猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT‑PCR检测方法及其应用与流程

本发明属于微生物检测领域，涉及猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的检测，具体涉及猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法及其应用。

背景技术：

猪Delta冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型猪冠状病毒，属于冠状病毒科、冠状病毒属成员，是具有囊膜的单股正链RNA病毒。2012年，香港学者Woo首次报道在猪粪便中检测到PDCoV，同时在其他哺乳动物和鸟类上也检测到该病毒。至2014年初，美国俄亥俄州仔猪腹泻病料中也检测到PDCoV。PDCoV患病猪临床症状为严重腹泻、呕吐、脱水、仔猪致死率高剖检变化可见小肠上皮细胞有损伤。随后在加拿大、韩国、越南、老挝等国家也报道检测到PDCoV，其阳性检出率高达25％。2015年对我国华东地区猪场进行检测，也发现该病毒，说明我国大陆猪群中也存在PDCoV的感染。在随后的报道中，安徽、广西、河北、江苏等地区病料检测结果显示PDCoV已在我国至少存在了11年。

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪腹泻类疾病，各种年龄段、各个品种的猪均可感染此病。1971年首次在英国发现PED；我国于1976年首次报道了该病，在1980年第一次证实分离到PEDV，到2000年该病已经在全国范围内开始流行。特别是从2010年起，PED在我国的猪群中呈暴发性流行，给我国的养猪业带来了极大的经济损失；2013年春PED在美国首次暴发，哺乳仔猪的发病率高达90％；随后，PEDV也在加拿大和墨西哥等地流行。目前PED给世界范围内各国养猪业带来不可计数的经济损失，PEDV已成为危害全球养猪业发展的重要病原。本实验室从2014年10月起，对来自河南省不同地区的仔猪、母猪的疑似样品进行PDCoV和PEDV病原检测，发现部分猪场PDCoV和PEDV混合感染且情况严重。临床上PDCoV感染的仔猪主要表现为水样腹泻、呕吐和脱水等症状，和PED的临床症状非常相似，单靠临床症状和剖检病理变化很难区分这两种疾病。因此建立快速检测PEDV和PDCoV的方法对确诊这两种疫病显得尤为重要。

目前，针对PEDV的诊断方法很多，如病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体技术、SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法、常规PCR方法以及核酸探针技术等。但是，这些诊断方法存在或敏感性、特异性，或操作技术复杂、费时费力等缺点，且诊断结果滞后，如病毒分离鉴定费时费力耗时长、血清学方法敏感性低不能早期检测、普通PCR技术不能对病毒定量等缺点。新发的PDCoV检测方法还比较少见，2015年Anil Thachil等建立了间接ELISA方法用于血清中PDCoV的追溯性检测，结果显示PDCoV早在2014年就在美国猪群中存在。逢凤娇等建立的PDCoV常规RT-PCR检测方法，最低检测限为4.05×10³拷贝/μL。然而不能满足临床上PEDV和PDCoV混合感染的快速检测。

PDCoV和PEDV都是目前引起仔猪腹泻的主要病原，都能够引起仔猪不同程度的腹泻，在猪群中具有传播快、感染率高、流行范围广等特点，每年给养猪业造成了巨大的经济损失。特别是PEDV和PDCoV混合感染情况比较普遍，通过观察临床症状和病理变化很难区分这两种病原，给临床检测和控制这两种疾病造成了很大的困难。

技术实现要素：

本发明为解决快速检测PEDV和PDCoV这两种疫病混合感染的技术难题，根据GenBank中收录的PDCoV毒株HKU15-155(JQ065043)M基因和PEDV毒株CHLY-09(KF476053)ORF3基因序列设计了特异性引物，在此基础上建立并完善了能同时准确检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光RT-PCR检测方法，公开了猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法及其应用。

为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)猪Delta冠状病毒上、下游引物和猪流行性腹泻病毒上、下游引物的设计；

(2)双重实时荧光体系的准备；

(3)双重实时荧光检测方法的实施。

所述步骤(1)中，猪Delta冠状病毒的上游引物如SEQ ID NO：1所示，猪Delta冠状病毒的下游引物如SEQ ID NO：2所示；猪流行性腹泻病毒的上游引物如SEQ ID NO：3所示，猪流行性腹泻病毒的下游引物如SEQ ID NO：4所示。

