一种米根霉菌及其发酵百药煎的方法与流程

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一株根霉菌及其在中药五倍子发酵炮制百药煎中的应用。
背景技术：
：百药煎是一种中药发酵炮制品，始载于《丹溪心法》，为五倍子、茶叶与酒曲(酒糟)经发酵制成的块状物。性味酸甘，平。具有润肺化痰，生津止渴的功效。临床多用于治疗久咳痰多，咽痛，便血，久痢脱肛，口疮，牙疳，痈肿疮疡。五倍子主要有效成分为鞣质，易与胃肠道中的蛋白质结合成沉淀，刺激胃肠粘膜，会引起少数人产生食欲不振等不良反应。发酵成百药煎后，鞣质含量降低，其收敛作用增强，可能会减少对胃肠粘膜的刺激性，减少和消除了食欲不振等不良反应。目前生产多采用安琪酿酒曲，认为黑曲霉是百药煎发酵过程中的关键菌株，五倍子生料固体发酵采用黑曲霉菌株更适合单宁酶的生产，且固体发酵具有发酵过程参数难以测定、过程控制困难，菌体生长、发酵以及代谢产物在发酵体系中分布不均等不足，导致产品稳定性较差、重复性较低，给百药煎的发酵过程带来不便，使百药煎质量不稳定的问题。因此，研究更好的百药煎发酵方法以控制百药煎质量的稳定性，提高鞣质转化为没食子酸的效率，确保其在临床的安全使用是目前急需解决的技术问题。技术实现要素：针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种米根霉菌及其发酵百药煎的方法，可有效解决固体发酵具有发酵过程参数难以测定、过程控制困难，菌体生长、发酵以及代谢产物在发酵体系中分布不均等不足，导致产品稳定性较差、重复性较低，给百药煎的发酵过程带来不便，百药煎质量不稳定的问题。本发明解决的技术方案是，本发明所述的根霉菌株其分类命名为根霉属(Rhizopussp.)BYJ.G-1，已于2016年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2016583，经检测存活，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心。其制备方法为：以含米根霉酒曲为原料，采用稀释涂布平板法，涂布在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，于30℃恒温培养，分离出具有根霉典型特征的菌株，进行分离培养，筛选出一株使百药煎中没食子酸含量最高的根霉菌，命名为BYJ.G-1，经鉴定为米根霉；所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基是由：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g和自来水1000ml制成。利用米根霉菌发酵百药煎的方法是：将五倍子药材洗净，60℃干燥10h，粉碎，过80目筛，备用；按照每10g五倍子粉取茶叶1-3g，将茶叶碾成粗粉，加8-10倍量的蒸馏水煎煮10-15min，放至23-27℃，过滤，将茶叶渣和茶叶汁分开，每1g茶叶得茶汁10mL，将五倍子粉末与含有纯种BYJ.G-1菌的酒曲按照质量比10:0.4-4混匀，加茶叶渣与20-30％的茶汁混匀，制软材；或将相对于五倍子粉末重量5％-8％的浓度为1×108个/mL的BYJ.G-1菌的孢子混悬液与五倍子粉、茶叶渣、20-30％的茶汁混匀，制软材；软材体积含水量控制在40-60％，于28-34℃，相对湿度85％的条件下发酵60h-66h，取出，60℃烘10h至体积含水量在10-12％。本发明提供了一株米根霉菌CCTCCM2016583及其在百药煎发酵中的应用，利用含此纯种米根霉菌CCTCCM2016583的酒曲以及孢子悬液发酵百药煎，质量稳定，重复性高，并有效提高鞣质转化为没食子酸的效率，为百药煎的质量控制及规范化生产提供技术保障。附图说明图1为本发明根霉菌CCTCCM2016583平板菌落正面及反面观察照片。图2为本发明根霉菌CCTCCM2016583的显微形态照片(10×40)。图3为本发明发酵时间和发酵温度交互作用的响应曲面图和等高线图。图4为本发明发酵时间和酒曲添加量交互作用的响应曲面图和等高线图。图5为本发明发酵温度和酒曲添加量交互作用的响应曲面图和等高线图。具体实施方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。实施例1根霉菌CCTCCM2016583的分离：以百药煎发酵用酒曲为原料，取酒曲10g于90mL无菌水中，23-27℃下，180r/min充分振荡30min，吸取1mL加到9mL无菌水中，以此类推，逐级稀释为10-2、10-3、10-4…10-9，分别取200μL菌悬液涂布于PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)平板上，置于30℃恒温培养箱中，分离出具有根霉典型特征的菌株，进行分离培养，培养2-3天，白色菌丝长满整个培养基表面，白色，繁密，呈棉絮状，并生长许多黑色孢子，即为本发明米根霉菌。实施例2利用米根霉菌CCTCCM2016583发酵百药煎的方法：将保藏菌种BYJ.G-1于PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)斜面培养基上活化4天，取50mL蒸馏水及无菌玻璃球于200mL锥形瓶中121℃灭菌20min，放凉，刮取2-4环孢子于灭菌的蒸馏水中，充分振荡混匀，制成1×108个/mL的孢子菌悬液；将五倍子药材洗净，60℃干燥10h，粉碎，过80目筛，备用；按照每10g五倍子粉取茶叶1g，茶叶碾成粗粉，加10倍量的蒸馏水煎煮15min，放置25℃，过滤，将茶叶汁和茶叶渣分开，每1g茶叶得茶叶汁10mL，五倍子粉与茶叶渣、25％茶汁、五倍子粉末重量5％的BYJ.G-1的孢子混悬液混合，制软材，置于31.8℃，相对湿度85％的条件下发酵时间66h，取出，60℃烘干，经检测，没食子酸含量达到33.32％；所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基是由：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g和自来水1000ml制成。