用两核苷酸重复的微卫星鉴定人源亲缘关系的方法与流程

本发明涉及检测人源生物样本同一性的DNA指纹技术，即人源亲缘关系的鉴定，尤其涉及一种用两核苷酸重复的微卫星鉴定人源亲缘关系的方法。

背景技术：

短串联重复序列（Short tandem repeat，STR）或称微卫星（Microsatellite）被认为是第二代遗传标记。微卫星是由于早期在对基因组DNA进行离心时发现它们像卫星一样分布于DNA离心的主条带周围而得名。微卫星是一串有2至5个碱基序列重复5至50次组成的串联序列，在人类基因组中广泛分布，微卫星的突变率（5×10-4左右）远远高于其它位置的DNA的突变率（DNA上的点突变率为5×10-7左右）。微卫星的突变形式主要以重复次数的改变为主。

由于微卫星的高突变性，在人群中其在一个基因座位上拥有多个等位基因，微卫星变异一般以整个重复单位的增加或减少为基础，如两碱基重复突变CACACACACACA（6次重复），其突变体可能为CACACACACACACACA（8次重复）或CACACACACA（5次重复）或其它重复，这种重复单位次数变化的多态性，可能是在DNA复制时由于DNA聚合酶的沿模版链的滑动造成的（如图1所示），这样的突变如果发生在生殖细胞形成的过程中，从而被保留下来，并在人群中形成了多态性。

目前有两种关于微卫星多态性形成的模型，一种为逐步突变模型，即微卫星的突变以重复单位为基准逐步增加或递减，如6次重复的微卫星突变为8次重复，必须先由6次重复变为7次重复再变为8次重复；另一种模型为滑动模型，认为微卫星重复次数的突变并不需要逐步进行；或者还有更加复杂的突变模式。

因为微卫星的高度多态性，在单一基因座位上，其可能有 3～5个甚至更多的等位基因，因此只要选择不少于10个的微卫星，就可以使得其个体识别率达到99.99%以上。这一特性非常有利于亲缘鉴定或犯罪现场罪犯生物残留物鉴定，因此该鉴定方法在法医学上已被广泛运用，被称为DNA指纹。现在，对实验室细胞株的遗传一致性检测也以微卫星分型为标准。因为微卫星是DNA长度的多态性，其可用凝胶电泳的方法进行分型，检测方便。早期由于电泳条件的限制，人们对微卫星标记用聚丙烯胺凝胶电泳的方法进行鉴定，多采用4碱基重复的STR作为DNA指纹，如现在的AmpF/STR试剂盒中仍然有多个4碱基重复STR，用聚丙烯酰胺凝胶电泳就可进行片段大小检测，这在初期给STR的检定带来了便宜。但用4碱基重复STR进行亲缘鉴定时仍有其不足，主要是突变率较高，有的4碱基重复STR 突变率可达1﹣8×10^-3/代之多，是2碱基重复STR的4倍之多，而且有的4碱基STR并不表现为核心序列的重复差异，偶尔会有单个或2个的碱基插入，这给对其等位基因的分类带来了复杂性。随着技术的发展，特别是毛细管电泳及荧光标记（即荧光染料）的发明，差异更小的STR如2碱基重复的STR已经能用毛细管电泳进行准确及快速的片段大小鉴定，突变率比4碱基重复STR小，且复杂等位基因非常少，因此，2碱基重复的STR将是进行生物DNA指纹鉴定更好的标记。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上所述缺陷，提供一种用两核苷酸重复的微卫星鉴定人源亲缘关系的方法，突变率低，增强了鉴定的可靠性；改进了扩增用引物使鉴定结果更加清晰明显，增加了位点的数目，提高检测准确性，并且可用于非直系亲属亲缘性的初步鉴定。

为了解决以上所述技术问题，本发明所述用两核苷酸重复的微卫星鉴定人源亲缘关系的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）引物设计选择距离基因功能位点至少1百万碱基对（Mb）的人类基因组上的30个STR位点，逐一参照所述STR位点两侧的序列设计并人工合成每个STR对应的小核苷酸序列作为引物，所述引物的退火温度为55-65℃；所述引物见表1；

（2）引物修饰在正向引物5'端连接荧光染料FAM或HEX，以使不同片段带有不同荧光，便于电泳检测；在反向引物5'端加上“GTTTCTT”或“GTTTCT”碱基序列，以消除两碱基重复核苷酸STR电泳时产生的滑移峰；

