含抗间皮素单链抗体的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其用途的制作方法

本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受体mesocar及其基因和重组表达载体、工程化的靶向间皮素的dc细胞(mesocar-dc)及其应用。

背景技术：

树突状细胞(dendriticcells，dcs)是一类成熟时具有许多树突样凸起的、能够识别、摄取和加工外源性抗原并将抗原肽提呈给初始t细胞并诱导t细胞活化增殖的、功能最强的抗原呈递细胞。

目前的dc细胞免疫治疗，是分离肿瘤患者自身的单核细胞，在体外培养、扩增、并诱导其生成dc，然后让dc负载相应的肿瘤抗原，经严格筛选后制备成负载肿瘤抗原的dc，然后将这些dc细胞回输到相应患者体内，刺激、激活人体内的天然抗肿瘤系统。dc免疫细胞治疗广泛适用于多种肿瘤的治疗，但是，单纯靠体外活化dc细胞取得的疗效有限，因此在dc细胞免疫治疗肿瘤的方法上仍需进一步改善。

嵌合抗原受体t细胞疗法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般的，嵌合抗原受体car由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。car-t细胞疗法通过把能特异性识别肿瘤相关抗原的单链抗体(singlechainfragmentvariable，scfv)和t细胞活化序列偶联，并使其表达到t细胞表面，使能特异性识别肿瘤相关抗原的scfv通过跨膜区与t细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达car的t细胞以抗原依赖、但非mhc限制的方式识别并结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。

人间皮素(mesothelin，简写为meso)是一种40kda的细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(gpi)-连接的糖蛋白。间皮素以相对低的水平存在于健康个体的胸膜、腹膜及心包膜的间皮细胞中，但在许多不同的癌症中高度表达，包括间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胆管癌和乳腺癌。已经在多于55％的肺癌和多于70％的卵巢癌中检测到高水平的间皮素。早期临床数据表明，间皮素特异的car-t细胞可被机体很好的耐受，并且对于卵巢癌，胰腺癌，间皮素瘤有很好的临床效果。但car-t可产生一定的脱靶毒性，影响其细胞免疫疗效；而且更重要的是，由于肿瘤的异质性，同一个肿瘤往往存在多种肿瘤抗原，因此针对单一肿瘤抗原的car-t疗效有限，而且容易复发。

因此，我们设计了一种新型的dc细胞治疗肿瘤策略，利用慢病毒系统将间皮素信号域与肿瘤相关嵌合抗原受体融合，转导dc细胞，使其在dc细胞表面表达间皮素特异性的car，通过识别肿瘤细胞表面的间皮素与肿瘤细胞结合，活化dc细胞，并将信号呈递给具杀伤效应的t淋巴细胞，从而激活t细胞的特异性肿瘤杀伤能力，并激活自身免疫，来达到监测、杀灭肿瘤的目的，并且可以有效降低由于脱靶效应造成的毒副作用，以及肿瘤异质性导致的复发及耐受。

技术实现要素：

为了克服现有技术中体外活化dc细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高的缺陷，本发明提供了以下方面。

本发明首先提供了一种嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体由人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)信号肽、抗间皮素单链抗体(ss1scfv)、人cd8α铰链区、人cd40的跨膜区和胞内信号区串联构成，称为mesocar。

进一步的，所述单链抗体的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了编码所述嵌合抗原受体的基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了表达载体，其包含并能表达氨基酸序列为seqidno.1所示的嵌合抗原受体的编码基因。

进一步地，所述表达载体为慢病毒载体pcdh-mesocar。

本发明还提供了一种工程化的树突状细胞，其含有所述表达载体。

进一步地，所述表达载体为慢病毒载体pcdh-mesocar。

本发明还提供了所述的工程化的dc细胞在制备用于治疗癌症的制剂中的用途。

进一步地，所述癌症是间皮素阳性的间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胆管癌和乳腺癌；优选胰腺癌。

