一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒及其用途的制作方法

本发明涉及动物病原分子诊断技术领域，特别涉及一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途。

背景技术：

猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV))属于呼长孤病毒科轮状病毒属，是一种严重的接触性肠道传染病病原，导致仔猪出现呕吐、腹泻、脱水和消痩等临床症状，也能够致使仔猪死亡，特别是对7日龄左右的仔猪造成的危害最为严重。该病主要暴发于寒冷时期的冬季以及早春时节，且传播迅速，给养猪产业带来巨大的损失。病毒在猪体内的潜伏期较短、传播迅速，几天之内就可以感染整个猪群。仔猪感染PoRV会出现严重的病症，呕吐，呈严重的黄色、绿色或白色滴水样腹泻，患病猪只脱水严重，眼球凹陷，体重降低。7日龄以内的仔猪一般在发病后3-5天内会死亡。母猪感染仔猪主要是通过粪便传播，除此以外，母猪分泌的乳汁中也含有病毒。在保育猪、育肥猪和母猪中感染PoRV后出现的症状一般比较轻，大部分可以耐过，自行康复，出现死亡的比较少。根据临床症状和病理变化可以对PoRV感染做出初步诊断，要做出最终确诊以防控PoRV还需要利用实验室手段。

目前，实验室检测猪轮状病毒的主要方法有：(1)电子显微镜观察法：电子显微镜可以直接观察到轮状病毒粒子，病毒为直径60-80μm像车轮状的粒子，所需的粪样中必须要含有大量的轮状病毒才容易在电镜视野中观察到病毒粒子。此方法快速简单，但是电镜设备昂贵，不能在基层普及。(2)RNA聚丙烯胺凝胶电泳法：轮状病毒的基因组是由11个分节段的双链RNA组成，提取病毒RNA，直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，会出现11个特定的电泳条带，可以根据条带的电泳型对轮状病毒确诊并对其分群。此方法容易被RNA酶污染影响实验结果。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)：ELISA既可以直接检测病原也可以通过检测抗体推断抗原。该方法灵敏度高、特异性好，同时也能够满足临床上大批量样品检测的要求，正是以上优点，WHO将ELISA检测方法作为检测轮状病毒的标准方法。(4)免疫荧光技术：免疫荧光技术就是釆集腹泻仔猪的肠道内容物进行涂片，然后用冰丙酮溶液进行固定处理，与荧光素标记的轮状病毒抗体反应，荧光显微镜镜检观察到阳性荧光信号即可判定。(5)反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：以轮状病毒VP7或VP4核苷酸序列中的保守序列为模板设计引物，利用不同的特异性引物进行RT-PCR扩增出不同长度的DNA片段。同时，可根据VP4和VP7基因中的高变区设计型特异性引物，以进行轮状病毒的特定血清型别鉴定。

但是现有的检测方法存在以下不足：①检测时间较长。基于病毒粒子的检测方法，如病毒分离培养、电镜观察等技术需要进行前期准备、细胞培养、病毒分离纯化、制样等，需要长时间乃至数月之久才能获得最终结果，难于做到快速诊断；基于普通PCR的检测方法，需要提取核酸、PCR试剂配置、PCR反应、电泳、凝集成像、分析结果等，做一次病原检测需要近一天时间。②操作复杂，技术要求高。操作过程相对繁琐，且对操作人员技能要求较高，一般需要专业专职人员负责。③结果相对不可靠。免疫荧光与ELISA技术依赖抗体抗原反应，可能出现不可避免的交叉反应。在检测方法中检测步骤越多，过程越繁琐，出现差错的几率增加，且环境中存在的交叉污染造成结果的不准确。同时很多技术主要针对实验室检测，临床应用较少，缺少相应的质量控制及标准化。④需要复杂的仪器设备。为保证检测结果可被观察，现有技术每个步骤均得依赖于仪器设备，某些仪器设备如电镜等，过于庞大和贵重，一般检测机构难于承受，难于在基层推广。⑤检测成本高。繁琐又长时间的检测及设备的维护，一方面需要投入人力、物力较多，另一方面结果的不确定亦造成检测的重复，成倍的增加成本。

