表达α‑1抗胰蛋白酶（AAT）的遗传修饰的间充质干细胞的制作方法

本发明涉及用作药物的遗传修饰的间充质干细胞，所述药物治疗没有α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏症的受试者的与炎症和/或不想要的免疫应答相关的医学病症，其中所述干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含可操作地连接于(ii)启动子或启动子/增强子组合的(i)α-1抗胰蛋白酶(aat)编码区。

背景技术：

间充质干细胞(msc)是存在于骨髓和其他组织中的非造血来源的细胞。msc一般被认为是多能成体祖细胞，其具有分化为有限数目的细胞谱系如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力。基于这种直接分化为这些末期表型的能力，已经对msc作为治疗实体的用途进行了研究，包括msc促进或提高骨修复和用于修复软骨缺损的用途(vilquin和rosset,再生医学(regenerativemedicine)2006:1,4,p589以及veronesi等人,干细胞和发育(stemcellsanddevelopment)2013；22,p181)。已经描述了用于许多治疗性适应症的msc的分离和培养，并且这代表了针对治疗炎症相关障碍的有前途的方法(例如wo2010/119039)。

已知msc展示了施用于患者后的免疫逃逸特性。已经显示msc展示了在移植同种异体供体材料情况下有利的免疫调节作用(leblanc等人,lancet2004:363,p1439)，从而减少了潜在致病的同种异体反应性和排斥。此外，已知msc显示了抗肿瘤发生的作用，例如抗卡波西肉瘤(khakoo等人,jexpmed2006:203,p1235)。msc治疗还可以在创伤愈合中起治疗作用。可以经由全身注射进行msc的治疗递送，然后msc归巢并移入损伤的部位(kidd等人,干细胞(stemcells)2009:27,p2614)。虽然msc对受伤的组织具有再生作用是明显的，但是它们作为感兴趣的治疗性转基因蛋白的递送载体的用途尚未被充分地探索。

炎性疾病和与不想要的免疫应答有关的疾病代表了世界上健康问题和死亡率的重要原因。例如，炎性疾病(如肺部疾病或自身免疫性疾病)代表了需要改善炎症调节以提供有效治疗的医学病症。

肺部疾病(如呼吸系统疾病)可能严重影响患者的健康，并且涵盖影响肺的器官和组织的许多病理状况。作为肺部疾病的一个例子，呼吸系统疾病包括上呼吸道、气管、支气管、细支气管、肺泡、胸膜和胸膜腔以及呼吸的神经和肌肉的病症。呼吸系统疾病是全球死亡的主要原因之一。肺部感染(如肺炎和肺结核)、肺癌和慢性阻塞性肺疾病(copd)在2008年期间在世界上一共造成950万人死亡，占全球死亡总数的六分之一。根据世界卫生组织，四种呼吸系统疾病类别出现在全球十大死因之中，它们共占死亡人数的六分之一，以及损失的伤残调整生命年(disability-adjustedlife-years)的十分之一。在欧盟的28个国家中，这些疾病占死亡人数的八分之一。为了减少炎症，治疗通常涉及抗炎药物(如皮质类固醇)的使用。鉴于肺部疾病的流行，需要新的治疗策略。

自身免疫疾病是与个体对抗其身体的细胞、物质或组织的免疫应答相关的医学病症。一般人群中很少数人患有可能是急性或慢性的自身免疫性疾病，并且往往在长时间内衰弱。在自身免疫性疾病和炎性疾病两者中，例如针对身体自身组织或蛋白质的自身免疫性疾病中，医学病症通常通过人类适应性免疫系统和/或固有免疫系统的反应产生。

具有重要意义的自身免疫性疾病的一个例子是1型糖尿病。1型糖尿病占所有糖尿病病例的5％至10％。全球每年约有80000名青年被诊断出患有1型糖尿病，据估计在美国共有300万人患有1型糖尿病(chiang等人,糖尿病护理(diabetescare)2014:37,pp2034-55)。在患有1型糖尿病的患者中，胰腺β-细胞被β-细胞自身抗原、巨噬细胞、树突状细胞、b淋巴细胞和t细胞淋巴细胞参与的自身免疫反应破坏。由于这些患者缺乏胰腺β细胞，所以胰岛素的产生减少，导致血液和尿液中的葡萄糖水平升高。目前的治疗方法通常依赖于调节胰岛素水平，而不直接解决潜在的免疫系统病理学。

具有重要意义的炎性疾病的一个例子是关节炎，例如痛风(痛风性关节炎)。痛风是一种医学病症，其特征通常是在特定位置的复发性急性炎症性关节炎，其导致肿胀和关节疼痛。大脚趾底部的跖趾关节是通常受影响的区域。痛风通常被公认是由血液中尿酸水平升高所引起，导致尿酸结晶，晶体沉积在患者体内的关节、肌腱和周围组织中。治疗通常涉及抗炎药的使用，例如非类固醇抗炎药(nsaid)或皮质类固醇，或阻止尿酸产生的药物。

许多抗炎剂是已知的，如类固醇和非类固醇药剂，其用于治疗如关节炎的病症。然而，这些药物中的许多经常导致不想要的副作用，尤其是长时间使用后。对进一步的抗炎剂的需求是明显的，特别是在治疗对轻度或短期治疗反应不良和/或导致需要长期治疗的患者的不想要的副作用的炎性疾病或自身免疫性疾病的情况下。

α-1抗胰蛋白酶(也称为a1at、aat、pi、serpina1)是约52kda的糖蛋白，其是最丰富的内源丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin超家族)之一。aat被认为是急性期蛋白，从而在急性炎症时aat浓度可以提高许多倍。

α-1抗胰蛋白酶缺乏症(α-1抗胰蛋白酶缺乏症，a1ad)是导致α1-抗胰蛋白酶(a1at)生产缺陷的医学障碍，导致血液和肺部中a1at活性降低和肝细胞中过多的异常a1at蛋白的沉积。serpina1中存在多于75种已知的不同突变，由此90％的aatd病例是由于pi*z错义突变：glu342lys。aat缺乏症导致慢性的不受抑制的组织分解，由此嗜中性粒细胞弹性蛋白酶自由地分解肺泡间隙弹性蛋白，导致呼吸道并发症如气道炎症和肺气肿。