实施例3利用纯种米根霉菌CCTCCM2016583的酒曲发酵百药煎的方法：将五倍子药材洗净，60℃干燥10h，粉碎，过80目筛，备用；按照每10g五倍子粉取茶叶1g、含有纯种BYJ.G-1菌的酒曲1.2g，茶叶碾成粗粉，加10倍量蒸馏水煎煮15min，放置23℃，过滤，将茶叶汁和茶叶渣分开，五倍子粉与含有BYJ.G-1菌的酒曲混匀，再加茶叶渣、30％茶汁，混合制软材，置于31.8℃，相对湿度85％的条件下发酵时间66h，取出，60℃烘干，经检测，没食子酸含量达到34.22％。本发明对根霉菌进行了分类鉴定，并对利用含纯种米根霉菌CCTCCM2016583的酒曲发酵百药煎的工艺优化作了研究，相关实验资料如下：一、根霉菌CCTCCM2016583的鉴定1传统菌落形态观察用接种针取少量孢子，接种于PDA培养基上，然后置于30℃恒温培养箱中培养。结果菌种在PDA平板上30℃培养48h后，培养基表面长出白色透明菌丝，60h后，白色菌丝长满整个培养基表面，白色，繁密，呈棉絮状，并生长许多黑色孢子(如图1所示)。2显微结构观察采用插片培养法将需鉴定真菌接种于盖玻片与培养基交界处，使菌丝生长过程中能够附着到盖玻片上，置于30℃恒温培养箱中培养，从次日起每天用无菌镊子拔取盖玻片，经乳酸-棉兰染液染色后，置于显微镜下观察真菌结构。镜下显示菌丝无隔膜，具分枝和假根，顶端有孢子囊，孢子囊近似球状，孢子呈球形或近似球状(如图2所示)。3现代分子生物学鉴定将冷冻保存的根霉菌CCTCCM2016583于PDA培养基上活化，30℃培养2-3天，将活化菌株接种于PDA液体培养基中，30℃摇瓶培养48h，检查无污染后，按照生工试剂盒说明书提取DNA，2％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，PCR扩增引物采用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)。对真菌基因组DNA中18SrRNA基因片段进行扩增。将符合条件的PCR产物进行序列测定。根霉菌CCTCCM2016583的18SrRNA基因序列的测定结果为：TCTAGTATAAATAACTTTATATTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATGATCTACGTGACAAATTCTTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCAAAAAAGCCCTGACTTACGAAGGGGTGCACTTATTAGATAAAACCAACGCGGGGTAAAACCTGTTTCTTGGTGAATCATAATAATTAAGCGGATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGACGGTCCACTCGATTTTCTGCCCTATCATGGTTGAGATTGTAAGATAGAGGCTTACAATGCCTACAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATACATAACAATGCAGGGCCTTTAAGGTCTTGCAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAACGTCCGTAGTCAAACTTTAGTCTTACCGGCGTAGTGGCCTGGTCTTCATTGACCAAGCTCATTGCTGCCGGAGACTCCACGTCCATTGACTCCTAGTCCTCGTGGCTAGGGTTTTCTGGACAATTACCATGAGCAAATCAGAGTGTTTAAAGCAGGCTTTTAAGCTTGAATGTGTTAGCATGGAATAATGAAATATGACTTTAGTCCTATTTTCGTTGGTTTAGGTACTTCAGTAATGATGAATAGAAACGGTTAGGGGCATTTGTATTTGGTCGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTGACCGAAGACAAACTACTGCGAAAGCATTTGACCCGGGACGTTTTCATTGATCAAGGTCTAAAGTTAAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTTAACCACAAACTATGCCGACTAGAGATTGGGCGTGTTTATTATGACTCGCTCAGCATCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGGACGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAGTAAGGATTGACAGATTGAAAGCTCTTTCTAGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTCGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACCTTATTCTGCTAATTAGACAGGCTAACTCTTTCGGGTTGGTTTATATTTAATATTTAACTGGCTTCTTAGAGAGACTATCGGCTTCAAGCCGAAGGAAGTTTTAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGAAGTCAGCGAGTTTATAACCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAAACTTTTGAAACTTCATCGTGCTGGGGATAGAGCATTGTAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTTATAGTGAGCATATGGGATCAGTAGGATTTGACTGGCAACAGTCATTTCCTGCAGAGAACTATGGCAAACTAGGCTATTAGAGAAAGTAAAAA测序结果序列通过BLAST与GenBank数据库中的已有效发表的菌株序列进行比对，结合传统的形态学鉴定和分子生物学鉴定，最终鉴定结果为米根霉(Rhizopusoryzae)。二、利用含纯种米根霉菌CCTCCM2016583的酒曲发酵百药煎的工艺优化1单因素考察发酵时间对百药煎发酵中没食子酸含量的影响本发明根霉菌发酵百药煎，在其他条件一致下，每隔12个小时取出定量，烘干，粉碎，测定没食子酸的含量，可得出发酵66小时时没食子酸含量达到最高，结果见表1。表1不同发酵时间对百药煎中没食子酸含量影响发酵时间/h01224364860667284没食子酸含量mg/g13.3813.5914.3362.89161.34337.09409.27387.77392.772单因素考察不同酒曲添加量对百药煎发酵中没食子酸含量的影响在其他条件一致下，当酒曲的添加量为0.4、1、2、3、4g/10g五倍子粉时，在30℃、相对湿度85％的条件下发酵66小时，取出，烘干，粉碎，测定没食子酸的含量，可得出每10g五倍子粉加1g酒曲发酵百药煎，其没食子酸含量最高，结果见表2。表2不同酒曲添加量发酵百药煎中没食子酸含量测定结果3单因素考察不同发酵温度对百药煎发酵中没食子酸含量的影响在其他条件一致下，当发酵温度分别在28℃、30℃、32℃、34℃时，相对湿度85％的条件下发酵66小时，发酵结束后，取出，烘干，粉碎，测定没食子酸的含量，最终得出最佳发酵温度为30℃，结果见表3。表3不同发酵温度发酵百药煎中没食子酸含量测定结果发酵温度/℃没食子酸含量mg/g28381.2630409.9732326.2334351.194响应面设计结果与分析在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken试验设计进行发酵工艺的优化，采用三因素三水平，以发酵时间、发酵温度、酒曲添加量为自变量，分别以A、B、C表示，以没食子酸含量为响应值，因素水平及编码见表1；响应面实验组及结果见表2。表4Box-Behnken响应面试验设计因素实验水平及编码表5响应面实验组及结果表6响应面方差分析方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型2.015E+005922385.459.130.0041显著A38418.32138418.3215.660.0055B54.67154.670.0220.8855C6574.3916574.392.680.1456AB2395.3312395.330.980.3560AC128.861128.860.0530.8253BC643.541643.540.260.6243A225771.88125771.8810.510.0142B26817.0416817.042.780.1394C212666.40112666.405.160.0573残差17171.6772453.10失拟项6824.8632274.950.880.5230不显著纯误差10346.8142586.70总离差2.186E+005164.1响应面法优化百药煎发酵工艺结果使用Design-Expert软件进行回归模型分析及显著性检验，结果得出发酵时间、发酵温度、酒曲添加量与没食子酸含量的多项回归方程，回归方程为：Y＝-402.61+1617.56A-15.82B-308.43C+104.00AB-35.63AC+42.23BC-998.69A2-90.69B2-301.01C2,方差分析及系统显著性检验见表6。由表6可知各项均具有显著性，失拟项P＝0.5230不具有显著性，R2＝0.9215表明模型与试验数据充分拟合。通过求解回归方程，得出最佳发酵条件为发酵时间65.99h，发酵温度31.79℃，每10g五倍子粉加酒曲1.22g。通过Design-Expert软件软件处理得出各因素交互作用的响应曲面和等高线见图3、图4、图5，由图3、图4、图5可知发酵时间对发酵百药煎中没食子酸的含量影响最大，其次是酒曲添加量和发酵温度，由图3可知，发酵时间较短温度较低时，曲面较平坦，随着发酵时间的加长温度的增高曲面又表现陡峭，等高线亦显示两者交互作用较好；图4为发酵时间和酒曲添加量交互作用的响应曲面图和等高线图，随着发酵时间的加长和酒曲添加量的增多，曲面先平滑后陡峭最后又趋于平坦，说明发酵时间和酒曲添加量适中时没食子酸含量较高。图5为发酵温度和酒曲添加量对发酵百药煎中没食子酸含量的影响，等高线呈椭圆形，说明交互作用较好。验证试验：在上述优化的最佳发酵条件结合实际生产，在发酵时间66h，发酵温度31.8℃，每10g五倍子粉加酒曲1.2g的条件下进行3次试验，实验结果平均值为337.2mg/g，与理论预测值353mg/g相对误差小于5％。说明该方程与实际结果拟合良好。三、CCTCCM2016583不同接种量对百药煎发酵中没食子酸含量的影响将保藏菌种于PDA固体培养基上活化3-4天，取50mL蒸馏水及数粒玻璃球于200mL锥形瓶中121℃灭菌20min，放凉，刮取2-4环孢子于灭菌的蒸馏水中，充分混匀，制成1×108个/mL的孢子菌悬液。