现阶段实验室对PoRV的检测主要是通过常规RT-PCR方法，但是此方法灵敏度较低，一般只能检测发病严重猪只携带的病原，对于PoRV感染早期的猪只，需要使用灵敏度更高的检测方法，以期在感染的潜伏期就能进行诊断，并采取有效的防控措施来减少损失。目前在实际情况中检测多是在规模化猪场出现疑似仔猪腹泻的疫情后，送检患病仔猪的排泄物和病死猪病料，利用常规RT-PCR方法进行检测，根据检测结果，结合该猪场其他情况给出诊断报告并制定疫病防控计划。一方面由于这种“事后”检测导致诊断结果对猪场疫病防控的指导意义有一定的局限性，无法做到未雨绸缪。另一方面，常规PCR方法操作时间较长，操作过程中容易发生污染。

实时荧光定量RT-PCR该方法建立在常规RT-PCR方法之上，敏感度更高、特异性更强、重复性良好，通过可视化设备监测扩增反应，无需电泳，省时省力、快速准确。对于初期感染轮状病毒且感染猪群体内的病毒含量较低时，此种方法能做出准确判断，对于防治和治疗轮状病毒的爆发可以发挥重要的作用。

猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，但在如某些病毒单独或协同感染的情况下，屏障通透性变化导致病原从母体垂直传播至新生个体。PoRV一般经母猪粪便或乳汁污染传播至仔猪，亦可能随同某些病毒的混合感染进行脐带血垂直传播，因此首创采用从仔猪脐带血中检测PoRV来评价及预警仔猪腹泻疾病的发病情况，这种寻找“源头”的检测方法更加科学、直接、有效。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪PoRV带毒状况，评估母猪疫苗的免疫效果，有益于对猪群PoRV感染和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。

基于上述目的，本发明提供了一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：

上游扩增引物RV73-f：5’-CCGGCTTTAAAAGAGAGAATTTC-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游扩增引物RV73-r：5’-CCCTGTGGTATATTCAATACCATACA-3’，其为SEQ ID NO:2序列；

特异性荧光探针RV73-p：FAM-5’-AAGGAGCTAACCGYTAGCCA-3’-TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，其中Y＝T/C，FAM为荧光报告基团，TAMRA为非荧光淬灭基团。

合理的引物和荧光探针设计是成功应用实时荧光RT-PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。

轮状病毒的基因组由11个不连续的双股RNA节段组成，编码6种结构蛋白：vp1、vp2、vp3、vp4、vp6和vp7。本发明根据GenBank中公布的PoRV病毒流行毒株基因序列进行对比分析，筛选出PoRV基因组中外层衣壳蛋白vp7基因的一段基因片段，该基因片段在猪轮状病毒中高度保守，大小为73bp，作为本发明设计引物的靶片段。vp7是轮状病毒的外衣壳蛋白，也是一种糖基化蛋白，因不同毒株而异，分别由病毒基因组的基因7或8、9基因编码，为病毒外膜主要中和抗原，与病毒的毒力及免疫保护性相关。因此主要根据vp7不同基因型序列特点扩增大小不同的特异性片段，通过扩增片段大小不同来判定不同的基因型。

本发明从猪轮状病毒全长vp7基因上筛选出一段高度保守的基因片段，发明人针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出本发明的引物和探针。试验结果表明，本发明的上下游扩增引物匹配性和特异性良好。同时在该上下游引物扩增区73bp片段间设计了高度保守的特异性荧光探针，该特异性荧光探针能与PoRV核酸特异性结合，引物进行扩增过程中，荧光探针发生酶解，致荧光积累被仪器检测到。该组引物与探针扩增效率较好，能特异性扩增PoRV核酸，同其它常见感染猪的病毒无交叉反应。

考虑到扩增的猪轮状病毒的范围更宽，设计兼并碱基，即本发明的引物和探针含有兼并碱基，因此该引物和探针的广泛性和特异性强，灵敏性好。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物RV73-f、所述下游扩增引物RV73-r和所述特异性荧光探针RV73-p的摩尔比为2:2:1。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物RV73-f、所述下游扩增引物RV73-r和所述特异性荧光探针RV73-p在所述试剂盒中的终浓度均为0.1～0.4μM。

在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光RT-PCR反应液(含酶)及说明书。

在RT-PCR反应体系中加入荧光RT-PCR反应液，该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。本发明的荧光RT-PCR反应液中还含有dNTPs、反转录酶、TaqDNA聚合酶和一些增强成分(MgCl₂、DMSO或甲酰胺)的混合物，具体的增强成分根据实际需要进行添加。

在本发明中，优选的，所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH₂O，所述阳性对照为含有猪轮状病毒vp7基因序列的克隆质粒pEASY-vp7，克隆质粒pEASY-vp7的终浓度为3.2×10⁵copies/μL～3.2×10⁷copies/μL。