尽管已经提出了用于重组功能性aat的基因治疗方法，但aat缺乏症的治疗仍然是个挑战。例如，us2014/0142161a描述了通过使用基于重组腺相关病毒(raav)的载体增强aat的表达来用于治疗aat缺乏症的基因治疗方法。

li等人(jhepatol2011:54,pp930-8)、ghaedi等人(tissueandcell2010:42,pp181-9)和li等人(molther2010:18,pp1553-8)描述了表达aat的遗传修饰的间充质干细胞，并讨论了其在治疗aat缺乏症方面，特别是在治疗肝脏疾病方面的潜在用途。鉴于a1ad引起的疾病的严重程度，需要新的策略来增强患病受试者的aat产生。

尽管最近在治疗aat缺乏症中取得了初步进展，但是在未患有aat缺乏症的受试者中，aat在细胞治疗方法中的治疗潜能仍然很大程度上未被探索。ghaedi等人(jgenemed2011:13,pp171-80)证明了表达aat的间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞(huvec)的细胞毒作用，并讨论了所述间充质干细胞作为血管生成抑制剂的可能用途。根据本发明人的认识，基于通过msc的转基因aat的表达在治疗炎性或自身免疫疾病中的细胞治疗的应用之前未被提出。

技术实现要素：

鉴于现有技术，基于本发明的技术问题是提供供选择的和/或改进的治疗炎性疾病和与不想要的免疫应答相关的疾病的手段。

通过独立权利要求的特征解决这个问题。通过从属权利要求提供了本发明的优选实施方式。

因此，本发明涉及用作药物的遗传修饰的间充质干细胞，所述药物治疗没有α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏症的受试者的与炎症和/或不想要的免疫应答相关的医学病症，其中所述干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)α-1抗胰蛋白酶(aat)编码区，所述α-1抗胰蛋白酶(aat)编码区可操作地连接于(ii)启动子或启动子/增强子组合。这样的msc可以被称为“aat修饰的msc”。

在优选的实施方式中，本发明涉及如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞(aat修饰的msc)，所述遗传修饰的间充质干细胞用作药物，所述药物治疗没有α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏症的受试者的与炎症和/或不想要的免疫应答相关的医学病症，其中医学病症选自由肺部炎性疾病、痛风、慢性纤维化和自身免疫性疾病(尤其是1型糖尿病)组成的组。

通过没有α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏症的受试者的炎症和/或不想要的免疫应答的共同特征，统一化根据本发明的用aat修饰的msc治疗的各种医学指征(尤其是肺部炎性疾病、痛风、慢性纤维化、自身免疫性疾病(尤其是1型糖尿病))。考虑到aat修饰的msc的使用以前没有被提出用于治疗与α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏症不相关的医学疾病，本发明的各种用途代表了统一的组的医学指征。

尤其令人惊讶的是，aat修饰的msc能够治疗未显示aat缺乏症的受试者的与不想要的炎症和/或免疫应答相关的医学病症。

已经提出了对aat缺乏症受试者的aat补充，并且所述aat补充似乎代表了治疗由功能性aat水平降低引起的许多病理状况的有用方法。然而，之前没有提出在具有功能性aat的患者中，通过msc介导的递送增加的aat向炎症部位的局部递送可以为不想要的炎症或免疫应答提供治疗方案。相反，本领域技术人员可能假设，将msc-aat施用于没有aat缺乏症的受试者可能导致由于aat过量而产生的潜在的副作用。此外，根据具有aat缺乏症的受试者的aat替代疗法，本发明实现的有益效果不会被认为是显而易见的，这是因为提供过量的aat不会照此被假设为在具有功能性aat的患者中提供治疗益处。

根据本发明，术语α1-抗胰蛋白酶缺乏症(α1-抗胰蛋白酶缺乏症，a1ad)是指导致α1-抗胰蛋白酶(a1at)产生缺损的任何病症，如导致血液和肺中a1at活性降低，以及肝细胞中多多异常的a1at蛋白的沉积的遗传疾病。例如，aat缺乏症可以由serpina1中的75种已知的不同突变中的一种或多种表征，由此90％的aatd病例是由于pi*z错义突变：glu342lys。

因此，没有这样的aat缺乏症的受试者是本文描述的医疗治疗的优选的预期受试者。

由于msc迁移到炎症区域的能力，msc代表了用于递送治疗剂的合适工具。不受理论约束，本发明的msc代表了用于有效递送在所述msc中由外源核酸表达的治疗剂(即aat蛋白)的药物递送载体。此外，msc与aat的组合提供了意料不到的协同效应。msc本身在归巢和/或移植入发炎组织后，表现出关于炎症区域的抗炎作用的有益特性，并且当msc与作为治疗性转基因的aat偶联时，msc提供增强的抗炎功能。

惊人地，在全身，优选在静脉内施用细胞后，本文所述的msc的施用导致msc迁移至炎症部位。除了来自aat修饰的msc中存在的转基因的表达的增强的aat的局部抗炎作用以外，msc能够在发炎组织的区域迁移和/或移植，从而提供来自msc自身的抗炎信号。本发明中使用的msc在全身或静脉内施用后还能在血流中循环，并且可以移植或结合于体内的发炎区域，从而以局部方式发挥其功能。在由不想要的炎症和/或不想要的免疫应答限定的医学病症的治疗中显示aat表达增加(由于aat转基因)的msc的组合提供了意想不到的协同作用，由此除了msc自身和aat转基因两者的抗炎特性之外，归巢至炎症升高的区域的msc提供了比以单独的方式考虑时的每个独立效应之和更大的协同治疗效果。

例如，当aat作为治疗性蛋白质全身施用或在基因治疗中以病毒载体施用时，由于缺乏靶向体内发炎区域和可能出现脱靶作用导致的不想要的副作用，仅获得了有限的益处。当全身施用msc时，由于msc定位于发炎组织，可以从msc自身获得一些积极作用，虽然由未修饰的msc诱导的抗炎反应的强度可能不足以显示出显著的治疗效果。在组成型启动子或条件型启动子下，表达作为转基因的aat的msc的组合能够以靶向和有效的方式协同组合aat和msc的固有性质。例如，aat的局部作用对于治疗各种炎性疾病是有益的，例如由不想要的免疫反应表征的炎性疾病。aat能够保护组织免于遭受炎性细胞的酶，并可以减少炎性细胞因子的产生。

