紫扇贝、海湾扇贝与杂交后代母本来源的鉴定方法与流程

本发明属于扇贝杂交育种的后裔鉴定技术，尤其是涉及紫扇贝、海湾扇贝与杂交后代母本来源的鉴定方法。

背景技术：

海湾扇贝(Argopecten irradians)自1982年从美国引进以来,产量逐年增加，已成为中国最重要的养殖贝类之一，但是近年来出现的种质退化问题成为制约中国扇贝养殖业发展的严重障碍。

紫扇贝(Argopecten purpuratus)是南美洲太平洋海岸的优良经济贝类，大小中等，广泛养殖于智利和秘鲁，并使智利成为仅次于中国的扇贝养殖大国。为了改善海湾扇贝的种质，提高扇贝养殖业的经济产量，王春德等于2008年从秘鲁引进紫扇贝并与海湾扇贝成功杂交，培育出生长优势极其显著的两种杂交子一代，即紫海杂交扇贝(紫扇贝卵子×海湾扇贝精子)和海紫杂交扇贝(海湾扇贝卵子×紫扇贝精子)(王春德等，2009；Wang et al,2011)。但紫扇贝和海湾扇贝均为雌雄同体的动物，在繁育时两种扇贝均同时排放精子和卵子，在育种实践中存在着精子或卵子污染的问题，为确保育种进程的顺利进行并确证后代的谱系，经常需要确定某一后代是否为真正的杂交后代及其父母本来源，因此需要建立一种方法来快速鉴定其亲本来源尤其是母本来源。

利用来自核基因组的分子标记(如微卫星标记)鉴定方法虽然也可以用来鉴定杂交后代是否为真正的杂交种，但是无法辨别其父母本来源，导致杂交后代谱系混乱、难以对优良的品系进行筛选等问题，而且在杂交试验中发现，用作杂交的母体不同，其杂交子一代性状的表现也不同，有的甚至完全表现为母体的性状，因此快速鉴定杂交扇贝的母本来源是非常必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种紫扇贝、海湾扇贝与杂交后代母本来源的鉴定方法，该方法是基于线粒体DNA序列的差异性而设计的标记引物，并利用该标记引物序列鉴定紫扇贝、海湾扇贝与杂交后代母本的来源，以弥补现有技术的不足。

研究已发现，线粒体基因组严格遵循母系遗传规律，且缺少基因重组，杂交后代的线粒体必定来自其母本，因此通过鉴定其线粒体DNA的来源就可以确定杂交种的母本来源。本发明根据海湾扇贝和紫扇贝线粒体基因组差异性特点，专门设计了一对特异性引物，以便通过PCR方法鉴定杂交后代线粒体基因的类型，从而实现快速鉴定杂交扇贝的母本来源。

本发明基于以下构思：已有研究表明，扇贝的线粒体基因组遵循严格的母系遗传，即后代的线粒体基因与其母本线粒体基因型完全相同，而与父本的线粒体基因型无关；具体到海湾扇贝和紫扇贝均为Argopecten属的近缘种，虽然其线粒体基因组序列相似性高达82.34％，但仍可以根据两者线粒体基因序列的少许差异设计出特异的引物，从而区分杂交后代线粒体基因的来源，为育种工作的顺利进行提供技术支持或保障。

本发明是通过如下技术方案来实现的：紫扇贝、海湾扇贝与杂交后代母本来源的鉴定方法，所用标记引物为mtDNA-Z，分别由左端引物序列mtDNA-Z-F：5’-TATGAGGTGTCCCCCAAGTC-3’和右端引物序列mtDNA-Z-R：5’-ACTGGCAGACAAACAAATCGT-3’组成。

本发明利用上述标记引物对紫扇贝、海湾扇贝及其杂交后代母本来源进行鉴定的方法如下：

(1)分别取待鉴定的紫扇贝、海湾扇贝及杂交后代紫海杂交扇贝、海紫杂交扇贝的闭壳肌，直接用常规的方法提取上述扇贝的全基因组DNA，用TE缓冲液稀释至终浓度100ng/μL保存在-20℃备用；

(2)分别以提取的上述扇贝的DNA为模板，用上述引物mtDNA-Z对其进行PCR扩增，反应体系为10μL，包括0.25U Taq DNA酶(Takara Inc.,Shiga,Japan),1×PCR buffer(含1.5mM MgCl₂)和0.2mM dNTP mix,上下游引物各1μM,50ngDNA模板；反应程序为：94℃预变性3min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,30个循环，72℃延伸10min；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统照相观察；对于紫扇贝和海湾扇贝，如果在近460bp处有PCR特异性条带出现，则证明此扇贝为紫扇贝，如果在近460bp处没有PCR特异性条带出现，则证明此扇贝为海湾扇贝；对于紫海杂交扇贝和海紫杂交扇贝，如果在近460bp处有PCR特异性条带出现，则确定其母本为紫扇贝，如果在近460bp处没有PCR特异性条带出现，则确定其母本为海湾扇贝。

