解淀粉芽孢杆菌菌株、菌剂及菌剂的制备方法与流程

本发明涉及微生物
技术领域：
，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株、菌剂及菌剂的制备方法。
背景技术：
：随着人们肉食结构的改变和生活水平的不断提高，牛肉越来越受到消费者的青睐，而牛肉的嫩度是影响消费者评定牛肉质量最重要的一个因素，所以肉类嫩化的相关研究逐渐成为人们关注的热点之一。在中国部分役用牛、水牛和山区放养的老龄黄牛也被适时地作为肉用，这类牛肉的质构特性相对较差，但对中国肉食结构的改善是重要的补充。特别是在欠发达地区和中档以下的餐厅具有较大的市场，所以采取科学、有效、安全的技术措施，改善这类牛肉的品质，具有重要的现实意义。牛肉嫩度主要受宰前和宰后因素的影响，宰前因素主要包括牛的种类、性别、年龄、肌肉部位和营养状况等，不同品种的牛，生产出的牛肉的嫩度也不一致。牛的年龄越大，牛肉的肌原纤维就会变得越粗，肉质就会越老。肌肉的部位不同，其嫩度也会有差异，其中背最长肌的嫩度就没有腰大肌的好。宰后因素主要是采用所特定的技术手段来破坏肌原纤维结构、使结缔组织性质发生改变，从而来改善牛肉的嫩度。目前国内外对宰后嫩化的研究比较多，主要包括物理嫩化法、化学嫩化法、酶嫩化法等。物理嫩化法主要有高压嫩化法，高压嫩化法具有效果明显、作用均一的优点，不会增加微生物污染的机会，还可以起到杀菌的效果；有机酸、氯化钙、磷酸盐对改善牛肉的嫩度也有一定的影响；酶法嫩化是最近研究的热点，使用方便，效果显著，该方法主要的酶是蛋白酶，从植物提取和微生物培养，植物中提取的主要有木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶，可降解肌原纤维，从而提高肉的嫩度，但是这类蛋白酶由于受到原料的限制，实际应用因成本问题有一定的困难。微生物源的蛋白酶对肉品嫩化效果不一，难以实现标准化控制。而随着肉品加工业的不断发展，特别是肉类中式菜肴的工业化生产，就希望有安全、高效、可控的优质肉类嫩化剂来保障菜肴工业化生产过程中的标准化。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种解淀粉芽孢杆菌菌株，可以产蛋白酶，用于牛肉制品的嫩化效果明显。本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌剂，具有安全、可控等优势。本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，方法简单、可大规模生产。为解决上述技术问题，提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌株，所述解淀粉芽孢杆菌菌株为解淀粉芽孢杆菌D7(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2016年11月10日，保藏编号为CGMCCNo.13250。作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌剂，所述解淀粉芽孢杆菌菌剂由上述的解淀粉芽孢杆菌菌株经活化、发酵培养制备得到。作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：S1、将解淀粉芽孢杆菌菌株接种到肉汤培养基中活化得到活化液；S2、将所述活化液接种到发酵培养基中进行发酵培养得到解淀粉芽孢杆菌菌剂。上述的制备方法，优选的，所述S1步骤中，所述活化具体为：在37℃下，以220r/min摇床培养12h～14h。上述的制备方法，优选的，所述发酵培养基的成分包括：10～20g/L的葡萄糖、10～20g/L的酵母浸出汁、1～3g/L的NaCl、2g/L的CaCl、5g/L的磷酸氢二钾、1.25g/L的磷酸二氢钾、0.01g/L的硫酸镁、0.001g/L的硫酸铁；所述发酵培养基的pH为7.0～7.66。上述的制备方法，优选的，所述S2步骤中，所述活化液的接种量为3％。上述的制备方法，优选的，所述S2步骤中，所述发酵培养的具体过程为：在30℃～37℃下以220r/min转速摇床培养47h～49.2h。与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌D7，该菌株分离自贵州传统豆豉和甜酒曲中，可产生透明圈，这就说明此菌株具有产蛋白酶的能力，对牛肉能花效果明显，具有较高的食用安全性。(2)本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌剂，有较大的潜力开发成商业化的食品嫩化剂，将牛肉制品浸渍于该菌剂中，在水浴锅27℃酶解50min后，测定其质构特性，其硬度值相对于浸泡在水中显著下降。