通过msc的局部递送提供过量的aat，在没有aat缺乏症的患者中提供所希望的治疗益处，同时使由于脱靶效应导致的过量aat的潜在副作用最小化。在该过程中，msc的免疫调节性质与aat的抗炎作用协同作用以产生治疗有效剂量的aat。由此，aat修饰的msc避免由于全身施用aat蛋白或编码aat的核酸载体而导致的潜在的副作用和/或使所述的潜在的副作用最小化。由于msc向发炎组织的归巢能力，使用msc作为施用aat的载体，在身体的患病区域中提供了aat的局部生产。

aat编码区优选是编码天然存在或合成的aat蛋白序列的任意核酸，所述aat蛋白序列显示了aat功能，与人aat相比具有减少的、相同的、相似的或增加的活性，或者功能上类似于aat。aat的氨基酸序列可从ncbi数据库的登录号1313184b获得。分子生物学或遗传学领域的技术人员可以提供编码aat的相应核酸序列。本发明涵盖显示功能上类似于未修饰的人形式的aat的aat的序列变体的使用。

公布于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_000295.4上的serpina1编码序列(cds)是一种优选的实施方式，并且其包括全序列的第262至1518位碱基(seqidno1)：

在本发明的一些实施方式中，cds是密码子优化的以提高蛋白生产。密码子优化后的编码序列优选阅读如下(seqidno2)：

ggcatcaccaaggtgttcagcaacggcgccgatctgagcggcgtgacagaagaggcccctctgaagctgtccaaggccgtgcacaaagccgtgctgaccatcgacgagaagggcaccgaagccgctggcgccatgtttctggaagccatccccatgagcatcccccctgaagtgaagttcaacaagcccttcgtgttcctgatgatcgagcagaacaccaagagccccctgttcatgggcaaggtcgtgaaccccacccagaaa

根据seqidno1和/或2的核苷酸序列编码根据seqidno3的氨基酸序列的人aat蛋白，所述seqidno3的氨基酸序列是本发明中优选的：

mpssvswgilllaglcclvpvslaedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk

因此，本发明涵盖如本文描述的遗传修饰的msc，所述遗传修饰的msc包括选自由以下组成的组的核酸分子：

a)包括编码aat蛋白的核苷酸序列的核酸分子，所述aat蛋白如根据seqidno3的aat蛋白，优选由根据seqidno1或2的核苷酸序列编码；

b)与根据a)的核苷酸序列互补的核酸分子；

c)包括具有充分的序列一致性的核苷酸序列的核酸分子，所述具有充分的序列一致性的核苷酸序列功能上相似/等价于根据a)或b)的核苷酸序列，优选与根据a)或b)的核苷酸序列具有至少70％、80％、优选90％、更优选95％的序列一致性；

d)作为遗传密码的结果，被简化(degenerated)为根据a)至c)的核苷酸序列的核酸分子；以及

e)根据a)至d)的通过缺失、添加、置换、易位、倒置和/或插入来修饰的核苷酸序列，并且功能上相似/等价于根据a)至d)的核苷酸序列的核酸分子。

因此，本发明涵盖本文描述的遗传修饰的msc，所述遗传修饰的msc包含编码根据seqidno3的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明进一步涵盖seqidno3的序列变体，尤其是与seqidno3具有至少70％的序列一致性的序列变体，优选与seqidno3具有至少80％、85％、90％，或至少95％序列一致性的序列变体。这样的序列变体优选在功能上类似于或等价于本文公开的人类aa。在维持seqidno3的人aat的功能等价的情况下，本发明还涵盖了蛋白长度的变化。例如高达50个氨基酸，40、30、20或10个氨基酸长度的蛋白质长度的截短或伸长可以维持aat活性，因此被涵盖于本发明中。

功能类似的序列是指编码功能性aat基因产物，并且使能够实现与人aat相同或相似的功能效应的能力。aat功能可以通过其体外抑制多种蛋白酶(如胰蛋白酶)的能力或通过其抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的能力来确定(如下所述)。用于确定蛋白酶活性或用于确定嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的适当测定是技术人员已知的。

可以通过氨基酸序列中的置换来发生的aat蛋白的蛋白修饰物和编码这些分子的核酸序列也包括在本发明的范围内。如本文所定义的置换是对蛋白质的氨基酸序列进行的修饰，由此一个或多个氨基酸被相同数量的(不同)氨基酸替代，产生含有与原始蛋白不同的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方式中，这种修改不会显著地改变蛋白的功能。如添加一样，置换可以是天然或人工的。本领域熟知，可以进行氨基酸置换而不显著改变蛋白质的功能。当修饰涉及“保守”氨基酸置换时，这是尤其正确的，所述“保守”氨基酸置换是将一种氨基酸置换为另一种具有相似性质的氨基酸的置换。这样的“保守”氨基酸可以是天然的或合成的氨基酸，因为所述“保守”氨基酸的大小、电荷、极性和构象，所述“保守”氨基酸可被置换而不会显著影响蛋白质的结构和功能。通常，许多氨基酸可以被保守的氨基酸置换，而不会有害地影响蛋白质的功能。通常，非极性氨基酸gly、ala、val、ile和leu；非极性芳香族氨基酸phe、trp和tyr；中性极性氨基酸ser、thr、cys、gln、asn和met；带正电荷的氨基酸lys、arg和his；带负电荷的氨基酸asp和glu，代表了保守氨基酸的组。该清单不是详尽的。例如，熟知的是，ala、gly、ser以及有时候cys可以互相置换，即使它们属于不同的组。

用于遗传修饰msc的方法对本领域技术人员是已知的。wo2010/119039和wo2008/150368中公开了遗传修饰msc的适合方法的实例。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的细胞的特征在于，所述细胞获得自骨髓、脐带、脂肪组织或羊水。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的细胞的特征在于，所述细胞是cd34阴性的。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的细胞的特征在于，所述细胞是人细胞。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，外源核酸包含病毒载体，例如病毒表达构建体形式的病毒载体，更优选为反转录病毒载体，特别是γ反转录病毒载体。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，外源核酸是或包括非病毒表达构建体。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，所述细胞进一步包括(iii)选择性标记基因，所述选择性标记基因可操作地连接于组成型启动子或启动子/增强子组合。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，启动子或启动子/增强子组合是组成型启动子。

在另一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，启动子或启动子/增强子组合是cmv或ef2启动子。

在优选的实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，组成型启动子是efs启动子。

在优选的实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，组成型启动子是pgk启动子。

在优选的实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，组成型启动子是ef1α启动子。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，所述启动子或启动子/增强子组合是诱导型或条件型启动子。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，在所述细胞在施用后分化时启动子是诱导型的。在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，启动子是tie2启动子。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，启动子是炎症特异性启动子，优选地，其中所述启动子由炎性介质或炎性细胞因子诱导和/或当遗传修饰的间充质干细胞接近于发炎组织时诱导。

