热激蛋白Hsp17.6CII在调控植物耐盐碱中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及热激蛋白hsp17.6cii在调控植物耐盐碱中的应用。

背景技术：

植物受到各种非生物胁迫时,细胞内的活性氧水平升高,通过信号级联系统传递信号,调控基因表达,促进植物对胁迫应答。但是，升高的活性氧需要及时被降解，以免对植物自身造成损伤。过氧化氢酶(cat)通过降解h2o2调控细胞内活性氧的含量,参与到植物对逆境的响应过程中。在多种植物中都发现,cat和盐胁迫有关，盐胁迫处理下,过氧化氢酶的活性升高，例如在水稻中过量表达大肠杆菌的过氧化氢酶kate会提高水稻对盐胁迫的耐受性。同时cat也参与到光胁迫的响应中。在光照强度较高时,过氧化氢酶cat2突变体中光呼吸作用大量产生的h2o2不能及时被清除,细胞内活性氧平衡遭到破坏,使cat2表现出明显的细胞死亡表型,叶片出现卷曲黄化；但提高co2浓度可以将cat2的表型完全恢复，表明过氧化氢酶cat2参与到拟南芥光呼吸过程中产生的h2o2的清除作用。此外,过氧化氢酶cat也参与到植物对干旱的响应过程中。在小麦中,严重的干旱会使过氧化氢酶cat的活性升高,同时,干旱会引起过氧化氢酶cat1和cat2转录下降,并且影响过氧化氢酶cat1和cat2的昼夜表达节律。以上研究结果都表明,cat参与了植物响应各种外界胁迫的过程中，并且逆境胁迫下过氧化氢酶活性的维持也同样十分重要。

小分子热激蛋白shsps是一组分子量为12-43kd，并且在c端含有一个保守的acd结构域的一类蛋白。小分子热激蛋白shsps具有分子伴侣的功能，在逆境胁迫条件下，小分子热激蛋白shsps会形成大量的寡聚物，这些shsps聚合体与目标蛋白结合以防止目标蛋白的损伤，小分子热激蛋白与hsp100/hsp70和hsp60相互作用，保持目标蛋白的三维构象，保持其生物学功能。小分子热激蛋白最初发现被热胁迫诱导，现在已表明它在生物体内广泛分布，多种非生物逆境胁迫都会诱导shsps的表达，shsps的表达水平与植物的多种抗逆性密切相关。

据报道，目前我国存在盐碱化的土地面积几乎与我国可耕地面积相当，每年造成经济损失不可估量，并且盐碱化土地每年还在以很高的速度增加，每年会有大量土地因为耕作不善而退化为不适宜作物生长的盐碱地。如何改良作物，使农作物可以耐受盐碱地并且不影响作物的产量和品质，成为了亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在如下a-d中至少一种中的应用：

a、调控植物耐盐性和/或耐碱性；

b、调控cat酶的活性；

c、调控cat酶在热胁迫下发生聚集；

d、维持cat酶在热胁迫下的折叠状态；

1)蛋白hsp17.6cii；

2)蛋白hsp17.6cii编码核酸分子；

3)含有蛋白hsp17.6cii编码核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明另一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的另一个用途。

本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在培育耐盐性和/或耐碱性提高的植物中的应用：

1)蛋白hsp17.6cii；

2)蛋白hsp17.6cii编码核酸分子；

3)含有蛋白hsp17.6cii编码核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述应用中，所述蛋白hsp17.6cii为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述应用中，所述蛋白hsp17.6cii编码核酸分子是如下1)至3)中任一所述的dna分子：

1)序列表中序列1所示的dna分子；

2)在严格条件下与1)所限定的dna分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子；

3)与1)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子。

上述应用中，所述调控植物耐盐性和/或耐碱性为提高植物耐盐性和/或耐碱性；

或所述调控cat酶的活性为提高cat酶的活性，具体为提高cat酶的水解h2o2的活性。

或所述调控cat酶在热胁迫下发生聚集为抑制cat酶在热胁迫下发生聚集。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

或，所述双子叶植物具体为豆科植物或十字花科植物。

本发明第三个目的是提供一种培育耐盐性和/或耐碱性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为提高目的植物中蛋白hsp17.6cii活性，得到转基因植物；