（3）扩增、电泳

（a）各个对应多聚酶链式反应的条件：各对引物在扩增体系中的终浓度见表1；PCR反应条件为：95℃ 5 min，之后以95℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s为一个循环进行10个循环，再以89℃ 30 s、 60℃ 30 s、72℃ 30 s为一个循环进行25个循环，最后72℃ 20 min，得到PCR产物；

（b）将步骤（a）所得PCR产物进行PCR分组和毛细管电泳分组，所述PCR分组是根据实验测定，把不会相互干扰的引物归为一组，将引物分为PCR1、PCR2、……PCR9九个组，每一组放在一个孔里进行反应扩增；所述毛细管电泳分组以符合颜色或PCR片段大小其中至少有一项区别于组中其它STR进行分组，将所述PCR产物分为Panel1、Panel2、……Panel5五组，每一组放在一个泳道中进行毛细管电泳；进行毛细管电泳时所述PCR产物的最终稀释倍数为125倍；

（4）鉴定根据毛细管电泳检测所得结果，不同的等位基因在电泳检测图上显示为不同的峰，如为进行亲子鉴定，不同两个人的生物样本在相同位点的分型结果相同，且30个微卫星均遵循此规则，即可判定二者有亲缘关系；如为生物样本检测，另一样本必须同时在相同位点有两个峰，并且30个微卫星均遵循此规则即可判定这两个样本来源于同一个体或细胞系。

作为优选，本发明所述步骤（1）引物设计，所述引物的退火温度为60℃。

本发明所述方法采用两核苷酸重复的STR，比传统的四核苷酸重复STR突变率更低，增强了鉴定的可靠性；且所述方法中的30个STR均匀分布于人类基因DNA特定区段（即人常染色体上并远离有功能的基因），最大化的去除了连锁及自然选择作用的干扰，因而在对每个位点进行频率及相似性判断时，不会受到其它因素的干扰，结果独立可信；为了避免在对2碱基STR进行电泳时出现干扰，即DNA聚合酶在对STR进行扩增时与在体内一样也会滑动，且体外电泳无DNA修复系统，因此这些滑动更容易被检测到，从而干扰实验结果，为此，本发明所述方法在反向引物上加入了“GTTTCTT”或“GTTTCT”预防扩增时滑移峰的产生，使得真正的特征峰在电泳中得以显现，有效避免了在PCR扩增时滑移峰的干扰，使鉴定结果更加清晰明显。

本发明所述方法包含30个STR，数量上远多于现有DNA指纹检测试剂盒，位点数量上的增多增加了检测的准确性。本发明所述方法还可用于对二级亲属的亲缘性进行初步鉴定，由于使用的STR数量较多，根据理论可知，二级亲属与被鉴定者的遗传相似度为1/4，30个STR共60个等位基因（人为2倍体），应该有大约60/4=15个等位基因相似，而两个随机个体有15个等位基因相似的概率非常底（在不考虑基因频率并认为大约每个座位有5种等位基因的情况下，此概率约为 p = (1/5)15 ≈ 3.3×10-11），且本发明所述方法中的30个STR均匀分布于人类基因DNA特定区段（即人常染色体上并远离有功能的基因），最大化的去除了连锁及自然选择作用的干扰，因而在对每个位点进行频率及相似性判断时，不会受到其它因素的干扰，更加独立可信。

本发明的有益效果：本发明设计了一套包含人源30个STR位点的检测技术，本发明所述方法采用的位点数量多，鉴定准确率得以提高；均用两核苷酸重复的STR，比传统的四核苷酸重复STR突变率更低，增强了鉴定的可靠性；对扩增用引物进行了修饰使鉴定结果更加清晰明显；本发明所述方法可用于犯罪调查、亲子鉴定或人源细胞鉴定。

附图说明

图1为微卫星形成机制，方块代表微卫星的重复单元，箭头代表新DNA链的合成及合成方向：1a为DNA复制时DNA聚合酶沿模版链的滑动图，正常的无突变DNA复制；1b为DNA复制时DNA聚合酶发生滑动，新DNA链多加入了一个重复单元；1c为DNA复制时DNA聚合酶发生滑动新DNA链多减少了一个重复单元；