启动子的诱导型形式被设计为显示aat蛋白的炎症特异性表达和/或局部表达。结合msc的归巢和/或迁移特性，实现了协同作用，使得非常少的aat蛋白质在受试者体内的与患病组织或器官不同的区域中表达或产生。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，启动子是rantes启动子。

在一种实施方式中，如本文描述的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，启动子是hsp70启动子。

鉴于现有技术，令人惊讶的是，本文提及的诱导型启动子的表达导致在适当刺激炎症部位时治疗性蛋白aat充分表达。本文提供的启动子显示了合适的诱导性质，以便在其与发炎组织接近时快速强烈地表达aat。此外，当aat的表达受所述诱导型启动子控制时，aat对组织的抗炎和免疫调节作用尤其明显。这导致了协同作用，由此，当施用在tie2和/或rantes控制下表达aat的遗传修饰的msc时，对具有与不想要的炎症和/或免疫应答有关的医学病症的患者的治疗是尤其有效的。

在进一步的方面，本发明涉及aat修饰的细胞本身，而不限于特定的医学用途。在这方面，本文描述的aat修饰的细胞的各种结构特征，比如下文和实施例中所述的转基因序列、启动子、另外的载体组件，以及其组合，表现了对以前未描述的现有技术的贡献。

在进一步的方面，本发明涉及如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞。

在一种实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，通过将治疗有效数目的细胞引入患者的血流来施用所述细胞。

在进一步的方面，本发明涉及治疗肺部疾病的如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞。

在一种实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，肺部疾病是肺部炎性疾病。

在一种实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，肺部疾病是呼吸道疾病(respiratorydisease)。

在进一步的实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，肺部疾病是急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病(包括慢性支气管炎、肺气肿、支气管扩张和细支气管炎)、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、结节病、过敏性肺炎和/或肺纤维化。

在一种实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，通过将治疗有效数目的细胞通过吸入引入患者的肺部，任选地结合将所述细胞引入患者的血流来施用所述细胞。

根据本发明的肺部疾病可以涉及但不限于以下的一种或多种：急性支气管炎、急性呼吸窘迫综合征(ards)、石棉沉滞症、哮喘、支气管扩张、细支气管炎、闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎(boop)、支气管肺发育不良、棉屑沉着病、慢性支气管炎、球孢子菌病(cocci)、copd、隐源性机化性肺炎(cop)、囊性纤维化、肺气肿、汉坦病毒肺综合征、组织胞浆菌病、人偏肺病毒、过敏性肺炎、流感、淋巴管瘤病、间皮瘤、中东呼吸综合征、非结核分枝杆菌病、百日咳、尘肺病(黑肺病)、肺炎、原发性纤毛运动障碍、原发性肺动脉高压、肺动脉高血压、肺纤维化、肺血管疾病、呼吸道合胞病毒、结节病、重度急性呼吸综合征、矽肺、睡眠呼吸暂停、婴儿猝死综合征或结核病。

在优选的实施方式中，肺部疾病选自炎性肺部疾病或限制性肺部疾病、呼吸道感染和/或肺血管疾病或病症。

炎性肺部疾病通常以高嗜中性粒细胞计数为特征，例如哮喘、囊性纤维化、肺气肿、慢性阻塞性肺病或急性呼吸窘迫综合征。限制性肺部疾病是一类以肺顺应性丧失为特征的呼吸疾病，其导致肺扩张不全和肺僵硬性增加，如具有呼吸窘迫综合征的婴儿。

呼吸道感染可影响呼吸系统的任何部分。习惯上，它们分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。最常见的上呼吸道感染是普通感冒。然而，上呼吸道的特定器官感染如鼻窦炎、扁桃体炎、中耳炎、咽炎和喉炎也被认为是上呼吸道感染。最常见的下呼吸道感染是肺炎，在西方国家，肺炎通常是由细菌，尤其是肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)引起的肺部感染。在世界范围内，结核病是肺炎的重要原因。其他病原体如病毒和真菌可引起肺炎，例如重度急性呼吸综合征和肺孢子虫肺炎。肺炎可能会发生并发症如肺脓肿(其是感染引起的肺部圆形腔)，或可能扩散到胸膜腔。

本发明的一个方面涉及使用如本文描述的遗传修饰的aat修饰的msc治疗血管疾病。肺血管疾病是影响肺循环的病症。实例是肺栓塞，其是在静脉中形成、脱离、经过心脏并停留在肺中的血块(血栓栓塞)。大的肺栓塞是致命的，其导致猝死。许多其他物质也可以(通过血液流动)引起肺部栓塞，但是它们是罕见的，例如脂肪栓塞(尤其在骨损伤后)、羊水栓塞(伴有分娩并发症)或空气栓塞(医源性-由侵入性医疗过程引起)。根据本发明，还可以治疗以下肺部疾病：肺动脉高压，即肺动脉血压升高；肺水肿，流体从肺毛细血管渗漏进肺泡(或气室)；导致血液渗漏进肺泡的肺出血、炎症和肺部毛细血管损伤。

本文所述的遗传修饰的间充质干细胞也可以用作治疗具有或不具有α1-抗胰蛋白酶缺乏症的患者的、与α1-抗胰蛋白酶缺乏症(α1-抗胰蛋白酶缺乏症，a1ad)相关的医学病症的药物。

与α1-抗胰蛋白酶缺乏症相关的医学病症的实例是肝硬化、copd、气胸、哮喘、韦格纳肉芽肿病、胰腺炎、胆结石、支气管扩张、盆腔器官脱垂、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、肺气肿，主要涉及下肺叶并引起大泡的α1-抗胰蛋白酶缺乏症和继发性膜增生性肾小球肾炎。

在进一步的方面，本发明涉及本文描述的用作治疗炎性疾病的药物的遗传修饰的间充质干细胞。

在进一步的实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，炎性疾病是血管炎、肾炎、炎性肠病、类风湿性关节炎和/或移植物抗宿主病。

在一种实施方式中，本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，要治疗的炎性疾病是痛风。痛风是一种医学病症，其特征通常是在特定位置的导致肿胀和关节疼痛的复发性急性炎症性关节炎。大脚趾底部的跖趾关节是通常受影响的区域。痛风通常被公认是由血液中尿酸水平升高所引起，导致尿酸结晶，晶体沉积在患者体内的关节、肌腱和周围组织中。在一些情况下，痛风可能表现为痛风石、肾结石或尿酸性肾病。