所述步骤(2)中，双重实时荧光体系为Premix Ex Taq^TM I 13μL，25pmol/μL的猪Delta冠状病毒的上游引物、25pmol/μL的猪Delta冠状病毒的下游引物各0.5μL，25pmol/μL的猪流行性腹泻病毒的上游引物、25pmol/μL的猪流行性腹泻病毒的下游引物各0.5μL，样品模板2μL，用ddH₂O补足25μL体系。

所述步骤(3)中双重实时荧光检测方法为，将步骤(2)中的双重实时荧光体系，置于荧光定量PCR仪中，设定PCR程序为95℃30s，94℃5s，55℃40s，72℃40s，共进行35个循环，通过溶解曲线确定猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的检测结果。

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法，作为同时检测猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明利用双重荧光RT-PCR检测方法，对采集于河南不同猪场的198份腹泻仔猪样品进行检测，大致掌握猪流行性腹泻和新发猪冠状病毒病在河南地区的感染情况。为检测PEDV和PDCoV提供了一种新的方法，同时为规模化猪场净化PEDV和PDCoV这两种病毒提供了方法，也为PEDV和PDCoV分子流行病学调查、早期诊断、诊断试剂盒的研制与开发奠定了理论依据和技术支持。本发明的公开为临床诊断和防治PEDV和PDCoV提供了有力的技术支持，也为该类疫病的分子流行病学和防控研究奠定了基础。

2、本发明成功的建立了PDCoV和PEDV双重SYBR Green I荧光RT-PCR检测方法，能够同时快速、特异性的检测到PEDV和PDCoV这两种病毒，该方法具有良好的特异性、重复性和敏感性，运用该方法对临床198份仔猪腹泻样品进行检测，结果与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一致，符合率为100％。

3、本发明从2015年1月至2016年3月从河南省不同地区的腹泻猪群中收集的样品，应用所建立的双重荧光PCR方法对其进行PDCoV和PEDV检测，PDCoV阳性率为20.7％，PEDV阳性率为29.8％，PEDV和PDCoV混合感染阳性率为8.6％，其检测结果可以反映出河南省部分猪场存在PDCoV和PEDV感染。

附图说明

图1为PDCoVM基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M:DL2000Maker；1：PDCoV M基因PCR扩增结果；2：阴性对照。

图2为PEDV ORF3基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳，其中M:DL2000Maker；1：PEDV ORF3基因PCR扩增结果；2：阴性对照。

图3为荧光RT-PCR扩增曲线图。

图4为双重SYBR Green I荧光RT-PCR反应溶解曲线图。

图5为双重SYBR Green I荧光RT-PCR反应特异性试验溶解曲线图。

图6为不同浓度重复性试验溶解曲线图，其中A为浓度10⁴拷贝/μL的重组质粒，B为浓度10⁵拷贝/μL的重组质粒，C为浓度10⁶拷贝/μL的重组质粒，D为浓度10⁷拷贝/μL的重组质粒。

具体实施方式

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)猪Delta冠状病毒上、下游引物和猪流行性腹泻病毒上、下游引物的设计；

(2)双重实时荧光体系的准备；

(3)双重实时荧光检测方法的实施。

所述步骤(1)中，猪Delta冠状病毒的上游引物如SEQ ID NO：1所示，猪Delta冠状病毒的下游引物如SEQ ID NO：2所示；猪流行性腹泻病毒的上游引物如SEQ ID NO：3所示，猪流行性腹泻病毒的下游引物如SEQ ID NO：4所示。

所述步骤(2)中，双重实时荧光体系为Premix Ex Taq^TM I 13μL，25pmol/μL的猪Delta冠状病毒的上游引物、25pmol/μL的猪Delta冠状病毒的下游引物各0.5μL，25pmol/μL的猪流行性腹泻病毒的上游引物、25pmol/μL的猪流行性腹泻病毒的下游引物各0.5μL，样品模板2μL，用ddH₂O补足25μL体系。

所述步骤(3)中双重实时荧光检测方法为，将步骤(2)中的双重实时荧光体系，置于荧光定量PCR仪中，设定PCR程序为95℃30s，94℃5s，55℃40s，72℃40s，共进行35个循环，通过溶解曲线确定猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的检测结果。

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法，作为同时检测猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒的应用。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明：

