一株短杆菌及其用于农田重金属污染原位修复的方法与流程

本发明属于应用微生物学科领域，涉及一株短杆菌，该短杆菌可在高浓度重金属离子存在下存活，将不溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，及该短杆菌用于农田重金属污染原位修复的方法。

背景技术：

我国农田重金属污染严重，现有治理方式主要以化学钝化为主，而相当一部分化学钝化剂(如石灰，硫化钠等)均为杀菌剂，在开展农田重金属污染治理过程中容易杀灭土壤中的土著微生物群落，造成土壤板结，肥力下降等问题。另一方面，我国有74％的耕地土壤缺磷，由于施用的磷肥极易被固化，造成95％及其以上的磷以难以利用的无效形式存在，农田磷肥往往过量投加，进一步造成了土壤的板结。因此，若能利用微生物的解磷能力，将受重金属污染的农田中，因过量磷肥投加而形成的不被利用的磷转化为可溶性磷，一方面可溶性磷可以和重金属形成不溶磷酸盐，原位固化重金属，另一方面可以为植物生长提供缓释而有效的磷。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一株短杆菌属短杆菌菌种，该菌可在高重金属离子浓度存在下，高效地将磷酸钙中的磷释放出来，形成po4^3-，而po4^3-可以和重金属离子如铜、铅、锌等形成不溶金属磷酸盐。

本发明的第二个目的是提供一种可以富集、分离、培养该细菌的培养基。

本发明的第三个目的是提供一种利用该菌原位修复治理农田重金属污染的方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一株短杆菌，该菌的分类命名为短杆菌(brevibacteriumsp.)grinml2，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：cgmccno.13064。

如上所述菌株的菌落特征为：在固体培养基上31℃生长较快，3天后菌落直径为3mm，解磷圈直径为5mm，菌落呈规则圆形，颜色为蓝色，质地致密，透明圈为圆形，紧贴着菌落生长。

如上所述菌株可在高重金属离子浓度存在下，高效的将磷酸钙中的磷释放出来，形成po4^3-，而po4^3-可以和重金属离子如铜、铅、锌等形成不溶金属磷酸盐。

用于富集、分离培养上述短杆菌的培养基，包括：该培养基的配方为：10重量份葡萄糖，5重量份磷酸钙，0.3重量份七水硫酸镁，0.5重量份硫酸铵，0.3重量份氯化钠，0.3重量份氯化钾，0.002重量份硫酸锰，0.03重量份七水硫酸亚铁，1重量份酵母提取物，1000重量份蒸馏水，ph7.0～7.5

上述培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌30min备用。

如上所述短杆菌的富集、分离培养方法，将上述短杆菌菌种接种入如上所述的培养基中，在30-33℃的培养温度下，100rpm摇床培养至菌浓度为10⁸个/ml。

本发明还提供一种利用如上所述短杆菌进行农田重金属污染原位修复的方法，将所述短杆菌的菌种，采用如上所述的方法进行富集培养后，接种至重金属污染农田，接种量为每m³体积2-4l，优选为3l。

当修复效果不好或有新的重金属污染进入农田时，可补加如上所述的培养基。

如上所述短杆菌的获得方法为：

(1)培养基

用于分离菌种的固体培养基：10g/l葡萄糖，5g/l磷酸钙，0.3g/l七水硫酸镁，0.5g/l硫酸铵，0.3g/l氯化钠，0.3g/l氯化钾，0.002g/l硫酸锰，0.03g/l七水硫酸亚铁，1g/l酵母提取物，琼脂20g，0.4％的溴酚蓝6ml，1l水，ph7.0～7.5。

用于富集菌种的液体培养基：10g/l葡萄糖，5g/l磷酸钙，0.3g/l七水硫酸镁，0.5g/l硫酸铵，0.3g/l氯化钠，0.3g/l氯化钾，0.002g/l硫酸锰，0.03g/l七水硫酸亚铁，1g/l酵母提取物，1l水，ph7.0～7.5。

上述培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌30min备用。

(2)菌株的富集分离

本短杆菌分离的原始土壤样品来自于河南省某铅锌矿区周边耕地，该耕地连续三年施用磷肥，选取玉米、花生、豆角、红薯、杨树作物的根际土壤。在离地表10～20cm处，完整挖出植物的根，采用抖根法抖掉块状较大的土块，将完整的根须连同粘连的根须土装入无菌封口袋种，在24h内带回实验室在冰箱于4℃保存备用。

取根须将上面粘连的土用刀片一点点的刮下来，颗粒稍大的碾碎，将从玉米、花生、豆角、红薯、杨树作物的根须土壤收集并混合均匀。准确称量35g的土放入200ml的去离子水中于250ml的锥形瓶，并加入少量的剪碎的根须。300r/min磁力搅拌破碎土壤40min，静置分层。取上清液观察，菌量较少。

取20ml上清液加入到200ml上述液体培养基中，在250ml锥形瓶中在31℃，160r/min的摇床富集培养三天，浓缩至菌液的浓度达到10⁸个/ml，取出摇瓶，取上清液分别进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，六个梯度的稀释。然后取20μl涂布于事先倒好的固体培养基平板上，每个浓度重复三次，于31℃恒温固定床上培养三天，每天观察平板菌落的变化。

