氯噻啉抗体特异性结合的噬菌体展示多肽及其用途的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及具有与氯噻啉抗体特异性结合的多肽，包括所述多肽在检测氯噻啉中的应用。

背景技术：

氯噻啉(imidaclothiz)是南通江山农药化工股份有限公司研发的新型烟碱类杀虫剂。可用于防治吮吸式口器害虫，如蚜虫、叶蝉、飞虱、蓟马、粉虱及其抗性品系，同时对鞘翅目、双翅目和鳞翅目害虫也有防效，尤其对水稻二化螟、三化螟毒力比其它烟碱类杀虫剂高，广泛应用于水稻、小麦、蔬菜、烟草、棉花、果树、茶树等作物，具有高效、广谱等优点。为预防氯噻啉应用存在的潜在风险，需要一种灵敏、快速、选择性的残留检测方法。

目前，对氯噻啉的残留检测包括仪器分析方法和免疫分析法。免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，在大量样品快速筛选和现场监测中显示出独特优势。由于农药等小分子化学品(包括氯噻啉)为单抗原决定簇分析物，整个分子只能和一个抗体结合，所以通常选择竞争模式来建立免疫分析方法。在竞争模式的免疫分析方法中，必须存在一个经过标记的竞争物，通常是将半抗原与蛋白、酶或荧光物等连接制备获得。根据竞争物与免疫抗原结构的同异，可以将分析方法分为同源和异源免疫分析，在之前的大量研究中显示，异源免疫分析的敏感性要远远优于同源免疫分析。敏感性是评价一种检测方法优劣的重要参数，同时高敏感性是免疫分析技术在样品处理过程中选择快速的稀释样品方法的前提条件。但是系列异源半抗原的化学合成及半抗原与蛋白、酶或荧光物等的连接需要很大的工作量。因此，已报道的氯噻啉的免疫分析都为同源免疫分析。

自从噬菌体展示技术第一次报道至今，已经作为一种强大的工具运用在不同的研究中，包括筛选抗体和酶的配体；筛选小分子的受体；抗体工程等。其原理是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。利用抗体对噬菌体展示随机多肽库进行亲和淘选，可筛选出能够和抗体结合的噬菌体展示多肽。由于筛选出的多肽连接在噬菌体外壳蛋白上，并且抗噬菌体的二抗已商品化，所以筛选出的噬菌体展示多肽不需要与蛋白、酶或荧光物等连接，可直接用作竞争物建立异源竞争免疫分析。与化学合成竞争物相比，从噬菌体展示随机多肽库中淘选竞争物具有操作简单、候选竞争物多、易于制备高质量的竞争物。同时，噬菌体展示多肽竞争物还具有无毒、容易大量制备和纯化的优点。但目前为止，尚未见具有与氯噻啉抗体特异性结合的多肽及其应用的研究和报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供与氯噻啉抗体特异性结合的多肽，及相关多肽在氯噻啉检测中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

(1)将蛋白A柱纯化的氯噻啉抗体包被在酶标板上，用5％milk封闭酶标板，将噬菌体展示随机环七肽库、环八肽库、线十二肽库加入包被和封闭后的酶标板中进行亲和淘选，淘选过程按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，一般经过3轮的淘选，每轮淘选降低用于竞争洗脱的氯噻啉的含量；

(2)3轮淘选后，挑选114个噬菌体克隆进行ELISA初步鉴定，85个阳性克隆进行扩增、质粒提取、测序，共发现6种序列，其序列如SEQ ID NO 1～6所示：Cys Pro Arg Ile Trp Ala Asp Ser Cys，Cys Thr Tyr Leu Asn Ser Ala Lys Cys，Cys Leu Pro Pro Arg Met Ile Tyr Glu Cys，Ser Gln Pro Trp Cys Pro Pro Ser Ile Cys Gly Asp，Thr Met His Leu Pro Tyr Cys Pro Thr Asn Ile Cys，Asp Tyr His Asp Pro Ser Leu Pro Thr Leu Arg Lys。