图2为微卫星多色荧光毛细管电泳检测结果图；

图3为用同一样本进行D7S655的扩增的滑移峰检测图：3a为用加了“GTTTCT”的引物进行扩增的结果显示；3 b为用不加“GTTTCT”的引物进行扩增的结果显示。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明所述用两核苷酸重复的微卫星鉴定人源亲缘关系的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）引物设计选择距离基因功能位点至少1百万碱基对（Mb）的人类基因组上的30个STR位点，逐一参照所述STR位点两侧的序列设计并人工合成每个STR对应的小核苷酸序列作为引物，所述引物的退火温度为55-65℃；其中优选的退火温度为60℃；所述引物决定了后续扩增的染色体位置及产物片段大小，STR位置相隔越远越好，避免位点近的连锁不平衡引起的检测效能降低；片段大小不同有利于后期在同一电泳道上一次检测多个位点；

（2）引物修饰在正向引物5'端连接荧光染料FAM或HEX，以使不同片段带有不同荧光，便于电泳检测；在反向引物5'端加上“GTTTCTT”或“GTTTCT”碱基序列，以消除两碱基重复核苷酸STR电泳时产生的滑移峰；

（3）扩增、电泳

（a）各个对应多聚酶链式反应的条件：各对引物在扩增体系中的终浓度见表1；PCR反应条件为：95℃ 5 min，之后以95℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s为一个循环进行10个循环，再以89℃ 30 s、 60℃ 30 s、72℃ 30 s为一个循环进行25个循环，最后72℃ 20 min，得到PCR产物；

（b）将步骤（a）所得PCR产物进行PCR分组和毛细管电泳分组，所述PCR分组是根据实验测定，把不会相互干扰的引物归为一组，将引物分为PCR1、PCR2、……PCR9九个组，每一组放在一个孔里进行反应扩增；所述毛细管电泳分组以符合颜色或PCR片段大小其中至少有一项区别于组中其它STR进行分组，将所述PCR产物分为Panel1、Panel2、……Panel5五组，每一组放在一个泳道中进行毛细管电泳；进行毛细管电泳时所述PCR产物的最终稀释倍数为125倍；

（4）鉴定根据毛细管电泳检测所得结果，不同的等位基因在电泳检测图上显示为不同的峰，如为进行亲子鉴定，不同两个人的生物样本在相同位点的分型结果相同，且30个微卫星均遵循此规则，即可判定二者有亲缘关系；如为生物样本检测，另一样本必须同时在相同位点有两个峰，并且30个微卫星均遵循此规则即可判定这两个样本来源于同一个体或细胞系。

实施例：所述STR、引物、引物修饰、引物终浓度、退火温度、最终稀释倍数、PCR分组和毛细管电泳分组见表2。

本发明所述方法需要的生物样本提取的DNA较少，约50ng就足够。商业化合成表2中的引物后，将这30对引物按PCR引物进行稀释和正、反向引物配对混合，使其浓度达到表2中引物终浓度的20倍，如此可同时进行多个STR的PCR扩增，减少工作量；如对于D1S2757，将其正向（F向）和反向（R向）引物加入TE溶液,使其两个引物的浓度均为6.4μM（pmol/ul）。根据实验测定，把不会相互干扰的引物放一起作为一组，将引物分为PCR1、PCR2、……PCR9九个组（表2中PCR1、PCR2、……PCR9），如将D1S2757、D1S2626、D3S1620分为一组即PCR1组，每一组放在一个孔里进行反应，共分为9个孔进行PCR反应。

电泳分组要符合颜色与PCR片段大小其中至少有一项区别于组中其它STR，如将 D1S2757、D1S2626、D3S1620、D2S2221、D3S1558五个STR的PCR产物放在一个泳道中进行电泳，其为泳道Panel1组，电泳分组见表2。

表2：人源亲缘鉴定的30个微卫星标记的引物设计、引物修饰及相关信息

PCR反应，每个反应总体积20μL，按下述配比加入商业化的PCR扩增试剂（以Transgen公司的试剂为例，此扩增试剂可换为其它公司的产品，只需满足其DNA聚合酶有热启动效应即可）：10×TransStart buffer2μL、dNTP（2.5 mM）1.6μL、TransStart DNA聚合酶（2.5 unit/μL） 0.25μL，在以上三种扩增试剂的混合液中加入各分组混合好的PCR引物1μL，如以PCR1组为例，加入D1S2757（正、反向引物浓度均为6.4μM）、D1S2626（正、反向引物浓度均为6.4μM）、D3S1620（正、反向引物浓度均为6.4μM）三种引物混合物各1μL，以及模版DNA 2μL（约2～5ng），最后加双蒸水至总体积为20μL，即可进行PCR反应。扩增试剂可选择商业化的热启动酶系统。

