本发明涉及一种病原微生物的离体快速大量扩繁培养的方法，具体涉及一种离体快速大量扩繁葡萄霜霉病原菌的方法。
背景技术：
：葡萄霜霉病(Downymildew)是由葡萄霜霉菌[Plasmoparaviticola(Berk.dtCurtis)Berl.EtdeToni]引起，生物隶属卵菌门，卵菌纲，霜霉目，霜霉科，单轴霉属。该病原菌为二倍体活体营养型的专性寄生真菌(Wongetal.,2001)，是危害最为严重且影响最为广泛的病害之一(宋润刚等，1998)，是一种古老的世界性真菌病害，分布于世界上所有种植葡萄的国家和地区(Wong，F.P.,Burr，H.N,andWilcox，W.F.2001.HeterothallisminPlasmoparaviticola.PlantPathol.50:427-432)，严重影响着葡萄的产量和品质，严重的年份可减产70％-80％。萄霜霉菌为专性寄生菌，无法在合成培养基上培养，只能从活体的寄主组织中获取养分进行生长，该病害潜育一般为4-12d(王忠跃，2009)，主要受寄主抗性及环境条件的影响，且在室内培养条件下不易对菌原菌进行大量繁殖，培养难度大，这一度成为制约该病菌研究的障碍。因此筛选确定一套较优的培养条件对该病害的室内快速纯化与扩繁意义重大。技术实现要素：本发明的目的是提供一种操作简单易行、大量且快速扩繁葡萄霜霉病菌的方法。为达到上述目的，本发明采取葡萄霜霉病菌离体叶碟法培养方案，本发明离体扩繁葡萄霜霉病菌的方法，包括下述步骤：1)在培养皿中加入灭菌的质量百分浓度为1％的水琼脂，得到叶片保湿培养装置；2)选取对霜霉病菌敏感的葡萄品种，采集葡萄一年生新梢自上而下的第3-5片叶片，首先对采集的叶片进行镜检，确保叶面无霜霉菌落或菌丝后，清洗干净叶表面的灰尘，然后进行消毒处理；3)将步骤2)消毒处理后的葡萄叶片用直径2-2.5cm的打孔器从叶片中部打取叶圆片(绕开主脉和较大侧脉)，将叶圆片背面向上平摆在按照步骤1)所制备的保湿培养装置中，每个圆叶碟上滴10-20μl灭菌的蒸馏水；4)将葡萄霜霉病菌孢子囊制备成葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液，将悬浮液均匀涂布在水琼脂平板上，将涂孢子囊的平板切成2mm×2mm的琼脂块，在显微镜下将含单孢子囊的琼脂块倒扣到叶盘上来促使侵染，按照温度为16℃-25℃，湿度：70％-95％，光照时间：8h-16h/天，光照强度20-60μmolm-2s-1的条件培养4-7天，在叶圆片部位形成的菌落即为葡萄霜霉病菌单个孢子囊的纯培养物。所述方法中，步骤2)中，消毒处理的方法选用质量百分浓度为1％的次氯酸钠溶液处理30s-1min，再灭菌的去离子水清洗3-5遍，然后用灭菌的滤纸吸干叶片表面的水分。所述方法中，所述步骤4)中，所述质量百分浓度为3％的水琼脂平板的水琼脂厚度为2～3mm。所述方法中，所述步骤4)中，葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液的浓度为1x105-1x108个/ml。具体的操作方法可以为挑取新长的新鲜霜霉病菌转放入2ml灭菌的离心管中制成孢子囊悬浮液，采用水琼酯胶平板稀释法挑取单孢子囊。用灭菌的玻璃棒蘸取一滴制备好的孢子悬浮液于载玻片，并在显微镜下镜检计数，将孢子囊浓度调节到4×10倍下每视野1个孢子囊左右，以备平板涂布用。所述方法中，所述步骤1)中，所述培养皿是直径为90mm的玻璃培养皿，培养皿由皿底和皿盖组成；在培养皿底加入灭菌的质量百分浓度为1％的水琼脂15ml，盖上皿盖，得到叶片保湿培养装置。