本发明具有如下优点：

(1)本发明基于线粒体DNA序列的引物设计排除了核基因组DNA的影响，因此不需要单独提取线粒体DNA来进行鉴定，利用常规提取的全基因组中的少量线粒体DNA，即可用标记引物mtDNA-Z进行PCR扩增，经琼脂糖电泳检测后就能够得到鉴定结果，因此周期时间短，方法简便，可大批量进行，快速高效。

(2)本发明基于线粒体DNA序列设计的特异性引物能够快速简便地鉴别出两个杂交后代及其两个亲本。

附图说明

图1是本发明实施例1中所用标记引物mtDNA-Z PCR扩增紫扇贝、海湾扇贝产物的电泳图，其中1-6：海湾扇贝，7-12:紫扇贝，M:DL 2000。

图2是本发明实施例2中所用标记引物mtDNA-Z PCR扩增杂交后代紫海扇贝、海紫扇贝产物的电泳图，其中1-8：海紫扇贝，9-16：紫海扇贝，M:Marker。

具体实施方式

实施例1以紫扇贝、海湾扇贝为例，进行鉴定的结果。

(1)分别取6个紫扇贝和6个海湾扇贝的闭壳肌，直接用天根DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全基因组DNA，用TE缓冲液稀释至终浓度100ng/μL保存在-20℃备用，然后经1.2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统照相观察以确保提取的全基因组DNA的纯度和质量符合要求。

(2)以上述提取的紫扇贝和海湾扇贝的DNA为模板，用上述引物mtDNA-Z对其进行PCR扩增，反应体系为10μL，包括0.25U Taq DNA酶(Takara Inc.,Shiga,Japan)，含1.5mM MgCl₂的1×PCR buffer,0.2mM dNTP mix，上下游引物各1μM，50ngDNA模板。反应程序为：94℃预变性3min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统照相观察电泳结果。

(3)电泳结果鉴别表明，在所有的海湾扇贝中均未扩增出条带(见图1)，而在所有的紫扇贝均在460bp附近扩增出明显的条带，大小与预期的463bp相符。将上述紫扇贝中的扩增产物纯化后测序结果大小为460bp，与紫扇贝的线粒体DNA序列进行DNAMAN比对，测得序列与紫扇贝线粒体DNA的片段相似度为97.81％(见表1),从而排除了mtDNA-Z引物受核基因组的影响，确定为以紫扇贝线粒体DNA作为模板进行的PCR扩增反应。显然本发明设计的引物能够鉴定出紫扇贝与海湾扇贝。

表1测序结果比对表

实施例2以紫海杂交扇贝、海紫杂交扇贝为例进行鉴定的结果。

(1)分别取紫海杂交扇贝(紫扇贝(卵)×海湾扇贝(精))和海紫杂交扇贝(海湾扇贝(卵)×紫扇贝(精))各8个的扇贝闭壳肌，用天根DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)分别提取全基因组DNA，用TE缓冲液稀释至终浓度100ng/μL保存在-20℃备用，提取的全基因组DNA经1.2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统照相观察以确保提取的全基因组DNA的纯度和质量符合要求。

(2)以上述提取的紫海杂交扇贝和海紫杂交扇贝的DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，反应体系为10μL，包括0.25U Taq DNA酶(Takara Inc.,Shiga,Japan)，1×PCR buffer(含1.5mM MgCl₂),0.2mM dNTP mix，上下游引物各1μM，50ngDNA模板。反应程序为：94℃预变性3min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统照相观察电泳结果。

(3)电泳结果鉴别表明，所有的紫海杂交扇贝均在460bp附近扩增出明显的条带，大小与预期的463bp相符，而在所有的海紫杂交扇贝中均未扩增出条带(见图2)，说明本发明设计的引物对鉴定紫扇贝与海湾扇贝杂交后代的母本来源是无误的。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 紫扇贝、海湾扇贝与杂交后代母本来源的鉴定方法

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<211> 463

<212> DNA

<213> 紫扇贝（Argopecten purpuratus）

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tagaattttt ccacaaggct atattttttg ttttattcta ctattctttt tcggtggtgc 120

aagaataatg gtgctttaca ccagggtaat acacggaagg ttttcgactg ccctggttcc 180

tggggggtct ggaattacga agtgtagtta tcttggtctt ttccatgggg tgccgttaat 240

tattttgttt tttttacctg cgttcttgtc tttgcgggct cttcggagcg gtctttaaga 300

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ttaaatgggt ggcgagagcg atgagattgt acaagacccg ggataaaggc taagagaagg 420

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