在本发明中，优选的，所述猪轮状病毒vp7基因序列的核苷酸序列如下所示：

GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGACTGGCTATCGGATAGCTCATTTT AATGTATGGTATTGAATATACCACAG，其为SEQ ID NO:4所示。

在本发明中，优选的，所述克隆质粒pEASY-vp7采用以下方法制备得到：提取猪轮状病毒RNA，利用引物RV73-f和RV73-r一步法扩增得到猪轮状病毒vp7基因序列，通过TA克隆将该猪轮状病毒vp7基因序列连接至pEASY-T1载体，转化后筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-vp7。

进一步的，本发明还提供了所述的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)使用所述的实时荧光RT-PCR试剂盒进行扩增时，反应体系以20μL计为：

荧光RT-PCR反应液(含酶)：16μL；

10μMSEQ ID NO:1所示的上游扩增引物RV73-f：0.4～0.8μL；

10μMSEQ ID NO:2所示的下游扩增引物RV73-r：0.4～0.8μL；

10μMSEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针RV73-p：0.2～0.4μL；

RNA模板：2μL；

ddH₂O：补足至20μL；

(2)实时荧光RT-PCR的反应条件为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应；

(3)结果分析：

质量控制：阴性对照FAM通道检测无Ct值；阳性对照FAM通道检测Ct值≤30；上述条件同时满足，检测结果有效；

结果判定：FAM通道检测Ct值≤40，则判定样品为猪轮状病毒感染阳性；FAM通道检测无Ct值，则判定样品为猪轮状病毒感染阴性。

在本发明中，优选的，所述RNA模板采用以下方法制备得到：

1)取50-200mL猪脐带血置1.5mL EP管中，加入1mL裂解液充分匀浆，室温静置5min；

所述裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS0.1-0.2％；③吐温20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％；

(2)加入0.6mL异丙醇和10μL磁珠，振荡15s，静置2min；

(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(4)加入0.5mL异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(6)加入1mL质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(7)晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解，56℃促溶10～15min；

(8)快速电泳检测RNA完整性。

本发明在核酸提取环节中，使用盐酸胍、SDS、吐温20，NP40，异丙醇和质量百分比为70％的乙醇溶液等洗涤，可以有效降低去除溶血的干扰，获得高质量的核酸。

在本发明中，为了使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值，对待检脐带血中提取的RNA模板浓度、引物浓度和特异性荧光探针的浓度进行了优化，尤其是探针的浓度。引物浓度过低会影响扩增效率，引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且增加引物之间形成二聚体的机会，同样特异性荧光探针浓度过低会引起特异性的荧光信号变弱，而浓度过高则会引起探针与模板发生非特异性结合，产生非特异性荧光信号从而干扰特异性荧光信号，待检脐带血中提取的RNA模板浓度会影响PCR扩增的效率，应根据目的基因的大小选择合适的RNA模板浓度。本发明经过一系列优化试验，最终确定本发明的荧光RT-PCR反应体系和反应条件，采用本发明的实时荧光RT-PCR方法检测猪轮状病毒的扩增效率接近100％，并可获得最小的Ct值。

更进一步的，本发明还提供了上述试剂盒在制备检测仔猪脐带血中猪轮状病毒试剂中的用途。

本发明将猪轮状病毒的vp7基因和TaqMan探针相结合，在猪轮状病毒的vp7基因选取保守区设计特异性引物和特异性探针，通过对待检脐带血中提取的RNA模板浓度、引物浓度以及特异性荧光探针浓度等进行优化，建立了仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR方法。灵敏度试验结果表明，该方法的检测范围为3.2×10⁸-32copies/μL，可以从猪轮状病毒感染脐带血中检测到最低32copies的猪轮状病毒核酸，灵敏度是常规PCR方法的300倍。特异性试验结果表明，该方法对猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、流行性腹泻病毒与传染性胃肠炎病毒等的细胞培养物及正常细胞均无非特异性反应，说明该方法特异性和可靠性强。准确性试验结果表明，对于阳性对照与阴性对照的检测，该方法与常规RT-PCR方法检测结果100％符合；对于临床样品的检测，该方法检测猪轮状病毒阳性5/84，常规RT-PCR方法检测猪轮状病毒阳性2/84，且后者检测的2份样品使用该方法检测均为阳性，说明该方法比常规RT-PCR方法更敏感，准确性高。重复性试验结果表明，该方法对10⁶copies/μl、10⁵copies/μl和10⁴copies/μl浓度的阳性对照pEASY-vp7克隆质粒检测变异系数(CV)均小于3％，具有较好的重复性。