所述方法中，所述步骤4)中葡萄霜霉病菌孢子囊按照下述方法获得：在田间采集新鲜单个霜霉病病斑的葡萄病叶，用无菌水将病叶背面和表面冲洗3遍，然后把叶片放置在按照步骤1)所形成的保湿培养装置中，保持背面朝上，在叶背面的表面和培养皿盖上均喷一层雾滴，然后盖上皿盖，以保持湿度；放入叶片的培养皿置于光照培养箱培养2天，培养条件按照温度为16℃-25℃，湿度：70％-95％，光照时间：8h-16h/天，光照强度20-60μmolm-2s-1的条件；获得新长出的葡萄霜霉病菌孢子囊。所述培养条件优选为：温度21℃，光照周期16h白天/8h黑夜，光照强度40。优选的，所述对霜霉病菌敏感的葡萄品种为欧亚种里扎玛特。所述方法中，所述步骤4)中，以载玻片作为平板，制备水琼脂平板。这样方便在显微镜下操作。本发明的方法，首先诱导采集的葡萄霜霉病样在原寄生叶片上重新产生游动孢子，利用水琼酯胶平板稀释法分离获得纯的单个孢子囊培养物，然后用生物专用直头镊子(规格Ф0.05×0.01mm)直接大量挑取游动孢子囊转移到1％次氯酸钠处理过的葡萄叶圆片上，在温度21℃，光照周期16h白天/8h黑夜，光照强度40的条件下进行扩繁，其中，使用1％的水琼脂进行覆盖和分离。该方法简便易行，并且能够快速大量获得葡萄霜霉病菌纯培养物。本发明的发明人对上述方法分离的葡萄霜霉病菌按照同样的方法进行传代培养，结果发现，本发明的方法至少传代60代。本发明可应用于在离体情况下大量快速扩繁葡萄霜霉病菌的单孢培养物的条件，为葡萄霜霉病菌遗传分化和群体遗传特征的研究提供了技术支持。具体实施方式为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：离体扩繁葡萄霜霉病原菌的方法的设计优化及其效果葡萄霜霉病菌是专性寄生菌，无法在合成培养基上培养，因此，本发明的发明人为了使其便于离体大量培养，满足研究所需的数量，设计并筛选优化了培养条件。本发明设计使用适于离体培养的葡萄品种，制作叶碟，在具有适宜湿度的保湿装置下进行离体培养。具体步骤如下：1)采集葡萄霜霉单斑病叶10个，分别放在编号为1-10的塑料自封袋中；2)在培养皿(由皿底和皿盖组成)加入灭菌的水琼脂，盖上皿盖，得到叶片保湿培养装置；3)采集单个霜霉病病斑的葡萄病叶，用无菌水将病叶表面冲洗干净，把叶片放置在步骤2)的保湿培养装置，使叶片背面朝上，同时在叶背面和皿盖上喷雾滴(无菌水)，盖上皿盖，以保持湿度；4)把步骤3)中放入叶片的保湿培养装置置于光照培养箱培养2d。5)选取对霜霉病菌敏感的欧亚种里扎马特葡萄品种、红地球葡萄品种，并选取了奥迪亚无核葡萄品种为对照。采集一年生新梢上自上而下第3-4片幼嫩叶片，将采集的叶片首先进行镜检，确保叶面无霜霉菌落或菌丝后，用1％(质量百分浓度)次氯酸钠溶液消毒30s，用灭菌的蒸馏水冲洗3次，然后用灭菌的滤纸吸干叶片表面的水分；6)将消毒处理后的葡萄叶片用直径2cm打孔器在叶片上打取圆叶碟(绕开主脉和较大侧脉)。最后将圆叶碟背面向上平摆在步骤2)所示的保湿培养装置内的水琼脂上，每皿10个叶碟；7)用移液器在每个圆叶片滴20μl灭菌的蒸馏水，在用生物专用直头镊子(规格Ф0.05×0.01mm)，将经步骤3)培养过的霜霉病叶上新产生的单个游动孢子囊或单根游动孢子孢囊梗转放入2ml灭菌的离心管中制成孢子囊悬浮液，采用水琼酯胶平板稀释法挑取单孢子囊。用灭菌的玻璃棒蘸取一滴制备好的孢子悬浮液于载玻片，并在显微镜下镜检计数，将孢子囊浓度调节到4×10倍下每视野1个孢子囊左右，以备平板涂布用。转移到步骤6)的葡萄圆叶碟上，在皿盖(内部)和圆叶碟上喷细水雾滴(无菌水)，然后盖上皿盖，用封口膜封口，以便保持培养皿内部的湿度；8)将步骤7)的葡萄叶圆片按照步骤4)所述培养方法黑暗处理8h后用灭菌滤纸条吸走圆叶碟上部分水滴，继续在培养皿盖内部和葡萄圆叶碟上喷细水雾滴(无菌水)，继续按照步骤4培养7-10天，在叶圆碟部位形成的菌落即为葡萄霜霉病菌分离单孢的纯培养；9)将步骤8)培养出的霜霉病菌，直接大量挑取游动孢子囊到带有无菌水滴无菌葡萄叶上，按照步骤8)进行扩繁培养。