本发明所述的多肽可与氯噻啉抗体组合，建立异源竞争ELISA，用于氯噻啉在环境与农产品中的残留检测。

本发明具有以下有益效果：(1)新颖：与氯噻啉抗体特异性结合的多肽为国内外首次报道；(2)实用：利用本发明提供的噬菌体展示多肽可以快速建立高敏感性的异源竞争ELISA；(3)特异性强：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的竞争ELISA与氯噻啉类似物的交叉反应，除吡虫啉(90.42％)外，均小于1.7％；(4)准确度高：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的竞争ELISA在农产品中的添加回收率为72.3-101.3％，变异系数低于9.4％，符合残留分析标准；(5)灵敏度高：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的竞争ELISA的抑制中浓度(IC₅₀)为1.45ng/mL，检测限(IC₁₀，LOD)为0.55ng/mL。

附图说明

图1是挑选的114个噬菌体克隆P-ELISA检测的结果；横坐标为噬菌体克隆，纵坐标为OD₄₅₀值；

图2是竞争P-ELISA检测氯噻啉，OD值与氯噻啉浓度的曲线；横坐标为氯噻啉的浓度，单位为ng/mL；纵坐标为OD₄₅₀值。

具体实施方式

本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：

主要实验材料：

蛋白A柱纯化氯噻啉单克隆抗体由南京农业大学，植物保护学院，农药残留与环境毒理实验室制备；噬菌体展示随机环七肽库和线十二肽库从NEB公司购买，噬菌体展示随机环八肽库由美国加州大学-戴维斯分校，Hammock实验室提供。

主要试剂：

蛋白胨(OXOID)、酵母提取物(OXOID)、琼脂(Amresco)、琼脂糖(Amresco)、四甲基联苯胺(Sigma)、IPTG(Amresco)、Xgal(Amresco)、PEG8000(Sigma)、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(GE)

主要试剂配方：

1、LB培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，高压灭菌，室温贮存；

2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；

3、顶层琼脂：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，7g琼脂粉。高压灭菌，固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；

4、四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于50％乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；

5、LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；

6、封闭液：含有3％BSA，0.15M，pH 7.4PBS，过滤除菌，4℃保存；

7、PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5M NaCl，高压灭菌，室温贮存；

8、IPTG/Xgal配方：将1.25g IPTG(isopropylβ-D-thiogalactoside)和1g Xgal溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光贮存；

9、显色液(四甲基联苯胺-H₂O₂底物溶液)：25mL 0.1M，pH 5.5柠檬酸盐缓冲液中加入0.4mL，6mg/mL四甲基联苯胺，0.1mL 1％H₂O₂。

