技术领域：
本发明属于医药、保健品
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，更具体地，涉及一种抗凝血肽的制备方法，及其制备得到的小肽和应用。
背景技术：
：血栓是指血液成分在流动过程中，在血管或心脏内膜表面形成一种半凝块状物质，由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。血栓栓塞性疾病是一种常见的心脑血管病，由血栓引起的血管腔狭窄与闭塞，使主要脏器发生缺血和梗死而引发机能障碍，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死和静脉血栓栓塞。血栓栓塞性疾病被称为心脑血管隐形杀手，它可累及全身各个器官及系统，每年大约有3‰人发生不同形式的血栓性疾病，我国每年死于心脑血管疾病的人数达到300万人以上，它导致的死亡人数占全球每年总死亡人数的51%。存活的患者中75％致残，其中40％以上重残，严重威胁人类健康。目前国内外该类型心血管疾病还没有理想的治疗药物，当前国内外临床上防治血栓性心脑血管疾病的药物只要有肝素和水蛭素。前者疗效低，副作用大；后者虽然疗效高，副作用小，但药价高且只能注射给药，较麻烦，经济压力大。因此急需一种高效，副作用小的，成本低的血栓性心脑血管疾病药物适应上述需求。目前研究者对各种生物活性多肽的生物活性功能进行研究。这些生物活性多肽有：抗凝血肽，酪蛋白糖胎，阿片活性肽，免疫调节肽，抗氧化肽，抑制肽等。其中，研究最为深入的是乳源性生物活性肽，已经有几十种具有重要的生理功能的生物活性肽从乳蛋白中被发现。牛奶蛋白中酪蛋白占80%，研究发现，酪蛋白分子中含有若干具有抗凝血酶活性的肽段---抗凝血肽。采用合适的蛋白酶酶解之后，可制备具有抗凝血活性的小肽类物质，制备工艺条件简单，可以节约了分离纯化酪蛋白的大量成本和劳动力。本发明旨在为开发以牛奶作原料的防治血栓性疾病的口服小肽类药物或功能性食品提供理论及实验依据。技术实现要素：本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了一种抗凝血肽的制备方法。本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的小肽。本发明的再一目的在于提供上述小肽在制备血栓性心脑血管疾病药物中的应用。本发明的目的通过以下技术方案实现：一种抗凝血肽的制备方法，将牛奶离心，去除脂肪层，调节pH至5.0~8.0进行酶解反应；所述酶解反应的温度为40~60℃，酶解时间为2~4h；酶解的料水比为1:（1.5~3）；所述酶解反应所需酶的种类为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种。优选地，所述木瓜蛋白酶的酶用量为5000~10000u/mL，所述中性蛋白酶的酶用量为5000~10000u/mL，所述碱性蛋白酶的酶用量为5000~10000u/mL。优选地，所述木瓜蛋白酶的酶用量为6000u/mL，所述中性蛋白酶的酶用量为6000u/mL，所述碱性蛋白酶的酶用量为6000u/mL。优选地，酶解反应所需酶的种类为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。当使用上述三种酶的复合进行酶解反应时，其得到的小肽活性最高。优选地，首先加入中性蛋白酶酶解，然后加入木瓜蛋白酶酶解，最后加入碱性蛋白酶酶解。最优选地，首先加入中性蛋白酶，加入量为6000u/mL，调节pH至6.0，在40℃下酶解反应2h；然后加入木瓜蛋白酶，加入量为6000u/mL，调节pH至5.0，在60℃下酶解反应2h；最后加入碱性蛋白酶，加入量为6000u/mL，调节pH至8.0，在50℃下酶解反应4h。优选地，所述牛奶为水牛奶。水牛奶总的干物质含量比牛奶高了50%左右。具体来说，水牛奶的脂肪含量和蛋白含量皆比牛奶高。特别是脂肪含量，是牛奶的脂肪含量两倍。但是二者的乳糖含量相差不多。水牛奶的钙、磷含量都要比牛奶高，但是其总矿物质含量差不多,而且水牛奶中的酪蛋白含量高于普通牛奶，但酪蛋白不易于被人体直接吸收利用。当用适当的蛋白酶对酪蛋白进行体外水解或在胃肠道消化过程中以及食品加工过程中，小肽的活性就被释放出来-小肽本身以非活性状态存在于蛋白质氨基酸序列中，并可作为生理功能的重要调节剂。当使用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的复合进行酶解反应时，其得到的抗凝血小肽活性最高。与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明提供的制备方法工艺简单，原料易得，制备得到的小肽类物质具有较好的抗凝血活性，可以达到120.5ATU/mL，可以用来弥补肝素类药物的缺陷，本发明以水牛奶作为制备来源，毒副作用小，同时开拓了新鲜牛奶资源加工的新途径，提高牛奶的高附加值，对医学、食品领域的研究具有重要意义。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。实施例1：1、取一定量的水牛奶50mL试管中，置于高速离心机以6000r/min离心，15分钟后，取出，去除上层的脂肪层，得脱脂水牛奶。