本发明还提供了一种表达嵌合抗原受体的树突状细胞的方法，其包括将所述嵌合抗原受体的表达载体转染进树突状细胞。

进一步地，所述方法中的嵌合抗原受体为所述mesocar，优选为具有seqidno.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述方法中的表达载体包含并能表达氨基酸序列为seqidno.1所示的嵌合抗原受体的编码基因，优选为慢病毒载体pcdh-mesocar。

在一些实施方案中，本发明所述的car的结构是由单链抗体(scfv)、铰链区(hinge)、跨膜区(transmembranedomain)、信号域(signaldomain)组成。其中scfv区由轻链可变区序列和重链可变区序列组成；轻链区和重链区之间通过(gly4-ser)n接头；单链抗体(scfv)结合序列可以为肿瘤相关抗原，如cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd123、cd138、cea、cmet、egfrviii、il33rα2、fap、her2、gd2、psma、muc1、muc16、间皮素和ncam等中的一种或几种；铰链区序列为fcγriiiαhinge、cd8αhinge、igg1/4hinge中的一种；跨膜区序列为cd8αtm、fcεriα-tm、cd40-tm中的一种。

附图说明

图1为本发明所使用的嵌合抗原受体mesocar的结构示意图。

图2为慢病毒表达载体pcdh-mesocar质粒信息图。

图3为荧光显微镜检测慢病毒pcdh-mesocar侵染dc细胞的荧光表达情况；a为未侵染的dc细胞，b为pcdh-car(meso)病毒侵染的dc细胞

图4为体外mesocar-dc细胞与mesothelin+a431细胞(人间皮素过表达的a431细胞)共培养后活化情况，通过流式检测mhc-i/mhc-ii/cd86/cd40的表达水平分析dc细胞的活化程度。

a为mesocar-dc细胞；b为mesocar-dc细胞与mesothelin+a431以3:1的比例共培养。

图5为效应细胞mesocar-dc，靶细胞a431-h9，cd8⁺t细胞以3:1:3比例共培养后，通过流式检测cd25的表达水平分析t细胞激活情况。

a：未处理的dc细胞与靶细胞a431，cd8⁺t细胞共培养；b：pcdh-空载体转导的dc细胞与靶细胞a431，cd8⁺t细胞共培养；c：pcdh-mesocar转导dc细胞与靶细胞a431，cd8⁺t细胞共培养。

图6为mesocar-dc治疗间皮素阳性荷瘤小鼠后，肿瘤体积的变化情况。

a：小鼠尾静脉注射1x10^6dc细胞和1x10^6cd8⁺t细胞；

b：小鼠尾静脉注射1x10^6慢病毒空载体转导体外培养dc细胞和1x10^6cd8⁺t细胞；

c：小鼠尾静脉注射1x10^6pcdh-mesocar-dc细胞和1x10^6cd8⁺t细胞。

图7为mesocar-dc治疗间皮素阳性荷瘤小鼠后，小鼠的存活情况。

a：小鼠尾静脉注射1x10^6dc细胞和1x10^6cd8⁺t细胞；

b：小鼠尾静脉注射1x10^6慢病毒空载体转导体外培养dc细胞和1x10^6cd8⁺t细胞；

c：小鼠尾静脉注射1x10^6pcdh-mesocar-dc细胞和1x10^6cd8⁺t细胞。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：

dmem培养基、x-vivo15培养基购自takara公司。

淋巴细胞分离液购自tbd公司。

t4dna连接酶购自takara公司。

限制性核酸内切酶ecori、xbai购自thermofisherscientific公司。

pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(简称pcdh)及其包装质粒plp1、plp2、plp/vsvg购自addgene公司。

琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、普通dna产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。

pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro购自addgene公司。

dh5αphageresistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

lipofectaminetm2000transfectionreagent转染试剂购自invitrogen公司。

293t包装细胞购自美国atcc。

a431细胞系购自美国atcc。

bhk21细胞系购自美国atcc

胎牛血清购自gibco公司。

peg6000和nacl均购自上海索莱宝生物科技有限公司。

免疫缺陷模式小鼠(nsg)购自北京维通达生物技术有限公司。

基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

人gm-csf、il-4、rhil-2、cd3/cd28抗体等购自ebioscience公司。

抗mhc-i，mhc-ii，cd80，cd86，cd3，cd25等流式抗体购自bd公司。

实施例

一、mesocar基因序列的确定

1.1从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)genbank数据库中搜索到人gm-csf信号肽基因seqidno.3、人cd8α铰链区基因seqidno.4、人cd40跨膜区和胞内信号区基因序列seqidno.5。抗间皮素单链抗体(抗ss1scfv)基因序列为seqidno.6。