1材料与方法

1.1病毒株及病料

PDCoV(CH-01株)、猪流行性腹泻病毒(PEDV，HN-2012株)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性病料、猪圆环病毒II型(PCV2)阳性病料和猪伪狂犬病毒(PRV)阳性病料均由河南省动物源性食品安全重点实验室鉴定并保存；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗购自哈尔滨维科生物技术公司；临床腹泻样品于2015年1月至2016年3月采集自河南省不同地区的腹泻猪群。

1.2主要试剂及仪器

反转录试剂盒购自QIAGEN生化科技公司(北京)；18-T载体、DH5α感受态细胞、Premix Ex Taq^TM I购自宝生物工程(大连)有限公司；2×Taq DNA MasterMix、2 000bpDNA ladder marker购自康为世纪生物科技有限公司(北京)；96实时荧光定量PCR仪购自Roche公司(瑞士)。

1.3引物设计与合成

根据Genbank中登录的PDCoV毒株HKU15-155(JQ065043)、PEDV毒株CHLY-09(KF476053)为参照序列，应用Primer Premier 5.0基因分析软件设计扩增PDCoVM基因、PEDV ORF3基因的上游引物和下游引物，预计扩增片段为353bp和276bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用双蒸水稀释为25pmol/μL，-20℃保存。猪Delta冠状病毒的上游引物如SEQ ID NO：1所示，猪Delta冠状病毒的下游引物如SEQ ID NO：2所示；猪流行性腹泻病毒的上游引物如SEQ ID NO：3所示，猪流行性腹泻病毒的下游引物如SEQ ID NO：4所示。

1.4核酸提取及反转录

病毒悬液和临床样品于-20℃反复冻融3次后用于病毒核酸的提取。参照TRIzol提取总RNA说明书提取PDCoV、PEDV、PRRSV等病毒总RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，-20℃保存；按常规的蛋白酶K法抽提取PRV、PCV2的DNA，-70℃保存。

1.5质粒模板标准品的制备

以PDCoV、PEDV的cDNA为模板，进行常规PCR扩增，目的条带与pMD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，挑取白色菌落培养后提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序正确的阳性质粒用分光光度仪测定浓度后进行10倍系列稀释，并根据标准质粒的浓度进行分析，计算每微升质粒基因拷贝数，用于构建标准曲线。进行双重荧光RT-PCR扩增。

1.6双重实时荧光方法的建立

采用SYBR Premix Ex Taq推荐的反应体系，用96型荧光定量PCR仪检测。反应体系：Premix Ex Taq^TM I 13μL，P1、P2引物各为0.5μL，P3、P4引物各为0.5μL，pMD-18T-PDCoV和pMD-18T-PEDV各为1μL，ddH₂O 8μL，总反应体系为25μL。反应条件为:反应条件：95℃30s，94℃5s，55℃40s，72℃40s，共进行35个循环。设定程序在每个循环第2个步骤采集荧光信号，最后由软件自动生成扩增动力学曲线图和标准曲线。反应后得到样本的阈值循环数(Ct)值，根据标准曲线计算样品中含有的基因拷贝数。

1.7确定双重荧光PCR的最优反应条件

以制备的PDCoV和PEDV质粒标准品作为模板，分别选用52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃的退火温度及0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL 25pmol/μL的上下游引物浓度进行预实验，通过比较不同温度不同浓度的上下游引物组合优化实验体系，最终通过矩阵法优选出最佳工作浓度，另外，对双重实时荧光PCR的反应条件进行摸索，确定最优变性温度和退火温度。

1.8特异性试验

按照双重SYBR Green I荧光RT-PCR反应体系，分别加入TGEV、PRRSV cDNA 1μL(约20ng)，PCV2、PRV DNA 1μL(约20ng)，PDCoV和PEDV的阳性质粒1μL(约20ng)，灭菌水作阴性对照，应用所建立的双重SYBR Green I荧光PCR方法对其进行扩增。

1.9重复性试验

以不同浓度的重组质粒为模板进行双重SYBR Green I荧光RT-PCR反应，每一个浓度重复三次；对PDCoV和PEDV的Cq值和溶解曲线进行分析，验证双重SYBR Green I荧光RT-PCR方法的重复性。

1.10敏感性试验

用紫外分光光度计测量PDCoV和PEDV的重组质粒的OD₂₆₀值，计算每微升的拷贝数，然后用灭菌水10倍梯度稀释，以倍比稀释的标准品为模板进行双重SYBR Green I荧光RT-PCR反应，确定双重SYBR Green I荧光RT-PCR反应检测PDCoV和PEDV的敏感性，同时设ddH₂O为阴性对照。

