一种改进的无细胞合成系统及其应用的制作方法

本发明属于蛋白制备技术领域，具体涉及一种改进的无细胞合成系统及其应用。

背景技术：

天然内膜蛋白质存在于生物膜的脂类环境中，但是目前研究内膜蛋白质的技术是首先把它们分散在水溶液的环境中，参照水溶性蛋白质的方法进行操作。为了有效的研究内膜蛋白质，将其溶解于水环境是必要的前提。目前通常是通过加入去污剂使得内膜蛋白质和脂类在水中形成可溶性的复合物来完成的。内膜蛋白质的溶解是一个粗暴的处理过程，在此过程中经常会发生蛋白质变性和/或聚集。为了避免蛋白质的损失和失活，该过程优化时需要非常小心。因此溶解过程是处理膜蛋白质的最关键的步骤。

骨骼肌受体酪氨酸激酶(MuSK)是存在于哺乳动物体内的一种抗原蛋白，骨骼肌受体酪氨酸激酶是一种与乙酰胆碱受体相关的跨膜蛋白，在骨骼肌的发展中，骨骼肌受体酪氨酸激酶是建立突触后膜时组建主要突触骨架的首要要求，重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种由自身抗体引起的、累及神经肌肉接头(NMJ)处的自身免疫性疾病，肌肉特异性激酶抗体(MuSKAb)在重症肌无力中的起病和病情发展中起着很重要的作用.目前关于骨骼肌受体酪氨酸激酶抗体在重症肌无力中的作用仍是国际上研究的热点之一，该研究对骨骼肌受体酪氨酸激酶有着一定的需求量.但是该蛋白在普通的表达系统中很难表达，由于较强的疏水性，几乎是不表达的。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决上述问题而提供。

本发明通过以下技术方案实现：

1.骨骼肌受体酪氨酸激酶基因的合成和克隆

从GeneBank中查找分泌型表达人肌肉特异性激酶的cDNA，取其24-495AA的氨基酸序列,在不改变氨基酸序列的前提下，按照大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后合成基因序列。序列见序列表1，以PCR方法分别引入双酶切位点到该序列两端。

2.重组质粒的构建

PCR扩增得到的1.4kb条带胶回收并用内切酶双酶切，载体pET28a同样用同样的内切酶双酶切，回收大的片段。然后用T4DNA连接酶连接载体和目的片段，以其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。筛选重组子得到重组质粒pET28a-MuSK。

3.大肠杆菌S30抽提物的制备

S30抽提物指能使用S30缓冲液从大肠杆菌提取的将DNA转录为mRNA和/或将mRNA翻译为多肽的体外反应混合物的制备物。所述抽提物包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA，氨基酸和核糖体等。S30抽提物是本领域公知的，并且描述于例如《In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems》Geoffrey Zubay,1973。可按照以下方法获得大肠杆菌抽提物。可选择众多适于大肠杆菌生长的培养基，例如2YTPG培养基，然后本领域技术人员应该了解，许多培养基可适合本目的。用合适的细胞悬浮缓冲液悬浮大肠杆菌细胞，用高压均质机破碎，离心，去除沉淀，得到大肠杆菌抽提物。所有步骤均在冰上操作。菌株用BL21(DE3)。

4.半连续无细胞蛋白合成反应

标准的半连续无细胞蛋白合成反应包括如下成分：57mM HEPES-KOH(pH8.2)，1.2mM ATP，0.85mM GTP，0.85mM UTP，0.85mM CTP，0.64mM cAMP，200mM谷氨酸钾，80mM醋酸铵，15mM醋酸镁，34μg/mL folinic acid，6.7μg/mL pET28a-MuSK质粒，33μg/mL T7RNA聚合酶，20种氨基酸各500μM，2％PET8000，33mM磷酸烯醇式丙酮酸，和24％大肠杆菌抽提物。