本发明是利用实时荧光RT-PCR方法代替常规RT-PCR方法，并制备成试剂盒，主要通过检测仔猪脐带血中是否含有PoRV核酸，评估及预警猪群PoRV野毒感染状况，及时制定防控计划。同时，本发明的方法亦可用于对发病猪病料组织、排泄物的检测，检测更准确、快速。

综上所述，本发明建立的检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR方法和基于该方法建立的试剂盒具有准确度高，灵敏度高，特异性强和重复性优的特点，可以用于猪轮状病毒感染的病原学研究、早期诊断，对猪轮状病毒的快速诊断、综合防控、病原净化和早期治疗具有重要意义。

本发明应用实时荧光RT-PCR检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的工作原理：猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，但在如某些病毒单独或协同感染的情况下，屏障通透性变化导致病原从母体垂直传播至新生个体。PoRV一般经母猪粪便或乳汁污染传播至仔猪，亦可能随同某些病毒的混合感染进行脐带血垂直传播，因此首创采用从仔猪脐带血中检测PoRV来评价及预警仔猪腹泻疾病的发病情况，这种寻找“源头”的检测方法更加科学、直接、有效。在诊断猪轮状病毒感染时，一般需要根据实验室检测结果，结合该猪场疫病流行病学、临床症状、病理剖解变化，对该病进行系统全变的诊断。采用实时荧光RT-PCR技术诊断猪轮状病毒感染的实施步骤为：(1)评估猪场疫病情况，包括:流行病学、临床症状、病理剖解变化。(2)采集样品(包括血清和病料)：A、血清采集：按一定比例对猪群进行静脉采血，分离血清。B、病料采集：采集每头母猪所产流产或死产胎儿的脑、肺、肝、肾和母猪胎盘合为1份病料，每次至少采集4份病料。(3)送检：将采集的样品贴上标签，做好记录后放入泡沫盒中，加入冰块，密封后送兽医实验室进行相关病原检测。(4)RNA提取：将样品进行处理，进行RNA提取。(5)实时荧光RT-PCR检测：合成特异性引物和荧光探针，利用实时荧光RT-PCR方法检测样品中是否有猪PoRV特异性核酸片段。(6)根据是否检测猪PoRV特异性核酸片段，判定检测结果。(7)根据检测结果，结合该猪场疫病流行病学、临床症状、病理剖解变化，对该病进行系统的诊断。

本发明还提供了一种脐带血的采集方法，具体步骤如下：

(1)取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；

(2)当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可；若母猪分娩出现木乃伊、死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；

(3)脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；

(4)将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。

本发明脐带血的采集方法克服现有常规采血技术的耗时长、采血困难、对猪只应激大等问题，脐带血采集简单、方便、快捷和无应激。

与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下有益效果：

(1)本发明的检测方法克服了常规检测技术耗时长、敏感度低、安全系数低、抗污染能力差和不能准确定量等问题，检测快速高效，不会造成样品交叉污染。

(2)本发明的检测方法准确度高，灵敏度高，特异性强，重复性优，可以实现较大通量样品的检测。

(3)本发明的检测方法不仅适用于检测脐带血检测，还适用于待检猪的脾脏、淋巴结、血清及血浆等样品，可用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。

(4)在日常猪轮状病毒检测及疾病净化过程中，需进行活体采样，对猪群的应激较大，难度也高，而脐带血避免了这些问题，脐带血虽然含毒量相对于组织而言要低，在实际应用中也对组织及对应脐带血进行了相互印证，确保本发明检测方法的特异性及敏感性。

(5)本发明运用一步法实时荧光RT-PCR技术，通过一个PCR反应，就可以从脐带血、血液与组织样品中检测出是否有猪轮状病毒存在，操作简单操作时间短，做一次病原检测仅需要2-3小时，快捷迅速、节约成本；而且需要仪器设备相对简单，不需要电泳仪、凝胶成像系统及其分析软件；结果相对可靠，不需要电泳，空气中气溶胶相对较少，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广；基于该检测方法制备的试剂盒易于质量控制，易于标准化。

