与萝卜核雄性不育基因连锁的Indel标记及其应用的制作方法

本发明涉及一种与萝卜核雄性不育基因连锁的Indel标记及其应用，属于生物技术辅助育种领域。

背景技术：

萝卜是典型的异花授粉作物，杂种优势非常明显，利用雄性不育系进行杂交育种可以得到纯度高、性状好的杂交种，且制种过程简单，成本低。雄性不育根据不育基因的遗传方式和在细胞中的定位分为细胞核雄性不育和细胞质雄性不育。目前生产上利用最多的萝卜不育系为Ogura类型的细胞质雄性不育系，单一化的雄性不育种质导致杂交种综合性状难以得到突破性的提高，并存在潜在的生产风险。细胞核雄性不育(GMS)由细胞核不育基因控制，不受细胞质影响，没有正、反交遗传效应。本申请人利用从自然群体中发现了萝卜雄性不育株136A(发表文章《萝卜隐性核雄性不育系136A的选育及其育性研究》山东农业科学.2016,48(7):26-31)；136S(申请号为201610110369.7，发明名称为一种萝卜细胞核雄性不育系及其选育方法)。通过田间育性遗传统计试验证明新发现的雄性不育材料为由一对隐性基因控制的核不育材料，填补了萝卜雄性不育资源中缺乏核不育材料的空白，为萝卜雄性不育系的培育与研究提供了重要的不育源。相对于细胞质雄性不育，核不育系具有育性稳定、恢复源广的优点，但核雄性不育系的保持系只有50％的保持率，繁殖不育系时，需要将所有杂交种子种下后待开花期观察所有植株的花粉有无确定植株的育性，人工拔除50％的可育株以保证剩余植株为不育株。因为不育系的繁殖需要耗费大量的人力、物力和时间，所以，目前核雄性不育没有被广泛利用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与萝卜核雄性不育基因连锁的Indel标记及其应用，可用于辅助选育萝卜核雄性不育系和配套保持系，能够方便、快捷、准确地鉴定出细胞核类型。

为此，本发明所采用的技术方案如下，一种与萝卜核雄性不育基因连锁的Indel标记，所述标记引物的核苷酸序列如下：

正向引物S1-F:5’ATGTTCGTCTCCGGGGTTAT(Seq ID No.1)

反向引物S1-R:5’ACCCGCAAGGAAGAAGAAG(Seq ID No.2)。

所述引物扩增的与萝卜核雄性不育基因连锁的特征条带在保持系中为两条，其核苷酸序列如Seq ID No.3和Seq ID No.4所示；在不育系中为一条，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示。

本发明还提供该与萝卜核雄性不育基因连锁的Indel标记在筛选萝卜核雄性不育种质资源中的应用：

(1)采用所述Indel标记的引物对待选萝卜材料的基因组DNA进行PCR扩增；

(2)对扩增结果进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

(3)从电泳检测结果中即可筛选出萝卜核不育材料和保持系材料：只有一条核苷酸序列如Seq ID No.4所示278bp的特征条带的为不育系材料；同时有SeqID No.3所示302bp的特征条带和Seq ID No.4所示278bp的特征条带的为保持系材料。

所述步骤(1)PCR扩增的反应体系为：

2×MasterMix 5ul

正向引物S1-F：0.5ul

反向引物S1-R：0.5ul

待检测样品DNA 50ng

ddH₂O补至10ul。

PCR扩增的反应的程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

本发明具有如下有益效果：

(1)方便：采用本发明方法只需提取萝卜各植株的DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，根据扩增条带的数量，即可快速鉴定待检测萝卜材料的细胞核类型。

(2)准确：本发明对80份保持系材料和80份不育系材料利用筛选出的Indel标记进行验证，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中，80份保持系材料全部为两条带，80份不育材料全部为一条带，鉴定结果与植株田间育性鉴定结果完全一致，准确率达到100％，表明该标记与不育基因紧密连锁。