实施例1氯噻啉抗体特异性结合多肽的淘选和制备

1、与氯噻啉抗体特异性结合的噬菌体克隆的淘选

按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，经过3轮的淘选，具体操作如下：

(1)取100μL 75μg/mL蛋白A柱纯化的氯噻啉抗体加入酶标板中，4℃包被过夜，共三个孔；

(2)取少量大肠杆菌ER2738涂在LB+Tet平板上，37℃过夜培养；

(3)将步骤(1)的酶标板用PBST洗涤5遍，加入300μL 5％milk，37℃孵育2小时，用PBST洗涤5遍，存放于4℃备用；

(4)将酶标板每孔加入100μL 2×10¹¹的噬菌体(含3％milk)，室温轻微震荡1小时；

(5)取20mL LB培养基加入250mL三角瓶中，加入ER2738单菌落，37℃培养至OD₆₀₀为0.01至0.05；

(6)将步骤(4)的微孔用PBST洗涤10遍，加入100μL 2μg/mL的氯噻啉进行洗脱，室温轻微震荡1小时；

(7)收集步骤(6)中的洗脱缓冲液，加入5％milk包被的孔，室温轻微震荡1小时，去除非特异性结合。收集上清液，4℃保存；

(8)取少量脱液测定噬菌体的滴度(操作方法见滴度测定)；

(9)剩余的洗脱缓冲液用于扩增，将剩余的洗脱缓冲液加入步骤(5)中的三角瓶中，37℃摇床培养4至4.5小时；

(10)将扩增的噬菌体移入50mL的离心管中，4℃12000g离心10分钟，取上清。重复离心一次；

(11)取上层80％的上清放入离心管中，加入上清1/6体积的20％PEG-8000/2.5M NaCl，混匀，4℃静置过夜；

(12)将(11)步骤的混合液4℃12000g离心15分钟，去上清，重复一次；

(13)取400μL PBS溶解步骤(12)的沉淀物用于下一轮的淘选，也可放于4℃短期(大约三周不会影响滴度)保存，或者加入甘油，放于-20℃长期保存；

(14)步骤(1)到(13)为一轮淘选和扩增，第二轮和第三轮的淘选和扩增步骤同上，步骤(1)中使用的氯噻啉抗体浓度分别为50μg/mL和25μg/mL，步骤(6)中使用的氯噻啉浓度分别为0.5μg/mL和0.1μg/mL，

噬菌体滴度测定操作步骤如下：

(1)取4mL LB培养基，加入20μL 50mg/mL的四环素，取大肠杆菌ER2738单菌落加入其中，37℃培养至OD₆₀₀为0.5；

(2)将LB/IPTG/Xgal平板放入37℃培养箱中预热1小时以上；

(3)取5mL融化的顶层琼脂(LB+7g/L琼脂糖)放入离心管中，并保持离心管在45℃；

(4)将需要测滴度的噬菌体进行稀释，通常洗脱缓冲液稀释10至10³倍，扩增之后的噬菌体稀释10⁸至10¹¹；

(5)取10μL稀释后的噬菌体加入到180μL步骤(1)的大肠杆菌培养液中，混匀；

(6)将步骤(5)的混合液加入步骤(3)中的顶层琼脂中，混匀；

(7)将步骤(6)的混合液均匀的加入到步骤(2)中的平板上，室温冷却，放入37℃培养箱中过夜培养；

(8)根据平板上蓝色斑点的数量来计算所测噬菌体的滴度。

整个淘选过程的洗脱噬菌体和扩增后的噬菌体的个数如表1所示。

表1与氯噻啉抗体结合的噬菌体展示多肽淘选情况(环七肽库)

表2与氯噻啉抗体结合的噬菌体展示多肽淘选情况(环八肽库)

表2与氯噻啉抗体结合的噬菌体展示多肽淘选情况(线十二肽库)

2、噬菌体克隆的筛选及其展示多肽序列的测定

在完成最后一次淘选之后，对洗脱液进行滴度测定，选择蓝色斑点少于100个的LB/IPTG/Xgal平板，从中挑选出114个克隆用于扩增和鉴定。操作程序如下：

(1)用LB培养液将过夜培养的大肠杆菌ER2738以1∶100稀释，并以5mL每试管分散在48个试管中；

(2)从LB/IPTG/Xgal平板挑选出48个克隆放入试管中，37℃摇床培养4.5至5小时；

(3)将培养液4℃12000g离心10分钟，上清用于噬菌体酶联免疫分析(P-ELISA)验证(操作方法见P-ELISA)，沉淀用质粒提取试剂盒提取质粒，送测序公司进行序列测定。

噬菌体酶联免疫分析操作步骤：

(1)包被：用PBS缓冲液将氯噻啉抗体稀释后加入酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜；

(2)洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH 7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；

(3)封闭：每孔加入300μL 3％milk，37℃孵育2小时；

(4)洗板：同(2)；

(5)加入分析物和噬菌体：每孔加入50μL PBS或50μL 10μg/mL氯噻啉溶液，再加入50μL的噬菌体展示多肽，室温轻微震荡1小时，PBST洗涤5次，并平行设置阴性对照。

(6)洗板：同(2)；

(7)加入酶标二抗体：每孔加入100μL经1∶5000倍PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体，室温轻微震荡1小时；

