一种免饲养细胞的杂交瘤细胞液体培养基的制作方法

本申请涉及动物细胞培养技术领域，具体地，涉及杂交瘤细胞培养技术领域，更具体地，涉及一种免饲养细胞的杂交瘤细胞液体培养基。

背景技术：

在杂交瘤细胞的合成过程中，杂交瘤细胞的培养基非常关键。如果培养基的营养不够，即使细胞融合成功产生了杂交瘤细胞，它也不能正常增殖，甚至会很快地死亡。所以很多科研人员都在研究杂交瘤细胞的最适培养基。

目前，即使是最佳的杂交瘤细胞培养基，其生长因子仍然不足，必须在培养空间里添加饲养细胞，因为饲养细胞可以分泌杂交瘤细胞生长需要的许多生长因子。但是饲养细胞的制备和应用有以下瓶颈：首先，饲养细胞制备条件苛刻，稍不注意，容易带进其他污染；其次，制备饲养细胞必须与细胞融合的时间衔接得上，处理不好，就会丧失最佳时机；第三，饲养细胞不利于杂交瘤细胞的生长情况观察。因为饲养细胞生长在杂交瘤细胞的正下方，用倒置显微镜观察时，饲养细胞会阻挡和折射光线，影响观察；第四，饲养细胞容易被经验不足的技术人员误认为是杂交瘤细胞。

因此，本领域需要一种能让杂交瘤细胞迅速增殖，又无需饲养细胞的培养基。

技术实现要素：

本申请提供了一种免饲养细胞的杂交瘤细胞液体培养基，其中，所述杂交瘤细胞液体培养基含有：a、占总体积20％-30％的培养过l929细胞的培养液；b、占总体积20％-30％的培养过c6/36细胞的培养液；c、占总体积8％-20％的胎牛血清。在一些实施方案中，该杂交瘤细胞液体培养基还可含有10ppm的乙基环丙沙星。在一些实施方案中，所述培养过l929细胞的培养液可以是指培养过该细胞，中途没换过液，细胞至少长满底面的90％以上时的培养液。在一些实施方案中，所述培养过c6/36细胞的培养液可以是指培养过该细胞，中途没换过液，细胞至少长满底面的90％以上时的培养液。

本申请还提供了一种免饲养细胞的杂交瘤细胞液体培养基的制备方法，所述方法包括以下步骤：a、分别用细胞培养瓶，按1瓶传4瓶或5瓶的比例，正常传代长满的l929细胞和c6/36细胞；b、当细胞长满后，将两种细胞的培养液分别收集起来，离心将细胞碎片沉淀，再将上清过滤除菌；c、取无菌的试剂瓶，加入各占总体积20％-30％的上步制备的两种细胞培养液各20ml、10ppm的乙基环丙沙星、和占总体积40％-50％的pmi1640或dmem，加入胎牛血清至100％体积；d、摇匀，无菌封装，避光保存。在一些实施方案中，其中，步骤a中，l929细胞使用rpmi1640完全培养基或dmem完全培养基传代，c6/36细胞使用m199完全培养基或mem完全培养基(也可用两者的混合液)传代。在一些实施方案中，其中步骤b的离心可以是以1000rpm的转速进行。在一些实施方案中，其中步骤b的过滤可以是用0.22微米滤膜进行。

本申请通过在培养液里添加各20％-30％的已培养过l929细胞的培养液和已培养过c6/36细胞的培养液，以及添加8％-20％胎牛血清的方法，解决了杂交瘤细胞必须添加饲养细胞才能生长的难题。其中培养过l929和c6/36细胞的培养液，是各自的细胞至少长满90％的生长面积后提取的。

另外在培养基里再添加10ppm的乙基环丙沙星，还可预防普通的细菌和支原体污染。

与现有技术相比，本申请省去了培养饲养细胞的过程，简化了制备杂交瘤细胞的程序，让杂交瘤细胞的合成效果更容易被我们观察到，并让该细胞能够正常的生长和繁殖。

附图说明

图1是刚融合后铺板的细胞

1——融合在一起的细胞

2——小鼠淋巴细胞

3——小鼠骨髓瘤细胞

该图是细胞融合后的影像。因为没有饲养细胞，各种细胞可以看得很清楚。

图2、小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后第6天

该图是融合成功的杂交瘤细胞(不一定是需要的)在本申请的培养基内长成一个个克隆的照片。由此可见，本申请的培养基可以让新融合的杂交瘤细胞正常地生长和繁殖。

图3、小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后第8天

图4、目的杂交瘤细胞再克隆长出的小克隆(直径约262μm)

图5、是图4的细胞克隆逐渐长大后的样子(直径约1600μm)

具体实施方式

下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本发明。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解。

以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。

下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。

实施例一：

按照以下步骤制备本申请的培养基：

1、分别用t75的细胞培养瓶(美国corning)，按1瓶传5瓶的比例，正常传代长满的l929细胞(一种小鼠成纤维细胞，购自昆明动物研究所)和c6/36细胞(一种蚊子细胞，本单位原始留存)，其中l929细胞使用rpmi1640完全培养基(美国gibco)传代，c6/36细胞使用m199完全培养基(美国gibco)传代；