(3)菌株分离鉴定

将富集的短杆菌涂布于上述培养基，并挑单菌落进行进一步平板划线。纯化分离后的单菌落利用扫描电镜进行菌种形态观察；采用16srdna克隆文库技术对分离纯菌株进行鉴定，鉴定结果表明该菌株属短杆菌(brevibacteriumsp.)属。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一株短杆菌属短杆菌(brevibacteriumsp.)grinml2菌株，该菌该菌种可在高重金属离子浓度存在下，高效地将磷酸钙中的磷释放出来，形成po4^3-，而po4^3-可以和重金属离子如铜、铅、锌等形成不溶金属磷酸盐。

附图说明

图1为本发明提供的短杆菌(brevibacteriumsp.)grinml2的扫描电镜照片。

图2为本发明提供的短杆菌的解磷效果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明所提供的短杆菌已进行保藏，该菌的分类命名为短杆菌(brevibacteriumsp.)grinml2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：cgmccno.13064。

本发明所述短杆菌的培养方法如下：

首先配制富集培养短杆菌的培养基(液体培养基)：10g/l葡萄糖，5g/l磷酸钙，0.3g/l七水硫酸镁，0.5g/l硫酸铵，0.3g/l氯化钠，0.3g/l氯化钾，0.002g/l硫酸锰，0.03g/l七水硫酸亚铁，1g/l酵母提取物，1l水，ph7.3。

固体培养基：10g/l葡萄糖，5g/l磷酸钙，0.3g/l七水硫酸镁，0.5g/l硫酸铵，0.3g/l氯化钠，0.3g/l氯化钾，0.002g/l硫酸锰，0.03g/l七水硫酸亚铁，1g/l酵母提取物，琼脂20g，0.4％的溴酚蓝6ml，1l水，ph7.0～7.5。

上述培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌30min备用。

本发明所获得的含短杆菌土样，来自于河南省某铅锌矿区周边耕地，该耕地连续三年施用磷肥，选取玉米、花生、豆角、红薯、杨树作物的根际土壤。在离地表10～20cm处，完整挖出植物的根，采用抖根法抖掉块状较大的土块，将完整的根须连同粘连的根须土装入无菌封口袋种，在24h内带回实验室在冰箱于4℃保存备用。

取根须将上面粘连的土用刀片一点点的刮下来，颗粒稍大的碾碎，将从玉米、花生、豆角、红薯、杨树作物的根须土壤收集并混合均匀。准确称量35g的土放入200ml的去离子水中于250ml的锥形瓶，并加入少量的剪碎的根须。300r/min磁力搅拌破碎土壤40min，静置分层。取上清液观察，菌量较少。

取20ml上清液于200ml上述液体培养基与250ml锥形瓶在31℃，160r/min的摇床富集培养三天，菌液的浓度达到10⁸个/ml，取出摇瓶，取上清液分别进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，六个梯度的稀释。然后取20μl涂布于事先倒好的固体平板上，每个浓度重复三次，于31℃恒温固定床上培养三天，每天观察平板菌落的变化，挑取取单菌落培养。

用16srdna克隆文库技术分析鉴定菌种。将单菌落用10ml液体培养基，31℃，160r/min摇床培养三天，所得1ml菌液离心得到菌泥，提取总dna，利用pcr技术以原核生物通用引物530f和1490r扩增16srdna片段。pcr产物纯化后与promega的t-easy载体连接，转化大肠杆菌dh5α。挑取的蓝色菌落通过菌落pcr确定阳性菌落，经酶切分型，对4个克隆测序。所得序列经blast比较表明，该菌株为短杆菌(brevibacteriumsp)属细菌，用扫描电镜观察菌体形态，菌体形态如图1所示。

将鉴定的菌株用前述液体培养基培养至菌浓度10⁸个/ml，连续5天取5ml溶液于离心管中，在25℃，11000r/min离心5min。分别取100μl的上清液按照磷标准曲线的测量步骤测定吸光度，最后通过函数计算可溶性磷浓度的大小。

经过测量连着五天吸光值的为0.187nm、0.190nm、0.210nm、0.241nm、0.254nm，通过函数计算其可溶磷的浓度为78.11mg/l、79.22mg/l、86.62mg/l、98.08mg/l、102.89mg/l，可以看到该菌种有缓慢溶解磷酸钙中磷的能力，如图2所示。

将该菌用前述液体培养基200ml摇瓶培养至菌浓度10⁸个/ml，另设置仅加入200ml培养基不加菌的空白对照摇瓶，在上述两个摇瓶内加入30mgpbcl2，20mgzncl2，10mgcucl2，摇床继续培养20天，发现加菌摇瓶pb浓度降低99％，zn浓度降低95％，cu浓度降低90％，表明该菌可在高重金属浓度下将磷酸钙中的磷释放出来，形成po4^3-，并进一步与重金属形成不溶磷酸盐。

将该菌用液体培养基扩大培养接种入农田，接种量每m³体积3l，一年后测算农田中重金属固化率超过95％，将农田不溶性磷转化为可溶性磷的效果与普通缓释磷肥相当。

从上述实施例可以看出，本发明提供的短杆菌可以将被固定的磷转化为可溶性磷，一方面可溶性磷可以和重金属形成不溶磷酸盐，原位固化重金属，另一方面可以为植物生长提供缓释而有效的磷，减少普通磷肥的用量，减少土壤板结的情况。