1.2将上述基因序列依次按人gm-csf信号肽基因、抗ss1scfv、人cd8α铰链区基因、人cd40跨膜区和胞内信号区序列进行连接，形成最终完整的gm-csf-ss1scfv-cd8α-cd40(mesocar)基因序列seqidno.2。

二.pcdh-mesocar表达质粒的构建

2.1全基因合成：

由上海生工合成完整的mesocar基因序列，并在两端添加酶切位点xbai/ecori。

2.2将上述序列克隆到pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(简称pcdh)慢病毒表达载体中，获得抗人间皮素-car的表达质粒。

分别将mesocar和慢病毒表达载体pcdh用xbai/ecori进行酶切，酶切体系如下，37℃水浴>1小时。

将酶切产物琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，对正确的产物进行胶回收。

将相应酶切产物用t4dna连接酶进行连接，连接体系如下：

16℃过夜连接，连接产物转化dh5a感受态细胞。

2.3从转化有pcdh-mesocar的平板中随机挑取4个单克隆，分别加入含有ampicillin氨苄青霉素(100ug/ml)的4ml的lb培养基中进行扩培，6-8小时后进行质粒提取，并用xbai/ecori进行酶切鉴定，回收大小正确的酶切片段，送上海生工进行测序进一步确定。测序正确的即为pcdh-mesocar。

三.慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

3.1慢病毒的包装：

3.1.1细胞处理：转染前24小时收集处于对数生长期的第3-10代293t细胞，将5×10^6293t细胞接种于10cm培养板中，细胞在含有10ml10％fbs的dmem培养基中生长，置37℃5％co2培养箱培养24小时，达60-80％密度时可进行转染。

3.1.2向细胞中以5:2:2:2的比例共转染慢病毒载体质粒(pcdh-mesocar或其空载体pcdh)及其包装质粒plp1，plp2，plp/vsvg；转染体系如下：

6～8小时后将10cm培养盘中培养基换成完全培养基。

3.1.3转染后24小时，于荧光显微镜下观察293t细胞转染后gfp荧光表达情况。分别于转染24小时、48小时后收集293t培养上清，3000rpm离心15分钟，72小时后收集293t细胞和上清于15ml管，反复冻融三次裂解细胞，离心收集上清；

3.1.4用0.45μm滤器过滤病毒上清，分别获得pcdh-空载体和pcdh-mesocar病毒原液；-80℃保存。

3.2慢病毒浓缩

3.2.1分别收集细胞及培养上清，peg6000浓缩病毒，向病毒溶液中加入1/4体积的peg6000/nacl溶液(25％peg6000+4.4％nacl)，混匀，4℃静置1小时；

3.2.24℃，5000rpm离心30分钟；

3.2.3弃上清，加入2ml病毒溶解液(10mmtris-hcl(ph8.0)，2mmmgcl2，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并分装于-80℃储存。

3.3慢病毒滴度测定

3.3.1预先接种bhk21细胞至24孔板，10^5细胞/孔，置于37℃5％co2细胞培养箱培养18小时；

3.3.2溶解病毒，准备从10^-2到10^-7做10倍梯度稀释病毒样品；

3.3.3去除细胞培养液，加入含有不同梯度的病毒细胞培养液，并在培养液中加入6ug/ml的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％co2细胞培养箱培养2小时；