1.11临床仔猪腹泻样品的检测

采取河南省鹤壁、开封、平顶山等不同猪场的198份腹泻仔猪的小肠内容物及粪便，用PBS处理病料后，提取RNA反转录后分别用建立的双重荧光RT-PCR方法、单重荧光定量RT-PCR方法进行检测。

2结果

2.1PDCoV、PEDV阳性质粒标准品的制备

用PDCoV和PEDV引物分别对PDCoV和PEDV cDNA进行PCR扩增，取5μLPCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测，分别扩增出PDCoV 353bp、PEDV 276bp左右的片段，与预计的片段大小一致(图1、图2)，测序后分别与国内外流行的PDCoV和PEDV毒株的相应片段进行序列分析，其核苷酸同源性为100％。将所得目的片段与PMD18-T载体连接构建成为重组质粒，分别命名为pMD-18T-PDCoV和pMD-18T-PEDV。测得PDCoV的重组质粒的浓度为95.5μg/mL，PEDV的重组质粒浓度为128.8μg/mL，经计算pMD-18T-PDCoV质粒浓度为2.86×10¹⁰拷贝/μL，pMD-18T-PEDV质粒浓度为9.96×10¹⁰拷贝/μL。

2.2双重荧光RT-PCR反应条件优化结果

通过正交法对不同浓度引物、退火温度、酶浓度进行筛选、比较、优化，确定最佳的反应体系为：Premix Ex Taq^TMI 15μL，P1、P2引物各为0.5μL，P3、P4引物各为0.5μL，pMD-18T-PDCoV和pMD-18T-PEDV各为1μL，ddH₂O 6μL，总体积为25μL。扩增反应条件为：95℃30s；95℃5s、58℃30s、72℃30s，共进行35个循环。PDCoV和PEDV扩增曲线均能产生特异性的单一峰值，阴性对照无峰值产生；扩增动力学曲线如(图3)。

2.3双重SYBR Green I荧光RT-PCR方法溶解曲线及TM值的确定

按照优化后的扩增条件，以PDCoV和PEDV的重组质粒为模板，进行双重荧光RT-PCR扩增，经96软件分析后得到溶解曲线(图4)，从图中可以看出两个特异性的峰值，经过多次重复后，最终确定了PDCoV的TM值是85.6℃，PEDV的TM值是81.5℃，阴性对照无峰值。

2.4特异性试验结果

从PDCoV和PEDV双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR特异性试验结果(图5)得出，PDCoV和PEDV双重荧光RT-PCR有特异性的双峰，TM值分别是85.6℃和81.5℃。阴性对照和TGEV、PRRSV、PCV2、PRV均无荧光信号。

2.5重复性试验结果

以10⁴～10⁷拷贝/μL重组质粒为模板进行双重SYBR Green I荧光RT-PCR扩增，每个浓度重复3次，结果表明PDCoV和PEDV的TM值的变异系数低于1％，而阴性对照无峰值(表1，图6)，说明不同浓度的双重SYBR Green I荧光RT-PCR方法稳定性很好。

表1双重SYBR Green I荧光RT-PCR不同浓度重复性试验分析

2.6敏感性试验结果

以相同体积的PDCoV和PEDV的10⁰～10⁴拷贝/μL重组质粒为模板进行双重SYBR Green I荧光RT-PCR扩增，每个浓度重复3次。结果表明PDCoV重组质粒的最低检测到28.6拷贝/μL，PEDV重组质粒的最低检测到99.6拷贝/μL。

2.7临床腹泻样品检测结果

用双重荧光RT-PCR方法和单重荧光定量RT-PCR方法两种方法对198份临床腹泻样品进行检测，结果显示，PDCoV阳性样品41份，阳性率为20.7％，PEDV阳性样品59份，阳性率为29.8％；同时检测出PEDV和PDCoV的样品17份，阳性率为8.6％。与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样，符合率100％(表2)。

表2双重荧光RT-PCR和单重荧光定量RT-PCR临床检测结果

3讨论

PDCoV和PEDV都是目前引起仔猪腹泻的主要病原，都能够引起仔猪不同程度的腹泻，在猪群中具有传播快、感染率高、流行范围广等特点，每年给养猪业造成了巨大的经济损失。特别是PEDV和PDCoV混合感染情况比较普遍，通过观察临床症状和病理变化很难区分这两种病原，给临床检测和控制这两种疾病造成了很大的困难。本发明以PDCoVM基因和PEDV ORF3基因为目的序列，建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR Green I双重荧光RT-PCR方法，并将所建立的双重荧光方法对临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PDCoV检测，结果显示本研究建立的双重荧光RT-PCR方法能同时准确地检测PDCoV和PEDV，这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定了基础。