附图说明

图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度标准曲线；

图2为本发明敏感性检测结果图；

图3为本发明特异性检测结果图。

图4为本发明重复性检测结果图；

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

实施例1检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒的组成

(1)荧光RT-PCR反应液(含酶)：该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等；

(2)上下游引物组RV73-f和RV73-r：由上海生工生物工程公司合成，用DEPC水配制成浓度为10μM。

上游扩增引物RV73-f：5’-CCGGCTTTAAAAGAGAGAATTTC-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游扩增引物RV73-r：5’-CCCTGTGGTATATTCAATACCATACA-3’，其为SEQ ID NO:2序列；

(3)特异性荧光探针RV73-p：由华大基因公司合成，用DEPC水配制成浓度为10μM。

特异性荧光探针RV73-p：FAM-5’-AAGGAGCTAACCGYTAGCCA-3’-TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，Y＝T/C，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为非荧光淬灭基团；

本发明对GenBank中公布的PoRV病毒流行毒株基因序列进行对比分析，在PoRV基因组高度保守的外层衣壳蛋白vp7基因上设计了上下游扩增引物，且匹配性和特异性良好。同时在该上下游引物扩增区73bp片段间设计了高度保守的特异性荧光探针，该特异性荧光探针能与PoRV核酸特异性结合，引物进行扩增过程中，探针发生酶解，致荧光积累被仪器检测到。该组引物与探针扩增效率较好，能特异性扩增PoRV核酸，同其它常见感染猪的病毒无交叉。

本发明的引物和探针含有兼并碱基，因此该引物和探针的广泛性和特异性强，灵敏性好。

(4)阳性对照为克隆有PoRV外衣壳蛋白vp7基因片段的重组质粒pEASY-vp7，由本实验室构建，质粒在紫外分光光度计OD260nm测定质量浓度，按公式6.02×10²³×(X ng/μL×10^-9)/DNA length×660换算为拷贝数，配制浓度为3.2×10⁵copies/μL～3.2×10⁷copies/μL；

其中，克隆质粒pEASY-vp7的构建方法如下：①按照商业试剂盒操作说明书提取PoRV核酸；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物一步法扩增vp7基因73bp目的片段，反应条件为：42℃逆转录60min；95℃预变性5min；95℃变性30Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸10min，4℃保温5min。PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；②PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Excraction Kit胶回收试剂盒回收，通过TA克隆将PoRV病毒vp7基因中73bp目的片段克隆至pEASY-T1载体，然后转化Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h。经蓝白斑筛选后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名pEASY-vp7。

在本发明中，所述猪轮状病毒vp7基因73bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGACTGGCTATCGGATAGCTCATTTT AATGTATGGTATTGAATATACCACAG(SEQ ID NO:4)；

(5)阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH₂O；

(6)使用说明书。

实施例2检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒的使用方法

本发明试剂盒使用方法具体包括以下步骤：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)RNA提取；(4)实时荧光RT-PCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测；(5)判定结果。

1.样品采集

(1)脐带血样品采集

a.取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；

b.当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可，将其“脐带血”挤到青霉素瓶，密封；

注意事项：①必须要采集同窝母猪产的所有的仔猪，避免同窝母猪所产仔猪的个体差异造成漏检；②可以双人操作，也可以单独操作，若仔猪脐带血不便挤出，可以将脐带剪成几段再操作即可；③若母猪分娩出现木乃伊，死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；④弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；

c.脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；

d.将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。

(2)病料样品(扁桃体、肾脏、肺脏和淋巴结等)

A、剖解取内脏：将患病猪剖解，取出完整的上述内脏，放置在同一个干净塑料袋内。

B、记录：将装有内脏的塑料袋密封，贴标签并记录发病猪的日龄、体重、品种、临床症状等信息。

C、将采集的病料样品集中送至实验室，并附上所记录的信息。

2.样品中模板RNA提取

(1)取50-200mL仔猪脐带血置1.5mLEP管中，加入1mL裂解液充分匀浆，室温静置5min；

裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％；

(2)加入0.6mL异丙醇和10μL磁珠，振荡15s，静置2min；

(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(4)加入0.5mL异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(6)加入1mL质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(7)晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解，56℃促溶10～15min；

(8)快速电泳检测RNA完整性。

为监测提取过程中的污染，建议在提取样本的同时提取一管水作为阴性对照。

本发明在核酸提取环节中，使用盐酸胍、SDS、吐温20，NP40，异丙醇和质量百分比浓度为70％的乙醇溶液等洗涤，可以有效降低去除溶血的干扰，获得高质量的核酸。

依据上述方法提取6份随机脐带血样品总RNA，经核酸蛋白检测仪检测，浓度均能达到0.229μg/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之间，表明RNA纯度高、完整性好，具体数据见表1。