对于半连续的表达体系，300μL标准反应混合物装于D-Tube^TM Dialyzer Midi(Thermo，3.5kDa)中，4.5mL供应试剂(Feeding buffer)装于50mL Corning离心管中。将D-Tube^TM Dialyzer Midi放入50mL离心管中。供应试剂没有模板，没有T7RNA聚合酶，其余与标准反应混合物一致。配制好相应反应液和供应液，加入反应体系中，30℃孵育过夜。离心，分离上清和沉淀，骨骼肌受体酪氨酸激酶为膜蛋白，膜蛋白因为自身的疏水性，表达即沉淀。

5.沉淀处理

沉淀用PBS重悬，离心，去掉上清，重复该步骤2次。用1mL 0.5％-1.5％弱去污剂溶液重悬沉淀，加少量还原剂到终浓度为5mM。30℃，220rpm，震荡1h至沉淀全部溶解。离心，取上清。加入分散剂至终浓度为0.2％-2％，50mM GSSG至终浓度1-5mM，100mM GSSH至终浓度2-8mM。离心管放置4℃，静置12h。取出静置后的蛋白，透析于TE缓冲液3天。透析期间TE缓冲液更换2次。离心，得到上清。即为最终的骨骼肌受体酪氨酸激酶蛋白溶液。

作为进一步的优选，所述S30缓冲液包括：

作为进一步的优选，沉淀处理中添加的弱去污剂为SKL，

Triton X210，辛烷基葡糖苷，脱氧胆酸盐，SDS,CTAB,Tween 20,NP40等，优选为SKL，溶液浓度为0.5％。

作为进一步的优选，沉淀处理中添加的50mM GSSG至终浓度1mM，100mM GSSH至终浓度2mM。

作为进一步的优选，沉淀处理中加入分散剂为PEG 4000。

作为进一步的优选，还原剂为DTT、DTE、GSH、β-巯基乙醇等，优选为DTT。

本发明的有益效果是：

(1)采用无细胞表达体系表达骨骼肌受体酪氨酸激酶蛋白，克服了疏水结构表达难的问题，能够制备出一般表达系统制备不出的蛋白产物。

(2)采用无细胞高效表达的蛋白后处理的过程，对无细胞大量表达的蛋白沉淀进行先变性后复性的方法，制备出了免疫活性较好的活性蛋白，克服了普通无细胞表达的低表达量和需要添加脂质体才有活性的问题。

附图说明

图1实施例一制备的骨骼肌受体酪氨酸激酶蛋白的电泳图，可见60kDa处有一明显条带，大小和蛋白的大小基本一致。

图2实施例二制备的骨骼肌受体酪氨酸激酶蛋白的电泳图，可见60kDa处有一明显条带，大小和蛋白的大小基本一致。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

实施例一

1.骨骼肌受体酪氨酸激酶基因的合成和克隆

从基因文库中获取分泌型表达人肌肉特异性激酶的mRNA，取其24-495AA的氨基酸序列按照大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化后合成基因序列。序列见序列表1，以合成的DNA作为PCR模板，

上游引物为，SEQ ID NO：2

引物序列为：5’-GATCGGATCCCTGCCGAAAGCGCCG-3’，

下游引物为，SEQ ID NO：3

引物序列为：5’-ATG AAGCTTAATATCACGCACATAT-3’，

分别引入BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点。PCR反应条件:95℃预变性4min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，进行30个循环，72℃延伸6min。

2.重组质粒的构建

PCR扩增得到的1.4kb条带胶回收并用内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切，载体pET28a同样用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，回收大的片段。然后用T4 DNA连接酶连接载体和目的片段，以其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。利用LB氨苄青霉素卡那霉素平板筛选重组转化子，挑取转化子做菌落PCR，对有目的条带的转化子菌落提取重组质粒用内切酶酶切进一步鉴定，并送上海生工生物技术有限公司进行测序，得到重组质粒pET28a-MuSK。