所述转基因植物的耐盐性高于所述目的植物；

和/或，所述转基因植物的耐碱性高于所述目的植物。

上述方法中，所述提高目的植物中蛋白hsp17.6cii活性为将蛋白hsp17.6cii编码核酸分子导入目的植物中。

上述方法中，所述蛋白hsp17.6cii为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质；

或，所述蛋白hsp17.6cii编码核酸分子是如下1)至3)中任一所述的dna分子：

1)序列表中序列1所示的dna分子；

2)在严格条件下与1)所限定的dna分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子；

3)与1)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为豆科植物或十字花科植物。

本发明的实验证明，将hsp17.6cii基因过表达到野生型拟南芥col-0、突变体nca1-3或cat2cat3中得到的转基因植物，转入col-0的转基因植物对盐碱的耐性高于野生型拟南芥col-0，转入突变体nca1-3或cat2cat3中得到的转基因植物的表型与未转基因前的nca1-3或cat2cat3拟南芥无显著差异，从而证明，hsp17.6cii可以通过调控cat提高植物对盐碱的耐性；另外，热激蛋白hsp17.6cii在提高cat酶的活性且抑制cat酶在热胁迫下发生聚集。

附图说明

图1为热激蛋白hsp17.6cii与过氧化氢酶cat相互作用分析。

图2为热激蛋白hsp17.6cii保持cat2蛋白的活性和稳定性。

图3为hsp17.6cii基因在植物在盐碱胁迫下的表型分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，除特殊说明外，定量试验均设5个以上的重复实验。

实施例1、热激蛋白hsp17.6cii在调控过氧化氢酶活性中的应用

一、热激蛋白hsp17.6cii与过氧化氢酶cat相互作用

体外和体内实验验证hsp17.6cii与cat相互作用。

在大肠杆菌原核系统单独表达拟南芥过氧化氢酶cat，或者cat与his-hsp17.6cii共表达，然后用特异结合his标签的填料亲和层析hsp17.6cii蛋白，分别用anti-his和anti-cat2抗体检测hsp17.6cii和cat2蛋白，体外证明hsp17.6cii可以和过氧化氢酶cat相互作用(图1a)。

用免疫共沉淀的方法检测体内hsp17.6cii与cat相互作用。在hsp17.6cii-6myc过表达的拟南芥材料中用特异结合myc标签的beads免疫沉淀hsp17.6cii蛋白，分别用anti-his和anti-cat2抗体检测hsp17.6cii及共沉淀的cat2蛋白，体内证明hsp17.6cii可以和过氧化氢酶cat相互作用(图1b)。

二、热激蛋白hsp17.6cii保持cat2蛋白的活性和稳定性

1、hsp17.6cii可以激活cat2水解h2o2的活性

分别纯化在大肠杆菌原核系统表达的hsp17.6cii(氨基酸序列为序列2)与his-cat2重组蛋白(序列3)，检测cat2蛋白降解h2o2的活性，以之前报道的过氧化氢酶cat激活重组蛋白his-nca1(序列4)为正对照。

使用碧云天过氧化氢酶检测试剂盒(产品编号:s0051)检测cat2蛋白降解h2o2的活性，具体方法如下：

配置过氧化氢溶液：

试剂盒中的过氧化氢浓度约为1m,由于过氧化氢易降解,使用前需要将此过氧化氢稀释100倍,测定a240。根据公式计算过氧化氢浓度(mm)＝22.94×a240。根据计算出的过氧化氢实际浓度配置浓度为250mm、5mm的过氧化氢溶液备用。

配制显色工作液：

将试剂盒中的显色底物在冰上溶解,分装,按照1:1000的比例加入过氧化物酶,混合均匀得到显色工作液。

样品制备：

将重组蛋白his-nca1，his-cat2和hsp17.6cii蛋白用ni-ntaagarose进行纯化。所有蛋白均换至50mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液中,使样品蛋白终浓度定到1μg/μl。

测定过氧化氢标准曲线：

(1)取0、12.5、25、50、70μl配制好的5mm过氧化氢溶液至1.5ml离心管中,分别加入检测缓冲液,至最终体积为100μl,混匀。

(2)将上步配置的过氧化氢溶液各取4μl,加入到96孔板中。再加入200μl显色工作液。25℃至少孵育15-45分钟,测定a520。

样品测定：

(1)取1-10μl样品至1.5ml离心管中,加入检测缓冲液,最终体积为40μl,混匀。再加入10μl250mm过氧化氢溶液,用移液器迅速混匀。室温反应3分钟。

(2)加入450μl反应终止液,颠倒混匀以终止反应。在终止反应后15分钟内完成下面的步骤。

(3)在一个新的离心管内加入40μl检测缓冲液,再加入10μl上一步中的混合液,混匀。

(4)从上一步骤的50μl体系中取10μl加入到96孔板内。加入200μl显色工作液。

(5)25℃至少孵育15分钟后测定a520,但孵育时间不能超过45分钟。

计算：

(1)计算出标准曲线。

(2)根据标准曲线计算出样品中残余的过氧化氢摩尔数。

(3)样品过氧化氢酶酶活力(unit)＝反应消耗过氧化氢量(μmol)×250/(3×样品体积×蛋白浓度)。1个酶活力单位(1unit)指在25℃,ph7.0的条件下,在1分钟内可以催化分解1微摩尔过氧化氢。