目前，针对PEDV的诊断方法很多，如病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体技术、SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法、常规PCR方法以及核酸探针技术等。但是，这些诊断方法存在或敏感性、特异性，或操作技术复杂、费时费力等缺点，且诊断结果滞后，如病毒分离鉴定费时费力耗时长、血清学方法敏感性低不能早期检测、普通PCR技术不能对病毒定量等缺点。SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法具有敏感度高，特异性强等特点，但是单重方法对于检测因多种病毒引起的腹泻来说，经常会耽误检测时间，因此建立同时检测两种疾病的方法对于临床具有重要的意义。新发的PDCoV检测方法还比较少见，2015年Anil Thachil等建立了间接ELISA方法用于血清中PDCoV的追溯性检测，结果显示PDCoV早在2014年就在美国猪群中存在。逢凤娇等建立的PDCoV常规RT-PCR检测方法，最低检测限为4.05×10³拷贝/μL。然而不能满足临床上PEDV和PDCoV混合感染的快速检测。本发明建立的双重荧光PCR方法可以在一个反应体系中同时检测出PEDV和PDCoV，且具有较好的特异性和敏感性，可以应用于临床上这两种病原的快速检测。

目前国内外还未见同时检测PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光RT-PCR方法的相关报道，因此本发明根据PDCoVM基因和PEDV ORF3基因序列分别设计了特异性引物，建立了能过同时检测PEDV和PDCoV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，最低检测到PDCoV和PEDV分别28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度，敏感性是普通RT-PCR方法的300倍,检测不到其他病毒。试验中利用TM值的不同对目的核酸进行区分，核酸片段的TM值主要与目的片段的GC含量、序列长度和序列结构有关系。在本发明中所设计的PDCoV的目的基因GC含量相对设计的PEDV的GC含量较高，并且两者目的片段的长度不同，故PEDV和PDCoV的TM值可以很好的区分。这两种病毒的TM值在一定的范围内变动，PEDV的TM值变化范围为81.2～81.9℃，PDCoV的TM值变化范围为85.4～85.9℃，由此可以利用溶解曲线的两个特异峰对应的TM值进行这2重的鉴别与诊断。

2010年以来，PED在我国多省猪群中以一种新的流行特点暴发，发病严重、致死率高2015年3月，在中国江西仔猪爆发流行性腹泻，通过PCR检测到PDCoV。Song等通过巣式RT-PCR检测中国江西的腹泻猪，结果表明PDCoV单独感染率为33.71％，PDCoV和PEDV混合感染率为19.66％，证实在中国江西爆发的腹泻病猪上PDCoV具有很高的检出率。Dong等对我国江苏、安徽、湖北等地的仔猪腹泻情况调查显示PDCoV阳性率可达6.51％，PEDV阳性率可达51.2％。本次试验中所检测的病料是本实验室从2015年1月至2016年3月从河南省不同地区的腹泻猪群中收集的样品，应用所建立的双重荧光PCR方法对其进行PDCoV和PEDV检测，PDCoV阳性率为20.7％，PEDV阳性率为29.8％，PEDV和PDCoV混合感染阳性率为8.6％，其检测结果可以反映出河南省部分猪场存在PDCoV和PEDV感染。

4结论

本发明成功的建立了PDCoV和PEDV双重SYBR Green I荧光RT-PCR检测方法，能够同时快速、特异性的检测到PEDV和PDCoV这两种病毒，该方法具有良好的特异性、重复性和敏感性，运用该方法对临床198份仔猪腹泻样品进行检测，结果与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一致，符合率为100％。该方法为检测PEDV和PDCoV提供了一种新的方法，同时为规模化猪场净化PEDV和PDCoV这两种病毒提供了方法，也为PEDV和PDCoV分子流行病学调查，发病机制，早期诊断，诊断试剂盒的研制与开发奠定了理论依据和技术支持。

<110> 河南农业大学

<120> 猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> misc_difference

<222> （1）…（18）

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<222> （1）…（22）

<400> 4

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