3.3.4去除细胞培养液，加入10％fbs的dmem培养液，置于37℃5％co2细胞培养箱培养48小时；

3.3.5去除细胞培养液，加入含2ug/ml嘌呤霉素和1％fbs的dmem培养液，置于37℃5％co2细胞培养箱培养72小时；

3.3.6去除细胞培养液，加入结晶紫染色液，计数被染色克隆数，并计算病毒滴度。

3.2.10将病毒稀释至10^7tu/ml，于-80℃储存。

四.dc细胞的体外培养、感染和扩增

1用cd14+分选试剂盒(购自stemcell公司)将cd14+细胞从pbmc中分选出来。

2用x-vivo15培养基重悬细胞，加入500u/ml的gm-csf溶液、500u/ml的il-4溶液和一定量的自体血浆，诱导cd14⁺细胞向dc细胞分化。

3向培养6至8天的dc细胞中每孔分别加入pcdh-空载体或pcdh-mesocar病毒浓缩液(梯度设定，确定最佳感染滴度)，以及终浓度为6μg/ml的聚凝胺，混匀，置于37℃，5％co2培养箱培养，24小时内不换液；感染后24小时进行第二次感染；

4感染后96小时，用荧光显微镜观察dc细胞的绿色荧光表达情况并照相。结果见图3。

5收集细胞后，1000rpm离心10分钟，pbs洗涤1次，用适量pbs重悬细胞置于流式管中，用流式细胞仪检测gfp阳性率。

五.体外共培养测定car-dc细胞的活化及对t细胞的激活作用

5.1分析dc细胞活化，效应细胞mesocar-dc与靶细胞间皮素⁺a431(人间皮素转染a431细胞)细胞以不同比例共培养后，通过流式检测表明dc细胞活化的mhc-i/mhc-iii/cd86/cd40的表达水平。结果见图4。

5.2分析t细胞激活

5.2.1t细胞的分离培养，用cd8⁺t细胞分选试剂盒(购自stemcell公司)将t细胞从外周血单核细胞(pbmc)中分选出来；

5.2.2用含10％fbs的rpmi1640培养基调整细胞浓度至1×10^6/ml，将细胞接种到预先用抗人cd3和cd28抗体包被的细胞培养瓶中，再加入200iu/ml重组人白细胞介素2(rhil-2)，置于37℃5％co2细胞培养箱培养；

5.2.3mesocar-dc，a431，cd8⁺t细胞以3:1:3比例共培养后，通过流式检测t细胞活化的cd25的表达水平，分析t细胞激活情况。结果见图5，与对照相比mesocar-dc对t细胞的刺激作用明显。

六.体内mesocar-dc细胞对间皮素+肿瘤的杀伤活性

6.1nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj(nsg)小鼠在皮下植入5x10^6原代a431-h9(人间皮素稳转a431)细胞，观察并测量肿瘤生长情况，直至肿瘤生长至40mm³,给予car-dc。

6.2mesocar-dc细胞治疗间皮素阳性荷瘤小鼠的效果测定：从小鼠尾静脉注射1x10^6mesocar-dc和1x10^6cd8⁺t细胞，观察并测量肿瘤的生长情况，结果见图6，同时记录小鼠存活情况，结果见图7。

由图可知，mesocar-dc细胞组的荷瘤小鼠治疗后28天生存率为100％，而单dc细胞治疗及空载体dc细胞组小鼠全部死亡。说明mesocar-dc对于间皮素阳性荷瘤小鼠有很好的治疗效果。

序列表

<110>时力生物科技（北京）有限公司

<120>含抗间皮素单链抗体的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其用途

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>394

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mesocar的氨基酸序列

<400>1

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370375380

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<210>2

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<213>人工序列

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<223>mesocar的核酸序列

<400>2

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gm-csf信号肽的核酸序列

<400>3

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attcccgacattcag75

<210>4

<211>135

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人cd8α铰链区的核酸序列

<400>4

accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctg60

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人cd40跨膜区及胞内信号区的核酸序列

<400>5

gtcctgcaccgctcatgctcgcccggctttggggtcaagcagattgctacaggggtttct60

gataccatctgcgagccctgcccagtcggcttctccaatgtgtcatctgctttcgaaaaa120

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<210>6

<211>720

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ss1scfv核酸序列

<400>6

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