结果如图2a所示，与his-cat重组蛋白相比，hsp17.6cii可以激活cat2水解h2o2的活性。

2、热激蛋白hsp17.6cii保持cat2蛋白的稳定性

hsp17.6cii可以激活cat2水解h2o2的活性，那么hsp17.6cii是否通过与cat相互作用影响了cat的蛋白折叠状态或热聚集，具体检测方法。

检测方法：将重组蛋白his-nca1(序列4)，his-cat2(序列3)和hsp17.6cii蛋白(序列2)均溶解于50mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液中，得到不同的蛋白溶液，各个溶液的浓度均为1μmol。

具体分为如下几组：

cat2组：将10μl浓度为1μmol的his-cat2蛋白溶液加在190μl的反应缓冲液(40mmhepes,ph7.5)中,检测45℃下340nm处的吸收值；

cat2+bsa组(1：10)：将10μl浓度为1μmol的his-cat2蛋白溶液和10μl浓度为10μmol的bsa加在180μl反应缓冲液(40mmhepes,ph7.5)中,检测45℃下340nm处的吸收值；

cat2+nca1(1：1)组:将10μl浓度为1μmol的nca1蛋白溶液和10μl浓度为1μmol的his-cat2蛋白溶液加在180μl反应缓冲液(40mmhepes,ph7.5)中,检测45℃下340nm处的吸收值；

cat2+nca1(1:5)组:将10μl浓度为1μmol的nca1蛋白溶液和50μl浓度为1μmol的his-cat2蛋白溶液加在140μl反应缓冲液(40mmhepes,ph7.5)中,检测45℃下340nm处的吸收值；

cat2+hsp17.6cii组(1：1):将10μl浓度为1μmol的hsp17.6cii蛋白溶液和10μl浓度为1μmol的his-cat2蛋白溶液加在180μl反应缓冲液(40mmhepes,ph7.5)中,检测45℃下340nm处的吸收值；

cat2+hsp17.6cii(1:5)组:将10μl浓度为1μmol的hsp17.6cii蛋白溶液和50μl浓度为1μmol的his-cat2蛋白溶液加在140μl反应缓冲液(40mmhepes,ph7.5)中,检测45℃下340nm处的吸收值；

hsp17.6cii组:将10μl浓度为1μmol的hsp17.6cii蛋白溶液加在190μl反应缓冲液(40mmhepes,ph7.5)中,检测45℃下340nm处的吸收值；

nca1组:将10μl浓度为1μmol的nca1蛋白溶液加在190μl反应缓冲液(40mmhepes,ph7.5)中,检测45℃下340nm处的吸收值。

340nm处的吸收值与蛋白聚集成正相关。

吸收值越高，则在热胁迫下的cat的聚集作用越大。

结果如图2b所示，可以看出，当不加hsp17.6cii时,cat聚集最快；当加入hsp17.6cii时,热诱导的cat的聚集作用减弱,并且这种减弱作用有剂量依赖效应,随着hsp17.6cii量的增加而加强；表明，热诱导的cat2的聚集作用能够被hsp17.6cii抑制,并且同样具有剂量依赖效应。这些结果说明hsp17.6cii具有分子伴侣活性,能够与cat2相互作用维持cat2的蛋白折叠状态。

实施例2、hsp17.6cii基因在植物耐盐碱中的应用

一、转hsp17.6cii拟南芥的获得及鉴定

1、重组质粒的制备

人工合成序列表中序列1所示的hsp17.6cii基因，将其插入pcambia1307载体(cambiavzc0323)的bamhi酶切位点间，得到重组质粒pcambia1307-hsp17.6cii，编码蛋白hsp17.6cii(氨基酸序列为序列2)。

2、重组菌的制备

将重组质粒pcambia1307-hsp17.6cii用电击法导入农杆菌gv3101，得到重组菌。

提取重组菌的质粒，经过测序，该质粒为pcambia1307-hsp17.6cii，将含有该质粒的重组菌命名为gv3101/pcambia1307-hsp17.6cii，即为重组农杆菌。