(8)洗板：同(2)；

(9)显色：每孔加入100μL新鲜配制的显色液，37℃温箱孵育15分钟；

(10)终止：每孔加50μL 2mol/L的H₂SO₄溶液；

(11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值。

挑选的114个噬菌体克隆中85个克隆在P-ELISA检测时有或无氯噻啉的OD₄₅₀值存在显著差异(图1)。将上述85个克隆的质粒送金斯瑞生物科技有限公司测序，测序引物为5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。测序结果共发现6种序列，其序列如表2中SEQ ID NO 1～6所示。

表2噬菌体展示多肽的氨基酸序列

3、P-ELISA对氯噻啉的检测

3.1方法原理

采用间接竞争免疫分析方法。将氯噻啉抗体吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制备成固相抗体，然后加入待测样品和噬菌体展示多肽。噬菌体展示多肽和待测样品中的氯噻啉与固相抗体进行竞争结合反应，待测农药含量多，被结合在固相抗体上的噬菌体少，反之结合在固相抗体的噬菌体多，反应后加入辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(只能与结合在固相抗体上的噬菌体结合)，最后用底物进行显色加以测定。被结合在固相抗体上的噬菌体少，显色弱，OD₄₅₀值低，反之，则显色强，OD₄₅₀值高，因而可根据已知量农药的标准曲线和待检样品的OD₄₅₀值，推算出待测农药的浓度。

3.2抗体和噬菌体展示多肽的工作浓度

P-ELISA抗体和噬菌体展示多肽工作浓度的确定用方阵滴定法，选择OD值为1.0～2.0时的浓度。经实验，抗体5μg/mL、SEQ ID NO 5噬菌体2.5×10⁸pfu/mL为最适工作浓度。

3.3 P-ELISA程序

(1)包被：用PBS缓冲液将氯噻啉抗体稀释至5μg/mL加入酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜；

(2)洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH 7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；

(3)封闭：每孔加入300μL 3％milk，37℃孵育2小时；

(4)洗板：同(2)；

(5)加入分析物和噬菌体：每孔加入50μL待测样品，再加入50μL，5×10⁸pfu/mL的噬菌体展示多肽，室温轻微震荡1小时，PBST洗涤5次，并平行设置阳性对照和阴性对照。

(6)洗板：同(2)；

(7)加入酶标二抗体：每孔加入100μL经1∶5000倍PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体，室温轻微震荡1小时；

(8)洗板：同(2)；

(9)显色：每孔加入100μL新鲜配制的显色液，37℃温箱孵育15分钟；

(10)终止：每孔加50μL 2mol/L的H₂SO₄溶液；

(11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值。

3.4标准曲线和灵敏度

根据OD₄₅₀值与氯噻啉浓度作图即得到标准曲线(图2)，计算抑制中浓度(IC₅₀)及最低检测限(IC₁₀，LOD)分别为1.45ng/mL，LOD为0.55ng/mL。

3.5特异性

常用交叉反应率作为评价的重要标准。交叉反应率越小，检测方法的特异性越好。P-ELISA除与吡虫啉有交叉反应外(CR％＝90.4％)，与其它新烟碱类杀虫剂没有明显的交叉反应(CR％小于或等于1.7％)。从而可知，所制备的噬菌体展示多肽，可以用于特异性的检测氯噻啉。

3.6样品添加检测

3.6.1样品处理

称取粉碎混匀后的甘蓝、大米、苹果、青菜、梨、番茄和土壤样品10g，装入50mL离心管中，加入20mL含50％甲醇的PBS缓冲液混匀，涡旋3min，超声15min，4000rpm离心5min，将上清全部转移至25mL容量瓶内，用PBS缓冲液定容至25mL。再用PBS缓冲液稀释32倍用于检测。

3.6.2样品检测

样品检测步骤参考3.3。经分析可知，该P-ELISA的氯噻啉回收率为72.3-101.3％，相对标准偏差为1.4-9.4％。

实际样品中氯噻啉残留量检测参照3.6方法进行。

本发明建立的氯噻啉P-ELISA方法符合氯噻啉残留分析标准。该方法可用于环境和农产品中氯噻啉的残留检测，且前处理方法较仪器分析方法简单，适合大批量检测和现场监测。