(3)本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，制备方法简单，条件可控，适用于工业化生产。解淀粉芽孢杆菌D7(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13250，保藏日期：2016年11月10日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。附图说明为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为实施例1的解淀粉芽孢杆菌菌株电子显微镜下的革兰氏染色特征图。图2为实施例1的解淀粉芽孢杆菌菌株平板培养菌落图以及斜面特征图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。其中解淀粉芽孢杆菌D7(Bacillusamyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13250，保藏日期：2016年11月10日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。实施例1：一种解淀粉芽孢杆菌菌株，发明人从贵州传统豆豉和甜酒曲中分离得到。对该菌进行形态特征的研究后，将其作用于牛肉制品中，显示出该菌株作为肉品专用嫩化剂的优势，有较大的潜力开发成商业化的食品嫩化剂。产蛋白酶的细菌22株，从中筛选出1株酶活较高的菌株，命名为解淀粉芽孢杆菌D7，酶活达71.68U/g。解淀粉芽孢杆菌D7，在分离培养基上，菌株D7呈白色，光滑湿润菌落，稍隆起，菌落中间有褶皱，为有芽孢革兰氏阳性杆菌，图1为解淀粉芽孢杆菌菌株电子显微镜下的革兰氏染色特征图。解淀粉芽孢杆菌D7在斜面上呈薄膜状，表面白色。该菌株具有产蛋白酶的能力，对牛肉制品的嫩度有一定的影响，且周边会产生清晰可见的透明圈，取解淀粉芽孢杆菌D7，用分离培养基，对解淀粉芽孢杆菌进行纯培养，37℃生化培养基箱培养24h，菌落周边清晰可见透明圈，菌落图参见图2。而后将其进行斜面(分离培养基)保存。分离培养基配方：蛋白胨：10g、葡萄糖：1g、NaCl：5g、CaCl：0.1g、L-酪氨酸：0.1g、琼脂：15g、干酪素：5g、蒸馏水：1000mL；pH值：7.2～7.4。实施例2一种解淀粉芽孢杆菌菌剂，采用以下制备方法制备得到：(1)挑取实施例1斜面培养基中解淀粉芽孢杆菌菌株，接种到肉汤培养基中，在37℃下，以220r/min摇床培养12h，活化得到活化液。(2)将活化液按照接种量为3％接种到发酵培养基中，在37℃下以220r/min摇床培养48h，得到解淀粉芽孢杆菌菌剂。发酵培养基配方：葡萄糖：16.8g、酵母浸出汁：20g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.66。将实施例2的解淀粉芽孢杆菌菌剂应用于牛肉嫩化，具体步骤为：将牛肉浸渍于发酵液中30min、50min、70min、90min、110min后，测定其硬度值，其结果见下表1。表1：不同时间点解淀粉芽孢杆菌菌剂对牛肉嫩化效果组别0min30min50min硬度15159.24±476.92a13212.39±619.1b9920.63±453.48d组别70min90min110min硬度10872.49±197.98cd12745.5±622.5bc13445.28±264.99b表1中a、b、c、d表示差异显著(p<0.05)。从表1的结果可知：将牛肉浸泡在实施例2的解淀粉芽孢杆菌菌剂中，当浸泡时间在50min以后，其牛肉的嫩化效果明显，相比于不浸泡的牛肉，其硬度降低了34.6％。实施例3一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)从贵州传统豆豉和甜酒曲中分离解淀粉芽孢杆菌。该菌株呈白色，光滑湿润菌落，稍隆起，菌落中间有褶皱，为有芽孢革兰氏阳性杆菌，且周边会产生清晰可见的透明圈。在斜面上呈薄膜状，表面白色。(2)将菌株用分离培养基进行纯培养，37℃生化培养基箱培养24h，而后将其进行斜面保存。分离培养基配方：蛋白胨：10g、葡萄糖：1g、NaCl：5g、CaCl：0.1g、L-酪氨酸：0.1g、琼脂：15g、干酪素：5g、蒸馏水：1000mL；pH值：7.2～7.4。(3)挑取斜面培养基中解淀粉芽孢杆菌菌株，接种到肉汤培养基中，在37℃下，以220r/min摇床培养12h，活化得到活化液。