对上述方法的各种条件进行优化，具体如下所示：a.适于离体培养的葡萄品种的优化选取每个品种(红地球，金手指、里扎马特、奥迪亚无核、巨峰)的一年生枝条，去掉梢冠选取第3-5片叶龄一致的嫩叶作为接种材料，将新鲜的霜霉菌用无菌水稀释成浓度为1×106个/ml的孢子囊悬浮液，按照上述的方法接种培养，接种后3-13d调查叶盘的发病情况，每天调查一次，记录叶盘初始发病时间，每天产生的病叶数及发病级数并计算病情指数(见表1)。根据农业部农药田间药效试验准则(二)制定的分级标准(农业部农药检定所，2004)，葡萄霜霉病病害严重度可分为6个级别：0级：未发病；1级：病斑面积占整个叶盘面积的比例小于5％；3级：病斑面积占整个叶盘面积的比例为6％ˉ25％；5级：病斑面积占整个叶盘面积的比例为26％ˉ50％；7级：病斑面积占整个叶盘面积的比例为51％ˉ75％；9级：病斑面积占整个叶盘面积的比例大于76％。根据统计的发病叶盘数及发病级数计算病情指数。病情指数＝100×∑(各级发病叶盘数×各级代表值)/(调查总叶盘数×最高级代表值)表1不同品种对葡萄霜霉病菌结果表明，里扎马特最适于葡萄霜霉病菌的生长。b.保湿装置的优化本发明发明人设计了利于大量培养的保湿装置(步骤2)种所述的保湿装置)，将水琼脂倒入培养皿中，并对水琼脂的浓度和量的影响进行了优化。培养基浓度的优化：以表1中优选出品种为里扎马特葡萄叶片作为接种材料，将采集的健康‘里扎马特’嫩叶先用质量百分浓度1％的次氯酸钠溶液消毒30s，后用无菌水冲洗2-3次，避免次氯酸钠残留影响实验结果。在超净工作台内，用打孔器(直径15mm)将采集的叶片打成圆叶盘(尽量绕开主脉和较大的侧脉)，叶面向下贴放于不同浓度(0.5％、1％、1.5％及2％)的水琼脂培养基上(15ml)，在叶盘中心位置滴15μl葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液。接种后，将其放于培养箱内(21℃，24h黑暗)培养，24h后取出，用灭菌滤纸条吸去多余菌液后用封口膜封口，继续培养(21℃，16h光照/8h黑暗)5d，然后分别刮取每个叶碟新鲜菌丝于2ml离心管中，然后滴加1ml无菌水制成孢子囊悬浮液，最后取10ul制成临时玻片，在显微镜20倍物镜下观察每个叶碟上产生的孢子囊的数量和畸形孢子囊数，结果见表2。表2不同培养基浓度对葡萄霜霉病菌孢子囊的影响培养基浓度(％)释放孢子囊数(个/mL)X105畸形孢子囊数(个/mL)0.50.00830811.0351011.51.00114520.995189不同培养基量的优化：根据表1和表2的结果，采用上述接种和培养方法，将葡萄霜霉病菌接种到不同量的含有葡萄叶片的水琼脂培养皿中，调查方法同上，结果见表3.表3不同培养基量对葡萄霜霉病菌孢子囊的影响培养基量(mL)释放孢子囊数(个/mL)X105畸形孢子囊数(个/mL)100.009125151.02567200.989147c.