黑曲霉麸曲的制备方法与流程

本发明涉及发酵工程技术领域，具体地说，涉及一种制备黑曲霉麸曲的方法。

背景技术：

柠檬酸是一种重要的有机酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。

近年来，柠檬酸的世界总产量急剧上升，我国柠檬酸产量达80多万吨，出口60多万吨，出口创汇5亿多美元，产量及出口量居世界第一，目前已成为世界上最大的柠檬酸生产和出口的国家。目前，黑曲霉利用糖类发酵生产柠檬酸是重要的生物合成途径。优良的菌种对于柠檬酸发酵起着决定性的作用，我国柠檬酸发酵生产达到了相当高的水平，但不容忽视的问题是，我国柠檬酸生产行业制备黑曲霉麸曲还是采用传统工艺，一批发酵的种子需要制备很多三角瓶麸曲，三角瓶麸曲由斜面直接接种，制备过程劳动量大，且在接种前需要进行抽查，检验其发酵能力，工艺繁琐，无法形成标准化生产。而采用固体罐制备麸曲又存在设备投资过大且无法均分固体麸曲接入种子罐，一旦染菌则浪费大等弊端，工业化生产可行性较低。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用自动/半自动化机械设备制备黑曲霉麸曲的方法，这种生产方式可直接将培养合格的麸曲接入种子罐，简化了麸曲制备的工艺，改变了传统以手工操作为主的制作麸曲的固有模式。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种黑曲霉麸曲专用培养钢瓶(图1和图2)，所述培养钢瓶为圆柱体，容积20-30L，包括钢瓶主体、出料口、设置在钢瓶顶部中央的进料口(也是通气口)、设置在钢瓶肩部的接种进气口，以及与进料口相匹配、可拆卸的瓶盖；其中，出料口可设置于钢瓶底部或钢瓶肩部，当出料口设置于钢瓶肩部时，从出料口向钢瓶内部连有一条伸入钢瓶底部的管道，出料口连有一个可拆卸的接头，所述接头通过螺纹(螺纹可拆卸基座)旋拧固定在钢瓶肩部。伸入钢瓶内部的管道可以采用卡箍式连接，将伸入罐底的弯管部分与顶部直管部分连接，可分别拆卸取下，方便清洗。接种进气口和出料口可分别连接软管。

所述培养钢瓶为304不锈钢材质，内径和高度比为1:1.2～1.5。工作温度：20℃～50℃，工作压力：0.02-0.1MPa。灭菌温度：115℃～121℃。

所述瓶盖采用通气内盖和密封外盖双盖结构；内盖(图3和图4)采用上下双层支撑骨架结构；两层支撑骨架之间为过滤通气介质，用上层支撑骨架将所述过滤通气介质通过内盖内壁螺纹旋紧固定于下层支撑骨架上；优选地，所述支撑骨架采用“井”字形或田字格设计；外盖(图5)通过内丝螺纹与内盖上相匹配的外丝螺纹旋紧固定，在麸曲转种过程中起到密封作用。优选地，内盖、外盖之间设有密封垫圈。

其中，所述过滤通气介质包括无纺布、超细玻璃纤维纸、静电纺纳米纤维网等。例如，可将所述过滤通气介质通过内盖内壁螺纹旋紧固定在下层支撑骨架上，达到通气隔菌的目的，且这种设计便于取下所述过滤通气介质进行更换。

本发明还提供一种黑曲霉麸曲的制备方法，先对麸曲制作原料麸皮或玉米芯进行淘洗，淘洗后的麸皮或玉米芯经离心脱水，使原料含水量降至55％-70％，然后将麸皮或玉米芯装入本发明的培养钢瓶中，灭菌后接入黑曲霉，将钢瓶置于摇瓶机上进行培养，将培养合格的黑曲霉麸曲直接接入种子罐中进行扩大培养。

前述的方法，每只钢瓶接入1200g～1500g麸皮或玉米芯(玉米芯粉碎后过孔径4-6mm的筛板)，然后在进料口上仅盖内盖，并用纱布包扎好接种进气口和出料口，于115℃～121℃灭菌50～70min。

前述的方法，将黑曲霉制成孢子悬液，活菌数0.5×10⁷～1×10⁸个/mL，然后按料液比1000～2000g：10～20mL将孢子悬液从接种进气口接入灭菌后的钢瓶中。

前述的方法，可以将4～8个接种完成的钢瓶，横卧放置在摇瓶机上，采用钢卡固定；摇瓶机设定频率为20～30Hz，培养间温度35℃～37℃，培养时间6～8天；培养过程中，钢瓶进料口上仅盖内盖，并将接种进气口、出料口包扎好纱布。