将五倍子药材洗净，60℃干燥10h，粉碎，过80目筛，备用；按照每10g五倍子粉取茶叶1g，茶叶碾成粗粉，加10倍量的蒸馏水煎煮15min，放置25℃，过滤，将茶叶汁和茶叶渣分开，每1g茶叶得茶叶汁10mL，将五倍子粉与茶叶渣、25％茶汁分别接种上述BYJ.G-1的孢子混悬液1％、5％、10％、15％，制软材，置于31.8℃，相对湿度85％的条件下发酵时间66h，取出，60℃烘干，测没食子酸含量。结果显示5％的接种量发酵百药煎没食子酸含量最高。按本发明前述条件反复调整参数后进行若干次试验，试验结果显示在5-8％的接种量时，发酵百药煎没食子酸含量能持续维持在较高水平。本发明提供了一株米根霉菌及其在百药煎发酵中的应用，利用含此纯种米根霉菌CCTCCM2016583的酒曲以及孢子悬液发酵百药煎，质量稳定，重复性高，并有效提高鞣质转化为没食子酸的效率，为百药煎的质量控制及规范化生产提供技术保障，适合大范围应用和推广。SEQUENCELISTING<110>河南中医药大学<120>一种米根霉菌及其发酵百药煎的方法<130>1<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1724<212>DNA<213>米根霉（Rhizopusoryzae）<400>1tctagtataaataactttatattgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatgatc60tacgtgacaaattctttactacttggataaccgtggtaattctagagctaatacatgcaa120aaaagccctgacttacgaaggggtgcacttattagataaaaccaacgcggggtaaaacct180gtttcttggtgaatcataataattaagcggatcgcatggccttgtgccggcgacggtcca240ctcgattttctgccctatcatggttgagattgtaagatagaggcttacaatgcctacaac300gggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatc360caaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggtagtgacaatac420ataacaatgcagggcctttaaggtcttgcaattggaatgagtacaatttaaatcccttaa480cgaggatcaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatag540cgtatattaaagttgttgcagttaaaacgtccgtagtcaaactttagtcttaccggcgta600gtggcctggtcttcattgaccaagctcattgctgccggagactccacgtccattgactcc660tagtcctcgtggctagggttttctggacaattaccatgagcaaatcagagtgtttaaagc720aggcttttaagcttgaatgtgttagcatggaataatgaaatatgactttagtcctatttt780cgttggtttaggtacttcagtaatgatgaatagaaacggttaggggcatttgtatttggt840cgctagaggtgaaattcttggattgaccgaagacaaactactgcgaaagcatttgacccg900ggacgttttcattgatcaaggtctaaagttaagggatcgaagacgattagataccgtcgt960agtctttaaccacaaactatgccgactagagattgggcgtgtttattatgactcgctcag1020catcttagcgaaagtaaagtttttgggttctggggggagtatgggacgcaaggctgaaac1080ttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaa1140cacggggaaactcaccaggtccagacatagtaaggattgacagattgaaagctctttcta1200gattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttcgtggagtgatttgtctggttaat1260tccgataacgaacgagaccttattctgctaattagacaggctaactctttcgggttggtt1320tatatttaatatttaactggcttcttagagagactatcggcttcaagccgaaggaagttt1380taggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactga1440tgaagtcagcgagtttataaccttggccggaaggtctgggtaaacttttgaaacttcatc1500gtgctggggatagagcattgtaattattgctcttcaacgaggaattcctagtaagcgcaa1560gtcatcagcttgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactacc1620gattgaatggttatagtgagcatatgggatcagtaggatttgactggcaacagtcatttc1680ctgcagagaactatggcaaactaggctattagagaaagtaaaaa1724当前第1页1 2 3