(3)快捷：利用本发明的方法，在苗期就可准确鉴定出保持系植株将其苗子剔除。克服了现有技术需要等到开花期观察花粉才能鉴定育性并耗费大量人力、物力和时间的问题。

附图说明

图1为采用本发明所述Indel标记的特异性引物验证78份不同育性的萝卜材料的电泳检测结果；其中：1-39为萝卜保持系单株，40-78为萝卜不育系单株。

图2为萝卜七号染色体Delta Index曲线。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.本发明与萝卜核雄性不育基因连锁的Indel标记的获得

1.1群体材料的准备：

所用材料是本发明人从山东省地方品种中选育出的萝卜核隐性雄性不系136A(136S)与保持系136B(136F)。上述不育系及保持系材料本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。其中136S其保藏号为P201411，保藏单位是中国典型培养物保藏中心。

连续用保持系单株与不育系进行回交至第6代，形成了除不育基因外其它性状基本一致的近等基因系。即在不育基因位点处，保持系植株为杂合状态，不育株基因为纯合状态。

1.2混合群体分离分析

根据混合群体分离分析的原理，以不育系和保持系做两个混池，不育系混池10个样品，保持系混池10个样品，单个样品提取DNA，然后等量混合。采用X10测序，每个混池测序数据量10G。

1.3下机数据过滤比对

数据下机后，对数据进行过滤，去掉低质量，adatper污染的reads。以韩国公布的萝卜基因组序列为参考，运用软件SOAPsnp进行SNP鉴定，并根据深度信息进行过滤(SNP质量>20，depth>5,MaxDepth<150)，得到高质量的SNP变异集合，进行后续的BSA分析。

1.4分布趋势分析

上一步骤分别得到两样品的SNP后，首先筛选二者碱基类型不同的位点，分别计算其SNP－index值(每个位点上支持突变碱基的reads数/位点上总reads数)和index之差－DeltaIndex，以1000kb为窗口，50kb为步移的滑动窗口方法绘制其分布曲线，寻找有SNP－Index差异的区域。其中，七号染色体Delta Index曲线如图2所示。

从上图可以看出，在染色体JRUI02000007.1的0-12M的区域存在比较明显的差异，在此区域S9A(不育系)SNP－index趋近于1，同时F9B(保持系)SNP－index趋近于0.5,两样品的SNP－Index趋势与预期相符，可作为候选区域。根据本研究所用材料为单基因控制的性状，我们认为在1.5-2.5M处更符合要寻找基因的条件。

1.5特异引物设计

在比对较为完整的区域，选取不育系有缺失和插入片段处设计引物，一般缺失和插入要大于6个碱基。依此原则，在候选区域1.5M-2.5M区间内，设计引物40对。

1.6引物筛选

分别提取杂合可育株与纯合不育株各80株DNA，作为模板，对40对引物PCR扩增：

PCR反应体系为10ul，包括

2×MasterMix 5ul

核苷酸引物序列如表1中S1-F所示的上游引物：0.5ul

核苷酸引物序列如表1中S1-R所示的下游引物：0.5ul

待检测样品DNA 50ng

ddH₂O补至10ul

PCR扩增反应的程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选不育基因紧密连锁标记，筛选原则是：在保持系中为两条带，在不育系中为一条带。

经过大量的反应条件优选、对比实验和验证实验，获得与核不育基因紧密连锁的标记引物，其核苷酸序列如表中Seq ID No.1和Seq ID No.2所示：

正向引物S1-F:5’ATGTTCGTCTCCGGGGTTAT

反向引物S1-R:5’ACCCGCAAGGAAGAAGAAG

该引物由华大基因合成，PAGE纯化。

结果显示本发明的引物扩增条带分别在杂合可育株群体内和不育株群体内保持一致，即可育株均为两条带，不育株均为一条带。回收扩增片段测序，序列结果显示如下：

萝卜可育株中

特征条带1(Seq ID No.3)：

TGTTGCAGCCCATAATTTTTTTTACCATTCTTTTGCAACAATCCAAATTCATTTTTATTAATGTCTTTTTTTCTTTTCTTTTTCTTTTACTTTTACTTTTAATTTGCTTTTAGTTTTCTTTATTTTTTTCAAATTTATTTTATGTTTTTCTTTAGGATTGTGTATATTTTGAATTTGACGTTTATTGATTTTATATTTAGCTCTTTTATTGATTTTGTGTTTAATAGTGATGATAAACATATACAAAATAATGCTTATTTTTATGTGATATAGTTACAGAGTAAAAGAACCCGTCCAAACAA