2、当细胞长满，即细胞之间的空隙已被自身细胞占满后，将两种细胞的培养液分别收集起来，用1000rpm的转速将细胞碎片沉淀，再用0.22微米滤膜将上清过滤，并用无菌瓶分开装，装好后4℃存放；

3、取一个100ml无菌的试剂瓶，加入上步制备的两种细胞培养液各20ml；

4、加入10％的乙基环丙沙星溶液(德国bayer)10μl；

5、加入50ml1×rpmi1640(美国gibco)；

6、加入胎牛血清(美国gibco)至100ml；

7、摇匀，无菌封装，4℃避光保存。

实施例二：

按照以下步骤制备本申请的培养基：

1、分别用t75的细胞培养瓶(美国corning)，按1瓶传4瓶的比例，正常传代长满的l929细胞(一种小鼠成纤维细胞)和c6/36细胞(一种蚊子细胞)，其中l929细胞使用dmem完全培养基(美国gibco)传代，c6/36细胞使用m199完全培养基(美国gibco)传代；

2、细胞长满后，将两种细胞的培养液分别收集起来，用1000rpm的转速将细胞碎片沉淀，再用0.22微米滤膜将上清过滤除菌；

3、取一个100ml的无菌的试剂瓶，加入上步制备的两种细胞培养液各20ml；

4、加入10％的乙基环丙沙星溶液(德国bayer)10μl；

5、加入50ml1×dmem(美国gibco)；

6、加入胎牛血清(美国gibco)至100ml；

7、无菌封装，4℃避光保存。

注：以上两个实施例所有步骤都必须使用无菌操作，其中胎牛血清、乙基环丙沙星，以及两者的组合都可以在使用时临时添加。

实施例三：

以制备蓝舌病病毒单克隆抗体为例，将本申请的培养基用于制备分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞。

1、按照常规的方法，用纯化的蓝舌病病毒血清1型抗原(本单位自己保存)多次免疫babl/c小鼠(来自昆明医科大学)，同时按要求用rpmi1640生长液培养sp2/0细胞，条件成熟后，取小鼠的脾淋巴细胞和sp2/0细胞进行融合。其中饲养细胞不用准备。因不是重点，此处不赘述，具体方法参见科学出版社2001年2月第一版《体外培养的原理与技术》第940-946页；

2、给刚刚融合结束的细胞悬液补加rpmi1640生长液至40ml，摇匀后用1000rpm离心10分钟；

3、用本申请实施例一或二所制备好的杂交瘤细胞培养基，还有hat干粉(美国sigma公司产品)，按说明书配制含1×hat的杂交瘤细胞筛选培养基40ml，置于37℃备用；

4、将步骤2离心的好的细胞弃上清，然后用上步配制好的含1×hat的培养基将细胞悬浮起来；

5、将上步的悬浮细胞按每孔0.1ml加到4块96孔细胞培养板里，加盖封闭和标记后，置37℃，饱和湿度，4％二氧化碳的培养箱；

6、3天以后才能观察，以后每2-3天观察一次，必要时照相；

7、到第10天，用本申请实施例一或二所制备好的杂交瘤细胞培养基，还有ht干粉(美国sigma公司产品)，按说明书配制含1×ht的杂交瘤细胞筛选培养基40ml，温至37℃；

8、小心地将4块96孔板里的培养液吸走，然后加入上步配制的含1×ht的杂交瘤细胞筛选培养基，每孔0.1ml，然后置37℃，饱和湿度，4％二氧化碳的培养箱，每2天观察一次，必要时照相；

9、一周后将这4块96孔板里的培养液转移出来，换上本申请实施例一或二所制备好的杂交瘤细胞培养基，且每天观察，必要时照相，直到肉眼可以观察到细胞克隆；

10、给每个长有细胞克隆的板孔进行培养液取样，通过elisa实验检测每一个孔的抗体情况，然后选择抗体为阳性的板孔，把里面的细胞克隆进行独立的扩大培养，并冻存，留一部分进行提纯，然后再扩大培养，再冻存，此处不赘述，具体方法参见科学出版社2001年2月第一版《体外培养的原理与技术》第946-948页；

11、细胞冻存至少1周后，取1只出来复苏，生长正常后，取其培养液进行蓝舌病病毒抗体elisa检测，抗体呈阳性，说明实验取得成功。我们已经获得能分泌蓝舌病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。

在以上的实验过程中，我们对许多重要的实验片段分别进行了影像记录。具体参见附图，其中图1是刚分到96孔板上的细胞混合体，包括小鼠脾淋巴细胞、sp2/0细胞和杂交瘤细胞等；图2是细胞融合后第6天的情形，大部分细胞死亡，少部分细胞(包括杂交瘤细胞)在繁殖；图3是细胞融合后第8天的情形，其中能繁殖的细胞不断增多；图4是杂交瘤细胞再次提纯筛选过程中产生的一个小克隆，该克隆的直径约为262μm；图5是图4的细胞小克隆长成大克隆后的情形，大克隆的直径约为1600μm。

以上实验，从融合细胞分板至实验结束都一直在使用本申请的培养基，由此可见，在杂交瘤细胞的制备过程中，用本申请的培养基培养杂交瘤细胞是完全可行的，可免去制备饲养细胞的过程。

综上所述，以上仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围，因此，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。