惊人地，本发明的aat修饰的msc能够成为治疗痛风的有效治疗选项，其导致受影响区域的肿胀和疼痛减少。通过炎症减少和关节液中的尿酸晶体的减少可以观察成功的治疗。在进一步的方面，本发明涉及本文描述的用作治疗慢性纤维化的药物的遗传修饰的间充质干细胞。

在一种实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，炎性纤维化疾病和/或慢性纤维化疾病是受试者的肾脏，肝脏和/或结肠的纤维化疾病。

纤维化通常被认为是过量纤维结缔组织在器官或组织中的形成。纤维化可以是反应状态、良性状态或病理状态。结缔组织的不想要的沉积可以去除作为基础的器官或组织的结构和功能，从而导致病理状态。纤维化可以在体内的许多组织中发生，这通常是由于与不想要的炎症和/或免疫应答潜在相关的炎症或损伤。纤维化的实例包括肺的纤维化(肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化)、肝纤维化(肝硬化)、心脏纤维化(心内膜纤维化、老年心肌梗塞、心房纤维化)或其他原因的纤维化(纵隔(纵隔软组织)纤维化)、骨髓纤维化(骨髓)、腹膜后纤维化(腹膜后的软组织)、进行性大块纤维化(肺)；煤矿工人尘肺病并发症、肾源性全身纤维化(mephrogenicsystemicfibrosis)(皮肤)、克罗恩病(肠)、瘢痕疙瘩(皮肤)、硬皮病/系统性硬化症(皮肤、肺部)、关节纤维化(膝盖、肩部、其他关节)、杜普伊特伦挛缩(dupuytren'scontracture)(手、手指)或粘连性关节囊炎(肩部))。

令人惊讶的是，aat在纤维化区域的局部表达可能导致增强的治疗效果。msc可以显示朝向纤维化组织的意料不到的迁移特性，并且通过aat的表达导致纤维组织形成的减少。在该方法中，aat-msc特别用作抗炎治疗剂和/或免疫调节治疗剂。

使用本文描述的aat修饰的msc治疗1型糖尿病代表了本发明的进一步的方面。因此，本发明还涵盖i型糖尿病并发症的治疗。与1型糖尿病相关的潜在并发症包括心血管疾病，尤其是动脉粥样硬化的加速进展以及心脏病发作风险升高和/或中风、肾病、神经病变和视网膜病变。

在一种实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，受试者是人。

在一种实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，所述遗传修饰的细胞相对于受试者是同种异体的。

在一种实施方式中，如本文描述的用作药物的遗传修饰的间充质干细胞的特征在于，所述遗传修饰的细胞是相对于受试者自体的。

本发明的进一步的方面涉及本文描述的用于治疗炎性疾病或自身免疫性疾病如本文所述的那些疾病的aat修饰的msc，其中癌症被排除治疗的疾病的组之外。

在本发明的进一步的方面，通常提供遗传修饰或未修饰的msc用作治疗肺部疾病的药物。相对于aat修饰的msc，本文提及的细胞的特征也适用于本发明的进一步的实施方式。根据该实施方式，msc不包含aat编码核酸。遗传修饰可能不存在，或者msc可以包含编码治疗性蛋白质(如aat)的外源核酸。因此，本发明涉及使用msc治疗肺部疾病，而依赖于发生了msc的修饰还是发生了特定的遗传修饰。如本文描述的，msc的抗炎特性导致在治疗肺部疾病方面令人惊讶的良好功效。相对于用aat修饰的msc治疗，本文提及的要治疗的潜在肺部疾病也适用于本发明的该具体实施方式。

在本发明的进一步的方面，如本文描述的msc可以包含编码蛋白质cxcr4的外源核酸与适合于表达所述蛋白质的进一步的核酸序列的组合。cxcr4是参与到msc移动的细胞表面趋化因子受体，并且在小部分的msc的表面上表达。已经提出cxcr4的表达在msc朝组织损伤归巢的效率中起作用。最近的结果表明，cxcr4在msc中的表达增强了体外细胞的趋化性和旁分泌特征，并且改善了体内受损肺组织的msc归巢和定植。cxcr4编码序列可以存在于编码aat的相同外源核酸分子中，或存在于单独的外源核酸中。多个整合的核酸构建体或核酸盒可以存在于本发明的msc中，每个所述核酸构建体或表达盒携带一个或多个感兴趣的基因，例如治疗基因(如aat或参与细胞移动的其它基因(如cxcr4))。

具体实施方式

所有引用的专利文献和非专利文献的文件通过引用全文并入本文。

本文公开的“间充质细胞”(在一些实施方式中也称为“间充质干细胞”或“msc”)可以产生结缔组织、骨、软骨和循环系统与淋巴系统中的细胞。在间充质中发现间充质干细胞，所述间充质是由宽松包裹的梭形或星形非特化细胞组成的胚胎中胚层的一部分。如本文使用的，间充质干细胞包括但不限于cd34阴性干细胞。

在本发明的一种实施方式中，间充质细胞是成纤维细胞样的塑料贴附性细胞(plastic-adherentcells)，在某些实施方式中定义为多能间充质基质细胞，并且还包括cd34阴性细胞。

为了避免任何疑问，术语间充质细胞涵盖多能间充质基质细胞，该多能间充质基质细胞也包括间充质细胞、msc和它们的前体的亚群，所述亚群由能够在体内分化为多种细胞类型的多能(multipotent)或多能(pluripotent)自我更新细胞组成。

如本文使用的，cd34阴性细胞应该是指在其表面缺少cd34的细胞或仅表达可以忽略水平的cd34的细胞。cd34阴性细胞和分离这样的细胞的方法，例如描述于langec.等人,“在无动物血清的培养基中快速和安全地扩增人间充质基质细胞用于移植和再生医学(acceleratedandsafeexpansionofhumanmesenchymalstromalcellsinanimalserum-freemediumfortransplantationandregenerativemedicine)”.j.cellphysiol.2007,apr.25中。

可以通过许多指标将间充质细胞与造血干细胞(hsc)区别开。例如已知hsc在培养物中漂浮并且不黏着于塑料表面。相反，间充质细胞黏着于塑料表面。本发明的cd34阴性的间充质细胞在培养物中是粘附的。