3、转hsp17.6cii拟南芥的获得

将重组农杆菌gv3101/pcambia1307-hsp17.6cii培养至对数期，然后用抽真空法将其转化哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)(种子购自arabidopsisbiologicalresourcecenter(abrc))花中，经培育后收获种子，将种子播于含潮霉素(50mg/l)的ms筛选培养基上，待筛选得到的t1代植株长至6叶时移到蛭石上生长，收获t1代单株，各单株种子分别播种，用相同的ms筛选培养基继续筛选以观察t2代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系，获得t3代转hsp17.6cii拟南芥col-0。

采用同样的方法将重组农杆菌gv3101/pcambia1307-hsp17.6cii转化突变体nca1-3(nca1-3又名hphd1，突变体种子于2014年09月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号cgmccno.9599，分类命名为拟南芥(arabidopsisthaliana)),突变体cat2cat3(cat2(salk_076998)和cat3(salk_092911)单突变体从tair(thearabidopsisinformationresource),即拟南芥信息资源网站订购，突变体号为cat2(salk_076998)和cat3(salk_092911)，双突变体cat2cat3是将cat2(salk_076998)和cat3(salk_092911)单突变体进行杂交获得的)，将重组农杆菌gv3101/pcambia1307-hsp17.6cii转化突变体cat2cat3突变体的花，得到t3代转hsp17.6cii拟南芥nca1-3和t3代转hsp17.6cii拟南芥cat2cat3。

采用同样的方法将空载体pcambia1307载体转化哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)，得到t3代转空载体拟南芥。

4、转hsp17.6cii拟南芥的鉴定

分别提取t3代转空载体拟南芥、t3代转hsp17.6cii拟南芥col-0、t3代转hsp17.6cii拟南芥nca1-3和t3代转hsp17.6cii拟南芥cat2cat3的基因组dna作为模板，用hsp17.6cii基因特异引物前端引物5’atggatttaggaaggtttccaataat3’，反端引物5’tcaagcaacttgaacttgaattg3’进行rt-pcr扩增。

以actin基因为内参基因，内参引物为actin前端引物5’gatgcccagaagtcttgttcc3’，反端引物5’accaccgatccagacactgtacttcc3’。

以野生型拟南芥(col-0)、拟南芥nca1-3和拟南芥cat2cat3为对照。

结果，与各自对照相比，t3代转hsp17.6cii拟南芥、t3代转hsp17.6cii拟南芥nca1-3和t3代转hsp17.6cii拟南芥cat2cat3中hsp17.6cii的表达量提高。

t3代转空载体拟南芥与野生型拟南芥(col-0)结果无显著差异。

二、转hsp17.6cii拟南芥的功能研究

将拟南芥nca1-3突变体、拟南芥cat2cat3突变体、野生型拟南芥col-0、t3代转空载体拟南芥、t3代转hsp17.6cii拟南芥col-0(hsp17.6ciioeincol-0)株系5#、16#、t3代转hsp17.6cii拟南芥nca1-3和t3代转hsp17.6cii拟南芥cat2cat3种子点在普通ms培养基上生长7天后分别转移到ph7.3的ms培养基和含有75mmnacl的ms培养基上，光箱中培养12天后观察表型。

ph7.3的ms培养基为将ph值为5.8ms培养基的调节为ph为7.3，得到的培养基。

含有75mmnacl的ms培养基为将nacl和ms培养基混匀，得到培养基，且nacl在培养基中的浓度为75mm，ph值为5.8。

1、表型检测

检测表型，结果如图3a-3f所示，在ph值为7.3的ms培养基和含有75mmnacl的ms培养基上，与野生型拟南芥col-0相比，t3代转hsp17.6cii拟南芥col-0(hsp17.6ciioeincol-0)株系5#、16#的根长增加，表明hsp17.6cii增加植物的抗盐碱能力；

而在nca1-3或cat2cat3突变体中过表达hsp17.6cii不能回补nca1-3或cat2cat3的盐碱敏感表型，表明hsp17.6cii增加植物的抗盐碱能力是通过nca1和cat起作用的。

2、鲜重

称取各个株系的鲜重，结果如图3g-l所示，在ph值为7.3的ms培养基和含有75mmnacl的ms培养基上，与野生型拟南芥col-0相比，t3代转hsp17.6cii拟南芥col-0(hsp17.6ciioeincol-0)株系5#、16#的鲜重增加，表明hsp17.6cii增加植物的抗盐碱能力；

而在nca1-3或cat2cat3突变体中过表达hsp17.6cii不能回补nca1-3或cat2cat3的盐碱敏感表型，表明hsp17.6cii增加植物的抗盐碱能力是通过nca1和cat起作用的。

序列表

<110>中国农业大学

<120>热激蛋白hsp17.6cii在调控植物耐盐碱中的应用

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

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