表1 RNA质量检测结果

3.荧光RT-PCR反应

对实时荧光RT-PCR反应体系和反应条件进行优化，优化原则为：通过优化使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。经过优化，实时荧光RT-PCR反应体系和反应条件如下所示：

(1)实时荧光PCR反应体系以20μL计为：10μM SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物RV73-f：0.4～0.8μL；10μM SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物RV73-r：0.4～0.8μL；10μM SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针RV73-p：0.2～0.4μL；荧光RT-PCR反应液(含酶)：16μL；RNA模板：2μL；ddH₂O：补足至20μL。

同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照克隆质粒pEASY-vp7：2μL，其余组分相同；阴性对照无RNA酶与DNA酶的ddH₂O：2μL，其余组分相同。

(2)实时荧光PCR的反应条件为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应。

(3)结果分析：

质量控制：阴性对照FAM通道检测无Ct值；阳性对照FAM通道检测Ct值≤30；上述条件同时满足，检测结果有效；

结果判定：FAM通道检测Ct值≤40，则判定样品为PoRV感染阳性；FAM通道检测无Ct值，则判定样品为PoRV感染阴性。

实施例3检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒的验证

1.试剂盒扩增效率验证

将阳性对照克隆质粒pEASY-vp7进行10倍梯度稀释，使其拷贝数为：10⁸-10¹copies/μl，每个梯度重复三次进行PoRV实时荧光RT-PCR检测，根据扩增结果制作标准曲线。

图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度扩增标准曲线(FAM通道)，其中该标准曲线的参数如下：斜率：-3.26，截距：40.95，相关系数：0.99，扩增效率：1.02。

综上，说明该试剂盒检测PoRV核酸的扩增效率均达到近100％。

2.灵敏度试验

以10倍梯度稀释的阳性对照克隆质粒pEASY-vp7作为模板，进行本发明试剂盒的灵敏度检测，检测范围为3.2×10⁸-32copies/μL。结果表明，该方法的检测范围为3.2×10⁸-32copies/μL，在此范围的病毒含量可以得到可靠的结果，即该方法的灵敏度可以检测到最低32个拷贝数的PoRV核酸含量的样品，检测结果见图2。

3.特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测检测猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、流行性腹泻病毒与传染性胃肠炎病毒等7种病毒的提取核酸。

检测结果表明：本发明的试剂盒仅对PoRV进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性扩增PoRV，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，检测结果见图3。

4.重复性试验

选用阳性对照pEASY-vp7克隆质粒10⁶、10⁵、10⁴copies/μL，对每个浓度的样本做3个重复，结果不同核酸浓度的检测变异系数(CV)均小于3％，具有较好的重复性。检测结果见表2和图4。

表2实时荧光RT-PCR检测猪轮状病毒的重复性试验

5.准确性临床验证

使用本发明的试剂盒同常规RT-PCR方法对累计84份脐带血样品以及5份健康的脐带血样品进行了PoRV检测，结果表明，对于临床样品的检测，该试剂盒方法检测PoRV阳性5/84，常规RT-PCR方法检测PoRV阳性2/84，且后者检测的2份样品使用本发明试剂盒方法检测均为阳性，说明试剂盒方法更敏感，检出率及准确性更高；对于PoRV阴性临床样品的检测，本发明试剂盒方法检测结果同常规RT-PCR方法检测结果一致。检测结果见表3。

表3采用本发明试剂盒以及普通RT-PCR对临床样品进行检测结果的比较

综上可见，本发明设计的一对特异性引物和一条特异性荧光探针以及构成的实时荧光RT-PCR试剂盒可以快速鉴定仔猪脐带血中的猪轮状病毒，而且该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、可重复性好，检测结果真实可靠。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖南新南方养殖服务有限公司

<120>一种检测仔猪脐带血中猪轮状病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途

<130> FI160698-ND

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ccggctttaaaagagagaatttc 23

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

ccctgtggtatattcaataccataca 26

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

aaggagctaaccgytagcca 20

<210> 4

<211> 73

<212> RNA

<213> PoRV vp7基因序列

<400> 4

ggctttaaaagagagaatttccgactggctatcggatagctcattttaatgtatggtatt 60

gaatatacca cag 73