优选地，本发明所用摇瓶机为独轴旋转式摇瓶机，最大转速为500rpm且变频可调，偏心距为30～50mm。

前述的方法，将钢瓶中培养合格的麸曲直接接入种子罐中进行扩大培养，具体操作步骤为：①取下钢瓶接种进气口处的纱布，接上无菌软管，并用喉箍固定；②取下钢瓶出料口处的纱布，接上无菌软管，将软管连接种子罐接种口，并用喉箍固定；③打开无菌空气管阀门，使无菌空气从接种进气口进入钢瓶内，并用无菌空气将培养钢瓶内的麸曲从出料口吹入种子罐内，持续5～10min；④取下接种进气口处无菌软管，换接无菌水管道，并用喉箍固定；⑤打开无菌水管阀门，用无菌水冲洗培养钢瓶内部，持续5～10min，将钢瓶内残余麸曲冲洗进入种子罐，进行扩大培养；⑥冲洗完成后，取下空钢瓶，进行灭菌处理，备用。

在本发明的一个具体实施方式中，制备所述黑曲霉麸曲的具体步骤如下：

(1)将黑曲霉接种于PDA斜面培养基上活化，在35-37℃下培养4-7天，得到黑曲霉斜面菌种；

(2)将步骤(1)中培养好的斜面菌种使用适量无菌水将孢子洗下，制得孢子悬液待用；

(3)将麸皮或玉米芯放入洗面筋机中，加入清水，开启洗面筋机，功率2～5kw，运行5～10min后，打开洗面筋机的放水口，放出洗水；再加入清水，反复操作4～5次，完成原料淘洗；

(4)将步骤(3)中洗完的原料转入离心机，设定离心机转速频率30～40Hz，运行2～5min，此时原料中水分含量为55％～70％，然后将脱水后的麸皮或玉米芯装入钢瓶中进行灭菌；

(5)灭菌结束后，待钢瓶温度降至室温，用无菌针管或吸管，将步骤(2)中制作的孢子悬液，通过接种进气口在火焰下接入钢瓶内，并包扎好纱布；

(6)将步骤(5)中接种完成的钢瓶横卧放置在摇瓶机上培养；

(7)待麸曲培养结束，将培养合格的麸曲钢瓶从摇瓶机上取下，旋紧进料口上的外盖后，准备下一步接种种子罐用于扩大培养。

可将采用本发明工艺制得的黑曲霉麸曲用于工业化发酵生产柠檬酸。

本发明通过使用自动化/半自动化机械设备以及配套的培养钢瓶进行黑曲霉麸曲的生产，改变了传统麸曲制备过程中使用大量三角瓶，制备过程劳动量大，工艺繁琐，无法实现标准化生产的固有模式。采用本方法进行黑曲霉麸曲培养，有利于大规模工业化生产，降低劳动强度，提高了生产效率，在产酸持平的情况下，节约劳动力成本，具有良好的经济效益。

附图说明

图1为本发明黑曲霉麸曲专用培养钢瓶的结构示意图。

图2为所述培养钢瓶上部的放大结构示意图。

图3为所述培养钢瓶的瓶盖内盖结构示意图。

图4为所述培养钢瓶的瓶盖内盖俯视图。

图5为所述培养钢瓶的瓶盖外盖结构示意图。

图中，①-进料口，②-接种进气口，③-出料口，④-螺纹可拆卸基座，⑤-卡箍式连接，⑥-内盖上层支撑骨架，⑦-过滤通气介质，⑧-内盖下层支撑骨架，⑨-内盖内外丝螺纹，⑩-密封垫圈。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的洗面筋机为小型卧式双螺旋结构，底部带有过滤排水口。离心机容量为30～50kg，转速变频可调。摇瓶机为独轴旋转式摇瓶机，最大转速为500rpm且变频可调，偏心距为30～50mm。

在本发明的描述中，除非另有说明，术语“上”、“下”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1黑曲霉麸曲专用培养钢瓶

本发明提供的黑曲霉麸曲专用培养钢瓶(图1和图2)，所述培养钢瓶为圆柱体，容积20L，包括钢瓶主体、出料口(接种出料口)、设置在钢瓶顶部中央的进料口(也是通气口)、设置在钢瓶肩部的接种进气口，以及与进料口相匹配、可拆卸的瓶盖；其中，出料口设置于钢瓶肩部，从出料口向钢瓶内部连有一条伸入钢瓶底部的管道，出料口连有一个可拆卸的接头，所述接头通过螺纹(螺纹可拆卸基座)旋拧固定在钢瓶肩部。伸入钢瓶内部的管道可以采用卡箍式连接，将伸入罐底的弯管部分与顶部直管部分连接，可分别拆卸取下，方便清洗。接种进气口和出料口可分别连接软管。

所述培养钢瓶为304不锈钢材质，内径和高度比为27:37。工作温度：20℃～50℃，工作压力：0.02-0.1MPa。灭菌温度：115℃～121℃。

所述瓶盖采用通气内盖和密封外盖双盖结构；内盖(图3和图4)采用上下双层支撑骨架结构；两层支撑骨架之间为过滤通气介质，用上层支撑骨架将所述过滤通气介质通过内盖内壁螺纹旋紧固定于下层支撑骨架上；优选地，所述支撑骨架采用“井”字形或田字格设计；外盖(图5)通过内丝螺纹与内盖上相匹配的外丝螺纹旋紧固定，在麸曲转种过程中起到密封作用。在内盖、外盖之间设有密封垫圈。