培养条件的优化在河北廊坊中国农业科学院廊坊葡萄霜霉病菌病叶，对此病样病原菌进行单孢纯化及扩繁培养条件的优化，首先，优化了步骤7)，在培养的时候，将带有单孢的水琼脂块覆盖在培养装置中的圆叶片上，这样既方便了纯化，也具有保湿作用，促进了扩繁，具体步骤如下所述：1、采集葡萄霜霉单斑病叶10个，分别放在编号为1-10的塑料自封袋中；2、在培养皿(由皿底和皿盖组成)加入灭菌的质量百分浓度为1％的水琼脂15ml，盖上皿盖，得到叶片保湿培养装置；3、采集单个霜霉病病斑的葡萄病叶，用无菌水将病叶表面冲洗干净，把叶片放置在步骤2的保湿培养装置，使叶片背面朝上，同时在叶背面和皿盖上喷雾滴(无菌水)，盖上皿盖，以保持湿度；4、把步骤3中放入叶片的保湿培养装置置于光照培养箱培养2d，培养条件为：培养条件设定为：温度分别为16℃、21℃、25℃，湿度：70％、80％、95％以上，光照时间：8h，12h，16h，光照强度：60、40、20；5、选取对霜霉病菌敏感的欧亚种里扎马特葡萄品种。采集一年生新梢上自上而下第3-4片幼嫩叶片，将采集的叶片首先进行镜检，确保叶面无霜霉菌落或菌丝后，用1％(质量百分浓度)次氯酸钠溶液消毒30s，用灭菌的蒸馏水冲洗3次，然后用灭菌的滤纸吸干叶片表面的水分；6、将消毒处理后的葡萄叶片用直径2cm打孔器在叶片上打取圆叶碟(绕开主脉和较大侧脉)。最后将圆叶碟背面向上平摆在步骤2所示的保湿培养装置内的质量百分浓度为1％的水琼脂上，每皿10个叶碟；7、用移液器在每个圆叶片滴20μl灭菌的蒸馏水，在用生物专用直头镊子(规格Ф0.05×0.01mm)，将经步骤3培养过的霜霉病叶上新产生的单个游动孢子囊或单根游动孢子孢囊梗放入2ml灭菌的离心管中制成孢子囊悬浮液，采用水琼酯胶平板稀释法挑取单孢子囊。用灭菌的玻璃棒蘸取一滴制备好的孢子悬浮液于载玻片，并在显微镜下镜检计数，将孢子囊浓度调节到4×10倍下每视野1个孢子囊左右，以备平板涂布用。以载玻片作为平板，将融化的3％的水琼脂培养基均匀的倒在载玻片上(注意，在制作平板时，培养基厚度应在2～3mm，过厚影响其透光性，过薄培养基很快变干又难以从载玻片上转移至葡萄叶盘上)；待平板上的培养基凝固后，用移液器取上述制备好的孢子囊悬浮液10μl滴在平板左侧，用无菌玻璃棒自左向右将悬浮液均匀涂布在3％的水琼脂平板上，用灭菌的接种刀将涂孢子囊的平板切成2mm×2mm的小琼脂块，在显微镜下将含单孢子囊的琼脂块倒扣到叶盘上来促使侵染，按照步骤4的条件进行培养4-7d，在叶圆片部位形成的菌落即为葡萄霜霉病菌单个孢子囊的纯培养物；8、将步骤7的葡萄叶圆片按照步骤4所述培养方法黑暗处理8h后用灭菌滤纸条吸走圆叶碟上部分水滴，继续在培养皿盖内部和葡萄圆叶碟上喷细水雾滴(无菌水)，继续按照步骤4培养4-10天，在叶圆碟部位形成的菌落即为葡萄霜霉病菌分离单孢的纯培养；9、将步骤8培养出的霜霉病菌，直接大量挑取游动孢子囊到带有无菌水滴无菌葡萄叶上，置于步骤4的培养条件，按照步骤8进行扩繁培养；10、显微镜下镜检步骤9形成的菌落；11、利用OMEGA公司的真菌基因组DNA提取试剂盒(D3390-02)进行提取步骤10培养好的菌落DNA，以GeneBank中已报到的P.viticola的ITS序列(DQ665668.1)为模版设计引物(序列1)PvITS-F：CCACACCTAAAAACTTTCCACG，(序列2)PvITS-R：TTGCCTGATATCAGGTCCAACTG，以所提取的菌落基因组DNA为模板，用引物PvITS-F/PvITS-R进行ITS序列扩增，同时设置水为模板的阴性对照。PCR反应体系：PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增得到PCR产物由上海生物工程股份有限公司进行测序分析，将所得的序列与NCBI登记的葡萄霜霉病菌序列(序列号：DQ665668.1)进行比对，同源性均为98％，因此证明新形成的菌落为葡萄霜霉病菌落，该菌落分离自田间采集的病样，从而说明田间采集的病样确为霜霉病样。12、结果发现，光照培养箱温度达到16℃时，培养6～7天才会产生新菌丝，生长周期较长；培养箱温度为21℃时，培养约4天可产生出新菌丝；培养箱温度达到25℃时，培养4～5天可以长出新菌丝，但由于温度较高，培养时培养箱内的湿度难以达到理想状态，接种叶盘上的水膜也容易挥发。