(4)将活化液按照接种量为3％接种到发酵培养基中，在37℃下以220r/min摇床培养48h，使酶活达到101.26U/g。发酵培养基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.0。实施例4一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其中发酵培养基配方为：葡萄糖：10g、酵母浸出汁：15g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.0。其余步骤与实施例3相同，培养后的发酵液酶活为108.29U/g。实施例5一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其中发酵培养基配方为：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.5。其余步骤与实施例3相同，培养后的发酵液酶活为93.21U/g。实施例6一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其中发酵培养基配方为：葡萄糖：16.8g、酵母浸出汁：20g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.66。其余步骤与实施例3相同，培养后的发酵液酶活为111.96U/g。分别将牛肉浸泡在实施例3～6的解淀粉芽孢杆菌菌剂中，并以蒸馏水作为对比，测定牛肉的硬度值，测定结果参见表1。表1：不同培养基培养得到的解淀粉芽孢杆菌菌剂对牛肉硬度值的影响组别蒸馏水组实施例3实施例4实施例5实施例6硬度12392.6±651.18712.0±143.28380.3±186.88848.2±700.77537.0±339.86从表1的结果可知：实施例3至6的解淀粉芽孢杆菌菌剂可显著降低牛肉的硬度，其中实施例3中牛肉的硬度相对于蒸馏水组下降了29.7％、实施例4下降了32.4％、实施例5下降了28.6％、实施例6下降了38.8％。实施例7一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)挑取实施例1斜面培养基中解淀粉芽孢杆菌菌株，接种到肉汤培养基中，在37℃下，以220r/min摇床培养12h，活化得到活化液。(2)将活化液按照接种量为3％接种到发酵培养基中得到混合液，取50mL上述混合液于250mL的锥形瓶中(即装液量为50mL)，在31℃下以220r/min摇床培养48h得到解淀粉芽孢杆菌菌剂。该解淀粉芽孢杆菌菌剂的酶活达到100.72U/g。发酵培养基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.0。实施例8一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其中步骤(2)的摇床培养条件是：接种量3％、转速220r/min、装液量50mL、时间48h、温度37℃，其余步骤与实施例7一致。培养后的发酵液酶活为88.34U/g。实施例9一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其中步骤(2)的摇床培养条件是：接种量3％、转速220r/min、装液量70mL、时间48h、温度37℃，其余步骤与实施例7一致。培养后的发酵液酶活为89.7U/g。实施例10一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其中步骤(2)的摇床培养条件是：接种量3％、转速220r/min、装液量71.3mL、时间49.2h、温度30.8℃，其余步骤与实施例7一致。培养后的发酵液酶活为125.55U/g。分别牛肉浸泡在实施例7～10的解淀粉芽孢杆菌菌剂中，并以蒸馏水作为对比，测定牛肉的硬度值，测定结果参见表2。表2：不同培养条件得到的解淀粉芽孢杆菌菌剂对牛肉硬度值的影响组别蒸馏水组实施例7实施例8实施例9实施例10硬度13209.7±142.99058.7±121.69501.6±736.49091.4±199.57299.83±522.1从表2的结果可知：实施例7至10的解淀粉芽孢杆菌菌剂可显著降低牛肉的硬度，其中实施例7中牛肉的硬度相对于蒸馏水组下降了31.4％、实施例8下降了28.1％、实施例9下降了31.2％、实施例10下降了45.9％。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。当前第1页1 2 3