3.大肠杆菌抽提物S30的制备

抽提物指能将DNA转录为mRNA和/或将mRNA翻译为多肽的体外反应混合物的制备物。所述抽提物包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA，氨基酸和核糖体等。S30抽提物是本领域公知的，并且描述于例如《In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems》Geoffrey Zubay,1973。可按照以下方法获得大肠杆菌抽提物。可选择众多适于大肠杆菌生长的培养基，例如2YTPG培养基，然后本领域技术人员应该了解，许多培养基可适合本目的。用合适的细胞悬浮缓冲液悬浮大肠杆菌细胞，用高压均质机破碎，离心，去除沉淀，得到大肠杆菌抽提物。所有步骤均在冰上操作。菌株用BL21(DE3)。

4.半连续无细胞蛋白合成反应

标准的半连续无细胞蛋白合成反应包括如下成分：57mM HEPES-KOH(pH8.2)，1.2mM ATP，0.85mM each of GTP，UTP和CTP，0.64mM cAMP，200mM谷氨酸钾，80mM醋酸铵，15mM醋酸镁，34μg/mL folinic acid，6.7μg/mL pET28a-MuSK质粒，33μg/mLT7RNA聚合酶，500μM 20种氨基酸各500μM，2％PET8000，33mM磷酸烯醇式丙酮酸，和24％大肠杆菌抽提物。

对于半连续的表达体系，300μL标准反应混合物装于D-Tube^TM Dialyzer Midi(Thermo，3.5kDa)中，4.5mL供应试剂(Feeding buffer)装于50mL Corning离心管中。将D-Tube^TM Dialyzer Midi放入50mL离心管中。供应试剂没有模板，没有T7RNA聚合酶，其余与标准反应混合物一致。

半连续的表达体系要求2个反应环境，中间由一个半透析膜隔开，适宜制备级别的蛋白生产。反应室(Reaction Room)RM包含大分子底物，例如酶和核酸。另一个供应室(Feeding Room)FM包含低分子前体，例如氨基酸、能量生产物质和核苷酸。FM将新鲜的前提物质引入RM，同时有抑制作用的分解产物持续地从RM排入FM。因此，半连续的表达体系产量显著提高，反应时间延长。配制好相应反应液和供应液，加入反应体系中，30℃孵育过夜。离心，分离上清和沉淀，骨骼肌受体酪氨酸激酶为膜蛋白，膜蛋白因为自身的疏水性，表达即沉淀。

5.沉淀处理

沉淀用PBS重悬，离心，去掉上清，重复该步骤2次。用1mL 0.5％SKL溶液重悬沉淀，加DTT到终浓度为5mM。30℃，220r，震荡1h至沉淀全部溶解。离心，取上清。加入20％PEG 4000至终浓度为0.2％，50mM GSSG至终浓度1mM，100mM GSSH至终浓度2mM。离心管放置4℃，静置12h。取出静置后的蛋白，透析于TE缓冲液3天。透析期间TE缓冲液更换2次。离心，得到上清。即为最终的骨骼肌受体酪氨酸激酶蛋白溶液。

实施例二

步骤1-4和实施例一步骤1-4一样，

5.沉淀处理

沉淀用PBS重悬，离心，去掉上清，重复该步骤2次。用1mL 1.5％SKL溶液重悬沉淀，加DTT到终浓度为5mM。30℃，220rpm，震荡1h至沉淀全部溶解。离心，取上清。加入20％PEG 4000至终浓度为2％，50mM GSSG至终浓度5mM，100mM GSSH至终浓度8mM。离心管放置4℃，静置12h。取出静置后的蛋白，透析于TE缓冲液3天。透析期间TE缓冲液更换2次。离心，得到上清。即为最终的骨骼肌受体酪氨酸激酶蛋白溶液。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

<110> 武汉金开瑞生物工程有限公司

<120>一种改进的无细胞合成系统及其应用

<130> 2016

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<213> 人工序列

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