因此温度选定为21℃恒温培养。病原菌侵染嫩叶的相对湿度要求在70％～80％以上，且卵孢子在有水膜或水滴覆盖的情况下易萌发产生孢子囊，实验证明当培养箱内相对湿度达到95％～100％时叶盘表面水膜保存时间较长，菌丝生长情况较好。光照因素对病原菌的生长也有一定的影响，光照梯度设置8h，12h，16h，在温度、湿度一致的情况下，发现培养箱内光照时间8h和12h时，培养约6天可产生新菌丝，且菌丝较为稀疏；培养箱内光照达到16h时，发现培养约4天即可产生新菌丝，且菌丝生长状况较好。孢囊梗、孢子囊的形成至少需要4h黑暗条件，因此选出光照培养最适条件为16h光照/8h黑暗，光照强度40。培养条件的优化不同光照时间的筛选根据上述的处理方法，将接种好霜霉病菌分别置于光照梯度为8h，12h，16h，在温度、光照强度、湿度一致的情况下(21℃、40Lux，95％以上)，培养4-13d，接种后3-13d，在3d后开始调查叶盘的发病情况，每天调查一次，记录叶盘初始发病时间，每天产生的病盘数及发病级数并计算病情指数，结果见表4.表4不同光照时间对葡萄霜霉病侵染及产孢能力的影响光照时间(h)潜育期(d)产孢数量(个/mL)x105(10d)病情指数(10d)860.08955.84±1.26c1271.2357.48±8.45b1641.6488.34±5.09a不同光照强度的筛选根据上述的处理方法，将接种好霜霉病菌分别置于光照梯度为20Lux、40Lux、60Lux，在光照时间、温度、湿度一致的情况下(16h、21℃、95％以上)，培养4-13d，接种后3-13d，在3d后开始调查叶盘的发病情况，每天调查一次，记录叶盘初始发病时间，每天产生的病盘数及发病级数并计算病情指数，结果见表5。表5不同光照度对葡萄霜霉病侵染及产孢能力的影响光照度(Lux)潜育期(d)产孢数量(个/mL)x105(10d)病情指数(10d)2060.89835.64±7.34b4071.6782.48±2.49a60100.0091.35±0.05c不同湿度的筛选根据上述的处理方法，将接种好霜霉病菌分别置于湿度为70％、80％、95％以上，在光照时间、温度、光照强度一致的情况下(16h、21℃、40Lux、)，培养4-13d，接种后3-13d，在3d后开始调查叶盘的发病情况，每天调查一次，记录叶盘初始发病时间，每天产生的病盘数及发病级数并计算病情指数，结果见表6。表6.不同湿度对葡萄霜霉病菌侵染及产孢能力的影响湿度(％)潜育期(d)产孢数量(个/mL)x105病情指数(10d)7061.10545.54±6.34c8061.34278.68±6.89b95以上41.65288.34±7.51a根据上述的处理方法，将接种好霜霉病菌分别置于湿度16℃、21℃、25℃培养箱中，在光照时间、湿度、光照强度一致的情况下(16h、95％以上、40Lux、)，培养4-13d，在3d后开始调查叶盘的发病情况，每天调查一次，记录叶盘初始发病时间，每天产生的病盘数及发病级数并计算病情指数，结果见表7。表7.不同温度对葡萄霜霉病菌侵染及产孢能力的影响温度(℃)潜育期(d)产孢数量(个/mL)x105病情指数(10d)1680.00319.35±1.05c2141.67385.48±5.49a2570.78674.14±1.09b本发明的发明人对上述方法分离的葡萄霜霉病菌按照同样的方法进行传代培养，结果发现，本发明的方法至少传代60代。当前第1页1 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