本发明涉及涉及家禽分子标记选择方法，特别是蛋鸭的分子标记方法。
背景技术：
行为作为复杂的数量性状受多基因的调控和多种环境因子的影响。在这些众多行为中，啄羽行为(非营养性缺乏性)一直备受人们关注，因为它已经成为欧美和国内大型集约化养禽业中影响动物福利的主要问题，国外将攻击行为分为啄羽和进攻性啄，进攻性啄被定义为快速地攻击对方的头部、身体及肛门，严重者可使家禽的皮肤致残或嗜食同类。研究表明，与DRD4基因相邻的另一基因DEAF1(损伤表皮调节基因deformed epidermal autoregulatory factor 1)的遗传变异与进攻性啄羽行为存在一定的关联，但其变异产生的何种基因型与啄羽有关未见报道。
本申请人在2016年获得的两件授权发明专利中(1、一种消除蛋鸭啄羽的方法。ZL 20140137323.5；2、一种降低种鸭啄羽的方法及其所用溶液的制备方法。ZL 201410136656.6)，均是应用物理或化学的方法，降低或消除由于环境因子引起啄羽，而由于遗传因子引起的啄羽(遗传力为0.16)，寻找与蛋鸭啄羽行为相关的分子标记并应用于蛋鸭的分子标记辅助选择(MAS)是一项重要而可靠的育种途径。近年来，有关分子标记并应用于育种的研究已有大量的研究报道，但涉及行为性状的分子标记挖掘与应用报道甚少，尤其在蛋鸭啄羽行为的分子标记挖掘与应用还是一个新的领域。
技术实现要素：
蛋鸭的啄羽行为除了受环境因子(饲喂密度、缺乏矿物元素等)的影响，还受遗传因子的影响，常规的方法(物理或化学物喷洒羽毛)只能降低或消除因环境因子导致的啄羽行为，对于遗传因子引起的啄羽无法消除。因此本发明目的是提供一种蛋鸭损伤性啄羽关联基因DEAF1分子标记及应用，以实现蛋鸭啄羽群体的分子标记辅助选择。
本发明的技术方案是这样的：
本发明首先提出了一种蛋鸭损伤性啄羽关联基因DEAF1分子标记，该分子标记通过以下方式获得：采用磁珠法从蛋鸭胸肌样品中提取DNA，运用Primer Primer 5.0进行引物设计，然后进行PCR扩增，对扩增产物片段纯化、载体连接、转化、阳性克隆筛选与测序，最后通过SNP突变位点筛查与关联分析，确定与啄羽性状相关联的SNP；其中，引物名及序列信息如下：
Ex9-F：TTAGGGGACTGTGGTGTGGA
Ex9-R：CCAGTGAAAACAGCGGGGTA
Ex11-F：AAAATGGCGAGGAGAGTGGG
Ex11-R：CCTCCGTAGTTCACACAGGG
Ex12-F：CAGTGGAATAGGGTGGGCTG
Ex12-R：CTCAGTTCCCGCATCACTCA。
其中，PCR扩增是应用20μL反应体系，设置PCR扩增条件进行PCR扩增，产物取5μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增条件为预变性94℃、5min；94℃变性30s；退火时间30s；72℃延伸30s后72℃终延伸30s；PCR扩增35个循环；扩增产物取5μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明还提出了上述分子标记在蛋鸭啄羽群体鉴定中的应用。
本发明通过寻找与啄羽行为相关的分子标记(基因型)并应用于分子标记辅助选择(MAS)，可以从根本上消除损伤性啄羽。本发明可以为建立行为性状的分子选择方法提供分子依据。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
1.DNA提取
对需检测的蛋鸭胸肌肉样品进行DNA提取，其动物基因组DNA抽提试剂盒(生物工程公司提供均可)。DNA提取之后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，并利用紫外分光光度计测量其OD值和样品浓度，放于-20℃冰箱保存。
2引物设计
运用Primer Primer 5.0进行引物设计，引物生物技术有限公司合成，引物序列信息见表1：
3 PCR扩增
PCR扩增反应体系为20μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10μL，灭菌的双蒸水5μL，上、下游引物各1.5μL，模板DNA(50ng/μL)2μL。PCR扩增具体条件为预变性94℃、5min；94℃变性30s；退火时间30s，其中各对引物的具体退火温度见表1；72℃延伸30s后72℃终延伸30s；PCR扩增35个循环。扩增产物取5μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
4扩增产物片段纯化、载体连接、转化、阳性克隆筛选与测序
对目的片段进行琼脂糖凝胶DNA回收，通过T4连接酶将目的基因和pcDNA3.1于16℃连接过夜，用于目的片段与真核表达载体的连接。大肠杆菌DH5c～感受态细菌的制备用CaC1：法；之后转化连接产物；阳性克隆的筛选：从含有Amp+的LB固体培养基上挑取数个单个菌落，分别接种于10mL LB液体培养基(Amp+)中，置于37℃摇床，过夜培养l2～14h。用质粒小提试剂盒提取质粒，进行质粒PCR、电泳检测。对于质粒PCR之后筛选的阳性克隆，进行酶切和1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将阳性克隆送往生物公司进行测序。
5.SNP位点筛查与啄羽行为的关联分析
利用DNAStar中的SeqMan软件查看测序结果，查找SNP位点，分析其多态性。应用最小二乘分析法分析与啄羽行为的关联，根据关联分析结果，找出与啄羽行为关系紧密的基因型。
应用：
1、在实际分子育种过程中，用上述方法检测到的与啄羽行为关联的突变基因型即作为分子标记，经过统计分析，凡是与啄羽行为关联度较高的基因型个体，即有较大的可能具有啄羽行为，可以选出隔离进一步观察。
2、将检测到的疑似蛋鸭群体进行单独隔离，按照正常的饲养密度(笼养：2-3只/笼；散养：10-15只/平方米)饲养，若出现啄羽，即进行淘汰，未出现啄羽的蛋鸭进行保留。
当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州大学
<120> 蛋鸭损伤性啄羽关联基因DEAF1分子标记及应用
<130> nm:
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TTAGG GGACT GTGGT GTGGA 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CCAGT GAAAA CAGCG GGGTA 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
AAAAT GGCGA GGAGA GTGGG 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
CCTCC GTAGT TCACA CAGGG 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
CAGTG GAATA GGGTG GGCTG 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
CTCAG TTCCC GCATC ACTCA 20