本文描述的基因修饰的细胞可以根据其以固体、液体还是喷雾形式施用，以及对于这样的施用途径其作为注射剂是否需要无菌，包括不同类型的载体。本发明可以经静脉内、真皮内、动脉内、腹腔内、病变内、颅内、关节腔内、前列腺内、胸腔内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、总体地(topically)、瘤内、肌内、腹腔内、皮下、结膜下、小泡内(intravesicularlly)、粘膜、心包内、脐带内、眼内、经口、总体地(topically)、局部地(locally)，吸入(例如雾化吸入)、注射、输注、持续输注、局部灌注直接洗涤靶细胞，经由导管、经由灌洗，以膏状、以脂质组合物(例如脂质体)，或通过如本领域技术人员已知的其他方法或上述的任意组合施用(见例如，雷明顿的药物科学(remington'spharmaceuticalsciences),18thed.mackprintingcompany,1990，通过引用在此并入)。

本发明涵盖了通过将治疗有效数目的细胞引入受试者的血流来治疗患者。如本文使用，将细胞“引入受试者的血流”应包括但不限于将这样的细胞通过注射引入受试者的静脉或动脉之一。这样的施用也可以进行例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内。单次注射是优选的，但是在某些情况下经过一段时间(例如每季度、每半年或每年一次)重复注射是必要的。这样的施用也优选使用cd34-阴性细胞和药学上可接受的载体的混合物进行。药学上可接受的载体对本领域技术人员是熟知的，其包括但不限于0.01-0.1m和优选0.05m磷酸盐缓冲液或0.8％盐水，以及通常使用的专用深低温保存培养基。

可以在局部进行施用，例如通过注射到受试者身体的接近于炎症部位的区域中。已经显示msc向炎症迁移。间充质干细胞(msc)表现出对组织损伤部位以及肿瘤微环境的趋向性。由伤口分泌的许多相同的炎性介质发现于肿瘤微环境中，并且所述炎性介质被认为参与吸引msc到这些部位。细胞迁移取决于由受损细胞和/或应答的免疫细胞分泌的范围从生长因子到趋化因子的大量信号。msc很可能具有与对损伤和炎症部位作出响应的其他免疫细胞相似的趋化性质。无论如何，局部施用本文描述的细胞会在其作用部位导致高水平的细胞。

此外，这样的药学上可接受的载体可以是水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液，最优选是水溶液。含水载体包括水、酒精/水溶液、乳液和悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非胃肠载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液和固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂如林格氏葡萄糖、基于林格氏葡萄糖的载体等。通常可以在例如雷明顿：药学的科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy),20thed.,p.808,lippincottwilliamss-wilkins(2000)中找到通常用于静脉内施用的流体。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

如本文使用的，“治疗有效数目的细胞”包括但不限于以下的量和量的范围：(i)约1×10²至约1×10⁸个细胞/kg体重；(ii)约1×10³至约1×10⁷个细胞/kg体重；(iii)约1×10⁴至约1×10⁶个细胞/kg体重；(iv)约1×10⁴至约1×10⁵个细胞/kg体重；(v)约1×10⁵至约1×10⁶个细胞/kg体重；(vi)约5×10⁴至约0.5×10⁵个细胞/kg体重；(vii)约1×10³个细胞/kg体重；(viii)约1×10⁴个细胞/kg体重；(ix)约5×10⁴个细胞/kg体重；(x)约1×10⁵个细胞/kg体重；(xi)约5×10⁵个细胞/kg体重；(xii)约1×10⁶个细胞/kg体重；以及(xiii)约1×10⁷个细胞/kg体重。人体重预期包括但不限于约5kg、10kg、15kg、30kg、50kg、约60kg；约70kg；约80kg、约90kg；约100kg、约120kg和约150kg。这些数目基于临床前的动物实验和人体试验以及来自cd34+造血干细胞移植的标准方案。单核细胞(包括cd34+细胞)通常含有1:23000至1:300000的cd34阴性细胞。

如本文使用的，“治疗”患有疾病(如炎症)的受试者应该是指减慢、停止或逆转疾病进展。在优选的实施方式中，治疗患有疾病的受试者是指理想地使疾病进展逆转至消除疾病本身的点。如本文使用的，改善疾病和治疗疾病是等价的。本发明的治疗也可以或供选择地涉及所述细胞的预防性施用。这样的预防性施用可以涉及防止任何给定的医学病症(如防止炎症)，或防止所述疾病的发展，由此防止或预防在所有条件下狭义地不被解释为绝对的防止。防止或预防可能还涉及减少受试者发展出任何给定的医学病症的风险，优选对于处于所述病症的风险中的受试者。

通常，以本领域公认的意义使用的术语“炎症”涉及由组织损伤、感染或破坏引起的局部或全身性保护反应，其用于保护受试者免遭有害物质和损伤的组织之害。炎症优选以微脉管穿孔、血液元素渗透入胞间隙、白细胞迁移至发炎组织为特征，这导致顺序不受控的疼痛、发热、发红、肿胀以及功能丧失。

炎症可分为急性或慢性的。急性炎症是身体对有害刺激的初始响应，并且是通过血浆和白细胞(特别是粒细胞)从血液向受损组织的移动的增加而实现的。一系列生物化学事件使炎性响应传播和成熟，这涉及损伤组织内的局部血管系统、免疫系统和各种细胞。被称为慢性炎症的长期炎症导致炎症部位存在的细胞类型的进行性变化，其特征在于在炎症过程中同时破坏和愈合组织。

术语“不想要的炎症”优选地是指受试者的炎症超过生理有益的炎症反应的水平，并导致炎症部位的细胞，组织和/或器官的损伤。

术语“不想要的免疫应答”优选地是指受试者的免疫系统的反应性的改变，所述改变对其健康具有有害作用，并且可能涉及细胞因子的刺激和/或产生以及免疫细胞的募集。在例如自身免疫性疾病、移植排斥、过敏或炎性疾病中发生不想要的免疫应答。

因此，由不想要的炎症和/或免疫应答限定的医学病症是指许多疾病和/或病症，具体地包括但不限于血管炎、肾炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、痛风性关节炎、慢性纤维化、肺部炎性疾病或自身免疫性疾病。

肺部炎性疾病的实例包括但不限于肺损伤，慢性阻塞性肺病(copd)(包括慢性支气管炎、肺气肿、支气管扩张和细支气管炎)、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、结节病、过敏性肺炎和/或肺纤维化。在本发明的一些实施方式中，本文描述的msc以例如局部的方式朝受疾病状况影响的生理位置(如炎症区域)迁移，以便提供所述msc的治疗作用。

