、LFY、AP1的表达量均高于野生型植株，春化途径FLC的表达量低于野生型植株，赤霉素途径RGA、RGL1的表达量与野生型比没有明显差异，这与REM16过表达植株早花的表型相一致。REM16基因沉默植株中涉及光周期途径GI、CO以及开花下游的开花整合子和花分生组织决定基因FT、LFY、AP1的表达量均低于野生型植株，春化途径FLC的表达量高于野生型植株，赤霉素途径RGA、RGL1的表达量与野生型比没有明显差异，这与REM16基因沉默植株晚花的表型相一致。以上证据表明REM16参与调控了部分开花相关基因的表达，并使得REM16过表达突变体表现为早花性状，REM16基因沉默突变体表现为晚花性状。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。SEQUENCELISTING<110>青岛农业大学<120>拟南芥基因REM16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用<130><160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>861<212>DNA<213>人工序列<400>1atggctgacgatagcgaattgtatcctcgtttcttcaaagtgttcctcgttgaatcggct60tctgaatcgttgatgattccgttgccttttatggcatttcttgctgatccattgccaaag120acagtgaagctccaaggtcttggaggaaaactttggactgtgagcttgaagaaaataagc180ggagctgcgtatcttactagaggatggccaaaattcgcagaggaacatgagctgaagaac240ggagagttcatgacatttgtgtatgatggtcatcgtacctttgaagtgagtgtctttgat300cgttggggtagcaaagaggtcagagctgaaatacaagccataccactttctgattctgat360tctgattctgttgtggaagacgaaaaagactcaactgatgttgttgaagatgatgatgat420gaagatgaagatgaagatgaagatgatgatggtagctttgatgaagatgaagaaatcagc480cagagtctttatccgattgacgaagagactgcaaccgatgctgcagtttttgaagggaac540ttggacgtggaagctttaactaatccacactttccgactacgctcaagaacaggatttat600gaactgttgatcccagccaatgtggtgaaggataataaccttgaatttggttcatccatc660aagtacatcgatggagaaggaaccttagtagggctaagaggaaaatgggctgataagagg720gtttgcttcaaaggatgggacaggatttgcagaaggaacaggctcaaaaagcaccaagat780actgtcgaatgcgagcttcttcatgatgaccagaagatggttcattccatccgagtccat840gtcttgcgtagagatgcttga861<210>2<211>10221<212>DNA<213>人工序列<400>2gaattcccgatctagtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcg60ctatattttgttttctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatcataaaaac120ccatctcataaataacgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaa180cagaaattatatgataatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaacttta240ttgccaaatgtttgaacgatcggggaaattcgagctcactagtggatcctcactaaagac300tagcataatctggaacatcataaggatacatcaatgatgcgtagtcaggcacgtcgtatg360ggtacataagactagcataatctggaacatcataaggatagcccccggggtcgacggtac420cccgctcgacgcgcctcgagatcctctagagtcccccgtgttctctccaaatgaaatgaa480cttccttatatagaggaagggtcttgcgaaggatagtgggattgtgcgtcatcccttacg540tcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttt600tccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatct660tcaacgatggcctttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggagccaccttccttttcc720actatcttcacaataaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttccggat780attaccctttgttgaaaagtctcaattgccctttggtcttctgagactgtatctttgata840tttttggagtagacaagtgtgtcgtgctccaccatgttgacgaagattttcttcttgtca900ttgagtcgtaagagactctgtatgaactgttcgccagtctttacggcgagttctgttagg960tcctctatttgaatctttgactccatggcctttgattcagtgg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