牛奶脱脂后调pH至10左右煮沸10min，放冷至室温，取10.0mL处理后的脱脂水牛奶于锥形瓶中，加入实施例中各酶溶液，并加入5mL蒸馏水，用0.1mol/L的NaOH或HCl调pH分别为实施例中的pH、温度和酶解时间；水（酶）解完毕后灭酶并用离心机以5000r/min离心20min取上清液，测定抗凝血酶活力。其中实施例1~9中的复合酶解条件见表1所示：其中，实施例7~9中采用的是混合酶解的方式，以实施例7为例，将碱性-木瓜-中性三种酶分别按照6000u/mL的用量混合，然后在50℃，pH为8.0，4h下共同发酵酶解。表1实施例1~9的实验条件实施例编号酶的种类酶解时间(h)温度（℃）pH酶用量(u/mL)实施例1碱性-中性4508.06000实施例2碱性-木瓜4508.06000实施例3中性-碱性2406.06000实施例4中性-木瓜2406.06000实施例5木瓜-碱性2605.06000实施例6木瓜-中性2605.06000实施例7碱性-木瓜-中性4508.06000实施例8中性-碱性-木瓜2406.06000实施例9木瓜-中性-碱性2605.06000实施例10~12中采用复合酶解的方式进行，具体见表2所示，以实施例10为例，首先，将木瓜蛋白酶按照6000u/mL的用量在60℃，pH为5.0，酶解2h后，灭酶；然后加入碱性蛋白酶按照6000u/mL的用量在50℃，pH为8.0，酶解4h后，灭酶；最后再加入中性蛋白酶按照6000u/mL的用量在40℃，pH为6.0，酶解2h，从而完成整个酶解过程。表2实施例10~12的实验条件实施例13：用凝血酶滴定改进法测定水解物的抗凝血酶活力1、配置不同浓度的凝血酶溶液配制含0.05mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HCl溶液，pH7.4，用来配制0.5％纤维蛋白原。配制不同浓度梯度的凝血酶溶液：20NIH/mL（作为基准浓度，即1倍），该溶液5μL为一个滴定体积，即1V，为0.1ATU：20NIH÷（1000μL÷5μL）=20NIH÷200=0.1NIH，因1NIH=1ATU，故0.1ATU=0.1NIH，20NIH/mL（作为基准浓度，即1倍），40NIH/mL（即2倍），100NIH/mL（即5倍），等。2、水解物抗凝血活性测定取几支7.5mm×100mm的小试管，各加入0.5％纤维蛋白原200μL，再各加入水解提取取液50μL，放在37℃恒温水浴锅中5min。2.1取其中一支滴加5倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明50μL水解提取液中含有的抗凝血活性少于0.5ATU。为了准确知道该水解提取液含有的抗凝血活性，再取一支滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于0.1ATU；若1min内不凝固，说明其中抗凝血活性大于0.1ATU，再滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于0.2ATU；若1min内不凝固，说明其中抗凝血活性大于0.2ATU，再滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，直到凝固出现，从而知道该水解提取液的活性。2.2取其中一支滴加5倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内不凝固，说明50μL水解提取液中含有的抗凝血活性多于0.5ATU。再往其中滴加20倍（400NIH/mL）凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于2ATU。此时，应再从水浴锅中取一支试管，滴加5倍凝血酶溶液10μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于1ATU。再取一支滴加5倍凝血酶溶液5μL及1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于0.6ATU；若1min内不凝固，说明其中抗凝血活性多于0.6ATU，往其中滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中水蛭素活性少于0.7ATU。这样继续下去，直到检测出水蛭素萃取液的活性为止。2.3水蛭素活性检测、含量及比活性计算活性用抗凝血酶活性单位(ATU)表示，检测方法为凝血酶滴定改进法。含量按下式计算：U=20C。式中，C为每50μL待测（供试品或对照品）溶液含ATU的单位数，U为每1mL待测溶液含ATU数。2.4抗凝血活性测定结果以下为复合酶组合所水解的水解液及其抗凝血活性的结果测定。表3实施例1~12中的抗凝血活性测定序号组合抗凝血活性(ATU/mL)1碱性-中性71.22碱性-木瓜65.53中性-碱性58.54中性-木瓜72.45木瓜-碱性68.36木瓜-中性70.57碱性-木瓜-中性74.58中性-碱性-木瓜90.69木瓜-中性-碱性69.310木瓜-碱性-中性75.411碱性-中性-木瓜73.512中性-木瓜-碱性120.5由表3可以得出结论：抗凝血活性最高的组合是：中性-木瓜-碱性，其抗凝血活性最高，为120.5ATU/mL。当前第1页1 2 3