本发明还涉及治疗自身免疫性疾病，尤其是具有炎性成分的自身免疫性疾病。这些疾病还可以指风湿性疾病。这样的疾病优选选自高安氏动脉炎、巨细胞性动脉炎、家族性地中海热、川崎病、结节性多动脉炎、皮肤结节性多动脉炎(cutanouspolyarteritisnodosa)、肝炎相关性动脉炎、贝切特综合征(behcet'ssyndrome)、韦格纳肉芽肿病、变应性肉芽肿性血管炎(churg-strausssyndrome)、显微镜下多血管炎、结缔组织病血管炎、亨-斯二氏紫癜(hennoch-schonleinpurpura)、冷凝球蛋白性血管炎、皮肤白细胞分裂性血管炎、热带主动脉炎、结节病、柯根氏综合征、威-奥二氏综合征(wiskott-aldrichsyndrome)、麻风结节性动脉炎、cns原发性脉管炎、血栓闭塞性脉管炎、癌旁动脉炎、荨麻疹、德格氏病(dego'sdisease)、骨髓增生异常综合征、持久性隆起红斑、高免疫球蛋白d、过敏性鼻炎、支气管性哮喘、慢性阻塞性肺疾病、牙周炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、淀粉样变性、克隆氏病(morbuschron)、溃疡性结肠炎、自身免疫性肌炎、糖尿病、多发性硬化症、格林-巴利综合征、组织细胞增多症、骨关节炎、特异反应性皮炎、牙周炎、慢性鼻窦炎、银屑病、银屑病性关节炎、显微镜下结肠炎、肺纤维化、肾小球性肾炎、惠普尔氏病(whipple'sdisease)、斯提尔氏病(still'sdisease)、结节性红斑、耳炎、冷球蛋白血症、干燥综合征(sjogren'ssyndrome)、红斑狼疮、再生障碍性贫血、骨髓纤维瘤、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、木村氏病(kimura'sdisease)、系统性硬化症、慢性主动脉周围炎、慢性前列腺炎、特发性肺纤维化、慢性肉芽肿病、特发性失弛缓症、博来霉素诱导的肺部炎症、阿糖胞苷诱导的肺部炎症、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、自身免疫溶血性贫血、自身免疫性淋巴细胞减少症、恰加斯氏病(chagas'disease)、慢性自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎、格雷夫斯氏病、自身免疫性多腺体综合征、自身免疫性阿狄森综合症、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、疱疹样皮炎、自身免疫性脱发、白癜风、抗磷脂综合征、重症肌无力、僵硬人综合征、古德帕斯彻氏综合征、交感性眼炎、毛囊炎、夏普综合征和/或伊文思综合征。

如本文使用的，“细胞迁移”意图是指细胞朝向特定的化学或物理信号的移动。细胞通常响应于特定的外部信号而迁移，包括化学信号和机械信号。趋化性是关于应答于化学刺激的细胞迁移的一个例子。体外趋化性测定如博伊登室测定(boydenchamberassays)可以用于确定在任何给定的细胞中是否有细胞迁移。例如，可以纯化和分析感兴趣的细胞。使用板可以进行趋化性测定(例如根据falk等人,1980j.immuno.methods33:239-247)，在所述板中将特定的化学信号关于感兴趣的细胞和迁移的细胞放置，然后收集并且分析。例如，博伊登室测定需要使用通过过滤器分离的室，用作准确确定趋化行为的工具。这些室的先锋类型由boyden构建(boyden(1962)"多形核白细胞上的抗原和抗体的混合物的趋化作用(thechemotacticeffectofmixturesofantibodyandantigenonpolymorphonuclearleucocytes)".jexpmed115(3):453)。将游动细胞置于上室，同时将含有测试物质的流体过填充至下室。要研究的游动细胞的尺寸决定过滤器的孔径；选择允许活性迁移的直径是必要的。对于在体内条件下建模，几种方案优选用胞外基质分子(胶原蛋白、弹性蛋白等)覆盖过滤器。通过发展多孔室(例如neuroprobe)，增加测量的有效性，其中可平行评价24、96、384个样本。该变体的优势是在相同的条件下测定数个平行样本。

供选择地，可以在细胞移植后从受试者(例如啮齿动物模型)获得组织样品，并且测定所述组织样品的特定组织类型中感兴趣的细胞的存在。这样的测定可能具有分子性质，即基于核酸序列识别细胞，或具有组织学性质，即基于荧光标记在抗体标记后评估细胞。这种测定法对于评估移植细胞的移植也是尤其有用的。对移植物的测定还可以提供关于细胞迁移的信息，因为在某种程度上，移植取决于移植前的细胞定位。

在本发明的一些实施方式中，如本文描述的msc移植于受疾病状况影响的生理位置(如炎症区域)中，以便以例如局部方式赋予所述msc治疗作用。

如本文使用的“移入”涉及将移植的(grafted)或移植的(transplanted)组织或细胞并入宿主体内的过程。移入也涉及将移植的细胞整合至宿主组织以及它们的存活和在某些条件下分化为非干细胞状态。

用于评价msc的移入和由此评价msc在一定程度上的迁移和生物分布的技术可以涵盖体内或体外方法。体内方法的例子包括生物发光，由此转导细胞以表达荧光素酶，然后可以通过它们的荧光素代谢对细胞成像，导致光发射；荧光，由此使细胞负载荧光染料或转导以表达然后可以成像的荧光报告分子；放射性核素标记，其中使细胞负载放射性核素并用闪烁照相法(scintigraphy)、正电子放射断层造影术(pet)或单光子发射计算机断层造影术(spect)以及磁共振成像(mri)定位，其中用mri扫描仪追踪负载有顺磁性化合物(例如氧化铁纳米颗粒)的细胞。评价生物分布的体外方法包括定量pcr、流式细胞术和组织学方法。组织学方法包括追踪荧光标记的细胞；对例如y染色体和人特异性alu序列原位杂交；和对物种特异性的或基因引入的蛋白(如细菌β-半乳糖苷酶)的组织化学染色。这些免疫组织化学方法用于辨别移入位置，但是有必要切除组织。对于进一步回顾这些方法和它们的应用，见kean等人,msc：递送的路径和移入，细胞靶向策略以及免疫调节(mscs:deliveryroutesandengraftment,cell-targetingstrategies,andimmunemodulation),stemcellsinternational,volume2013(2013)。