PCR反应在Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600（Applied Biosystems，Carlsbad，California，USA）或其它热循环仪上进行，反应条件为：95℃ 5 min，之后进行10个循环（95℃ 30 s,，57℃ 30 s，72℃ 30 s），再进行25个循环（89℃ 30 s， 60℃ 30 s，72℃ 30 s）以及最终72℃ 20 min，得到PCR产物。

将扩增后的PCR产物按表2中的电泳分组（panel1，panel2，……panel5）（分组要符合颜色和PCR片段大小其中至少有一项区别于组中其它STR）。分别混合PCR产物并同时用蒸馏水或去离子水进行稀释，将稀释后的产物加入荧光内部标记（如Lifetech公司的GeneScan LIZ500或ROX 500,）及Hi-Di（Lifetech，HiDi Formamide）的混合液中以达到最后的稀释倍数——125倍（见表2），并按照所选电泳器（如Lifetech公司的3730电泳仪）的说明书进行电泳，结果用Lifetech公司的GeneMapper软件或SoftGenetics公司的GeneMarker软件读取。

如电泳分组panel1：各取PCR1产物和PCR2产物4μL加入42μL蒸馏水混匀（先稀释12.5倍），再取1μL混合产物加入0.25μL的荧光内部标记并加入7.75μL的Hi-Di（再稀释10倍），使其总稀释倍数是原PCR产物的125倍，即可用其进行电泳。如电泳分组panel4：取PCR7产物4μL（12.5倍稀释）和PCR8产物20μL（2.5倍稀释）加入26μL蒸馏水混匀，再取1μL混合产物加入0.25μL的荧光内部标记并加入7.75μL的Hi-Di（再稀释10倍）并用其进行毛细管电泳即可，根据毛细管电泳检测所得结果进行STR的同源性比对。

根据毛细管电泳检测所得结果，参见图2，不同的等位基因在图上显示为不同的峰。如在Panel1中最小的蓝色峰（最左边）表示检测的微卫星有两个等位基因（杂合子），一个大小为158碱基对（bp，base pair），一个为172bp。如果进行亲子鉴定，另一生物样本在此位点的分型结果必须有一个等位基因为158bp或172bp，并且所有用于检测的微卫星（30个）均需要遵循此规则，才能判断其有亲缘关系。如为生物样本检测，另一样本必须同时有158bp和172bp的两个峰，并且所有用于检测的微卫星（30个）均需要遵循此规则才能判断这两个样本来源于同一个体（或细胞系）。图中只有1个峰的位点，如Panel1中从左向右数第二个绿色位点，表示此位点为纯合子，即其父源染色体和母源染色体均为同一大小，可以看作其有两个相同大小的峰，在进行亲缘鉴定和生物样本鉴定时仍然遵循上述规则。

在对2碱基STR进行电泳时，也会遇到问题。因为与体内一样，在体外，DNA聚合酶在对STR进行扩增时也会滑动，并且体外无DNA修复系统，因此这些滑动更容易被检测到，从而干扰实验结果，因此，本发明所述方法在反向引物上加入了“GTTTCTT”或“GTTTCT”预防扩增时滑移峰的产生，使得真正的特征峰在电泳中得以显现。图3为用同一样本进行D7S655的扩增，其中图3a为用加了“GTTTCT”的引物进行扩增所得结果，图3b为用不加“GTTTCT”的引物进行扩增所得结果，可见图3b的主峰不明显，存在PCR扩增时的滑移峰干扰。

本发明所述方法还将各种不同颜色的扩增分开进行，可将不同颜色的扩增产物分别进行电泳（如图2中panel 5a 和panel 5b），适用于多种检测平台，有些平台对某些荧光无特定检测手段，表现出颜色不对，这时就可以分开跑，不用根据颜色来区分位点。本发明所述方法可以运用对于一些较老的测序及片段分析平台（如ABI377系统）、或者一些没有相应荧光颜色矫正的平台，扩大了实用性。

以上仅为本发明的部分实施方式，只要使用了以上所述方案，均应落入本发明的保护范围。