特征条带2(Seq ID No.4)：

TGTTGCAGCCCATAATTTTTTTTACCATTCTTTTGCAACAATCCAAATTCATTTTTATTAATGTCTTTTTTTCTTTTCTTTTTCTTTTACTTTTACTTTTAATTTGCTTTTAGTTTTCTTTATTTTTTTCAAATTTATTTTATGTTTTTCTTTAGGATTGTGTATATTTTGAATTTGACGTTTATTGATTTTGTGTTTAATAGTGATGATAAACATATACAAAATAATGCTTATTTTTATGTGATATAGTTACAGAGTAAAAGAACCCGTCCAAACAA

萝卜核不育株中：

特征条带(Seq ID No.4)：

TGTTGCAGCCCATAATTTTTTTTACCATTCTTTTGCAACAATCCAAATTCATTTTTATTAATGTCTTTTTTTCTTTTCTTTTTCTTTTACTTTTACTTTTAATTTGCTTTTAGTTTTCTTTATTTTTTTCAAATTTATTTTATGTTTTTCTTTAGGATTGTGTATATTTTGAATTTGACGTTTATTGATTTTGTGTTTAATAGTGATGATAAACATATACAAAATAATGCTTATTTTTATGTGATATAGTTACAGAGTAAAAGAACCCGTCCAAACAA

上述特异片段前端为上游引物，末端为下游引物的反向互补序列。

实施例2.本发明与萝卜核雄性不育基因连锁的Indel标记的验证

本实施例以136A与136B回交第7代群体中的39株保持系和39株不育株为试验材料。

萝卜材料总DNA提取方法采用北京天根生化科技有限公司生产的快捷性植物基因组提取试剂盒，提取方法参照说明书。

以提取的DNA为模板，用本发明标记引物S1-F和S1-R进行PCR反应，PCR反应均在Eppendorf基因扩增仪上进行，10ul的PCR反应体系包括，2×MasterMix5ul，上游引物和下游引物分别为0.5ul，待检测样品DNA 50ng，ddH₂O补至10ul；PCR扩增反应的程序为，94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。然后对PCR扩增产物进行电泳检测：6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色；结果如图1所示。1-39号样品均有两条扩增条带，40-78号样品均只有一条扩增带型，可以判定1-39号样品为保持系植株，而40-78号样品为不育系植株。

通过开花期花粉观察，明确1-39号植株为可育株，40-78号植株为不育株，与分子标记鉴定结果完全一致。

进一步为继续验证本发明标记的准确性，扩大试验样本，对80份保持系材料和80份不育系材料利用本发明Indel标记进行验证，结果表明80份保持系材料中全部为两条带，80份不育材料中全部为一条带，且鉴定结果与植株田间育性鉴定结果完全一致，证明用本发明Indel标记筛选鉴定萝卜核不育材料和保持系材料的准确率达到100％，进而可以确定该标记与不育基因紧密连锁。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农作物种质资源中心

<120> 与萝卜核雄性不育基因连锁的Indel标记及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgttcgtct ccggggttat 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acccgcaagg aagaagaag 19

<210> 3

<211> 302

<212> DNA

<213> Raphanus sativus L.

<400> 3

tgttgcagcc cataattttt tttaccattc ttttgcaaca atccaaattc atttttatta 60

atgtcttttt ttcttttctt tttcttttac ttttactttt aatttgcttt tagttttctt 120

tatttttttc aaatttattt tatgtttttc tttaggattg tgtatatttt gaatttgacg 180

tttattgatt ttatatttag ctcttttatt gattttgtgt ttaatagtga tgataaacat 240

atacaaaata atgcttattt ttatgtgata tagttacaga gtaaaagaac ccgtccaaac 300

aa 302

<210> 4

<211> 278

<212> DNA

<213> Raphanus sativus L.

<400> 4

tgttgcagcc cataattttt tttaccattc ttttgcaaca atccaaattc atttttatta 60

atgtcttttt ttcttttctt tttcttttac ttttactttt aatttgcttt tagttttctt 120

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