其中，所述过滤通气介质包括无纺布、超细玻璃纤维纸、静电纺纳米纤维网等。可将所述过滤通气介质通过内盖内壁螺纹旋紧固定在下层支撑骨架上，达到通气隔菌的目的，且这种设计便于取下所述过滤通气介质进行更换。

实施例2黑曲霉麸曲的制备方法

本实施例提供的黑曲霉麸曲的制备方法，包括以下步骤：

(1)将黑曲霉接种于PDA斜面培养基上活化，在37℃下培养6天，得到黑曲霉斜面(茄瓶斜面)菌种；

(2)将步骤(1)中培养好的斜面菌种使用适量无菌水将孢子洗下，制成活菌数0.5×10⁷～1×10⁸个/mL的孢子悬液，待用；

(3)将麸曲原料如麸皮放入洗面筋机中，加入清水，开启洗面筋机，功率2～5kw，运行5min后，打开放水口，放出洗水；再加入清水，反复操作5次，将原料清洗完成；

(4)将步骤(3)中清洗完成的原料，转入离心机，设定离心机转速频率30Hz，运行2min，此时原料中水分含量为68％；

(5)将步骤(4)中的原料按每钢瓶1300g分装至20L培养钢瓶中，旋紧内盖，并用纱布包扎好接种进气口和出料口软管，送入高压灭菌锅内，121℃灭菌60min；

(6)灭菌结束后，待钢瓶温度降至室温，用无菌针管或无菌吸管，将步骤(2)中制作的孢子悬液，按料液比1500g麸皮或玉米芯：20mL孢子悬液，通过接种进气口在无菌火焰下接入钢瓶内，并包扎好纱布；

(7)将步骤(6)中接入黑曲霉的钢瓶横卧放置在独轴旋转式摇瓶机上，摇瓶机设定频率为25Hz，培养间温度37℃，培养8天；

(8)待麸曲培养结束，将培养合格的麸曲钢瓶从摇床上取下，旋紧外盖后送往种子罐准备接种；

(9)接入种子罐的具体操作如下：①取下钢瓶接种进气口处的纱布，接上无菌空气软管，并用喉箍固定；②取下钢瓶出料软管口处的纱布，将软管接上种子罐接种口，并用喉箍固定；③开无菌空气管阀门，使无菌空气从接种进气口进入钢瓶内，并用无菌空气将培养钢瓶内部的麸曲吹入种子罐内，持续5min；④取下接种进气口处无菌空气管道，换接无菌水管道，并用喉箍固定；⑤开无菌管水阀门，用无菌水冲洗培养钢瓶内部，持续5min，将钢瓶内残余麸曲冲洗进入种子罐；⑥冲洗完成后，取下接种钢瓶，送入灭菌锅内，于121℃灭菌15min；

(10)待钢瓶灭活完成并将至室温，将钢瓶内、外盖以及出料管道拆卸清洗，更换内盖过滤介质，放入洗瓶机中清洗、备用。

采用以上制备黑曲霉麸曲的方法与传统黑曲霉麸曲生产工艺进行试验对比：

传统黑曲霉麸曲生产工艺(以300m³发酵罐为例)

工艺路线：

菌种→一级试管斜面→二级试管斜面种子罐→三角烧瓶麸曲瓶(120只)→种子罐→发酵罐

菌种→茄瓶斜面→20L钢瓶(4只)→种子罐→发酵罐

按上述两种方法制得的黑曲霉麸曲，接入种子罐培养合格后，以同样的接种量接入50L、500L以及10m³不同规格的发酵罐，连续3批次，以体现其可重复性，产酸数据见表1-表3：

表1 50L发酵罐数据

表2 500L发酵罐数据

表3 10m³发酵罐数据

以上种子罐和发酵罐中发酵生产柠檬酸所用原料均采用玉米原料经过液化处理后得到，液化过程加入α-淀粉酶。其中种子罐总糖含量为90g/L～110g/L；发酵罐总糖含量为150g/L～170g/L。

由以上数据可知，采用本发明方法制备的黑曲霉麸曲和传统工艺相比，无论在种子罐扩大培养阶段还是发酵产酸阶段，产酸水平和培养周期均在同一水平。而在培养制备麸曲阶段，由于使用自动化/半自动化机械设备以及配合20L培养钢瓶进行柠檬酸麸曲的生产，改变了传统麸曲制备过程中使用大量三角瓶，制备过程劳动量大，工艺繁琐，无法实现标准化生产的固有模式。降低了劳动量，提高了生产效率，在产酸持平的情况，节约了用工成本，提高了经济效益。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。