因此，祖细胞或多能细胞，如本发明的间充质细胞，可以被描述为蛋白质递送载体，基本上能够使治疗性基因产物在受试者体内的特定组织或区域内定位和表达。这样的治疗性细胞提供了为其他治疗难治的疾病提供细胞治疗的能力。对于每种类型的治疗性细胞，最终目标是相同的：细胞应该表达特异性的全部基因，优选编码治疗性基因产物的外源核酸，由此修改细胞一致性以表达所述基因产物，以及提供治疗性作用，如抗炎作用。当本发明的细胞在体外扩增时，其表现出包括多代间充质(基质)细胞后代的异源群体，该异源群体缺少多数分化标记物如cd34的表达。这些群体可能保留了沿着间充质谱系和非间充质谱系的终末分化和成熟的有限的增殖潜力和应答性。

如本文使用的“诱导型表达”或“条件型表达”涉及基因表达的状态、多重状态或系统，其中感兴趣的基因如治疗性转基因优选是不表达的，或在某些实施方式中，以可忽略的或相对低的水平表达，除非细胞中存在允许基因表达的一种或多种分子(诱导剂)或其他一组条件。诱导型启动子可以涉及在特定的生物条件下以相对高水平表达的天然存在的启动子，或涉及包括任何给定的诱导型元件的其他合成启动子。诱导型启动子可以是指通过特定组织或微环境或存在于特定组织或微环境中的生物信号的组合所诱导的启动子，或指由外部因素，例如通过施用小的药物分子或其他外部施加的信号诱导的启动子。

如本文使用的，“接近”组织包括例如在组织的5mm、1mm之内，在组织的0.5mm之内和在组织的0.25mm之内。

考虑到干细胞可以显示在正常以及病态环境下向不同组织微环境的选择性迁移，本发明涵盖了与在募集的干细胞中启动的分化途径联系的组织特异性启动子的使用，并且所述组织特异性启动子理论上可以用于在限定的生物环境下仅驱动选择性表达治疗性基因。募集至其他组织部位但是没有经历分化的相同程序的干细胞不应表达治疗性基因。该方法使得显著程度地潜在控制治疗性基因在限定的微环境内的选择性表达，以及该方法已经成功应用于在新血管生成期间调节治疗性基因表达。wo2008/150368和wo2010/119039中公开了这样的基因修饰的可能方法，据此将其全文并入。

如本文所使用的，“核酸”应该指任何核酸分子，包括但不限于dna、rna和其杂交体或修饰的变体。“外源核酸”或“外源基因元件”涉及引入细胞的任何核酸，其不是细胞“原始”或“天然”基因组的组件。外源核酸可以是整合或不整合的，或涉及稳定转导的核酸。

本发明涵盖了任何给定的基因递送方法，并且所述基因递送方法优选涉及病毒或非病毒载体，以及转染的生物或化学方法。该方法可以在使用的系统中产生稳定或瞬时基因表达。

基因修饰的病毒已经广泛应用于将基因递送至干细胞。用于本文描述的msc的遗传修饰的优选病毒载体涉及反转录病毒载体，尤其涉及γ反转录病毒载体。γ反转录病毒(有时称为哺乳动物c型反转录病毒)是慢病毒进化枝的姊妹属，是反转录病毒科的正反转录病毒亚科的成员。鼠白血病病毒(mlv或mulv)、猫白血病病毒(felv)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(xmrv)和长臂猿白血病病毒(galv)是γ反转录病毒属的成员。技术人员知道在msc的遗传修饰中使用γ反转录病毒所需的技术。例如，可以采用maetzig等人(γ反转录病毒载体：生物学、技术和应用(gammaretroviralvectors:biology,technologyandapplication),2001,virusesjun；3(6):677-713)描述的载体或相似的载体。例如，鼠白血病病毒(mlv)是一种简单的γ反转录病毒，其可以在创建γ反转录病毒修饰的msc和在递送至受试者后由所述msc表达治疗性转基因的情况下转化为有效的遗传治疗剂载体。

可以应用腺病毒，或rna病毒如慢病毒，或其他反转录病毒。腺病毒已经被用于产生一系列用于基因转移细胞工程的载体。通过缺失e1基因(病毒复制所需)产生具有4kb克隆能力的载体，来生产初代腺病毒载体。另外缺失e3(负责宿主免疫应答)允许8kb克隆能力。通过包括e2和/或e4缺失产生进一步的代次。慢病毒是病毒的反转录病毒家族的成员(m.scherr等人,使用慢病毒载体将基因转移至造血干细胞(genetransferintohematopoieticstemcellsusinglentiviralvectors).currgenether.2002feb；2(1):45-55)。通过缺失除了ltr和顺式作用包装信号以外的整个病毒序列产生慢病毒载体。获得的载体具有约8kb的克隆能力。这些载体与反转录病毒载体的一个区别特征是它们转导分裂中细胞和非分裂中细胞以及终末分化细胞的能力。

还可以采用非病毒方法，如以下供选择的策略，其包括：常规的质粒转移和通过使用整合酶或转座酶技术的靶基因整合的应用。这些表示用于载体转化的方法，所述方法具有有效并且通常在它们的整合中是位点特异性的优势。将载体导入细胞的物理方法是技术人员已知的。一个例子涉及电穿孔，其依赖于使用通过克服它的电容在膜上产生瞬时孔的短时高电压的电脉冲。该方法的一个优势是可以将它用于在大多数细胞类型中稳定和瞬时基因表达。可供选择的方法涉及使用脂质体或蛋白转导域。适当的方法对技术人员是已知的，并且不意欲作为本发明的限制性实施方式。

附图说明

为了描述本发明的具体实施方式，通过证明本发明的实践实施提供了以下附图，而不限制对本发明的范围或本文描述的构思。

附图简述：

图1：本发明的优选的表达盒。

图2：ht1080细胞上的反转录病毒上清液的滴定。

图3：用病毒表达构建体转导的原代人msc的胞内流式细胞术分析。

图4：由elisa评估转基因aat的表达。

图5：通过由转导的msc所表达的aat抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。

图6：实验设计blm诱导的肺纤维化模型。

附图的详述：

图1：本发明的优选的表达盒。

本发明的优选的表达盒的示意图。图中所示的数字表示apceth的内部质粒名称，并且为了简化起见将在本文使用。启动子以小写p表示。ltr元件涉及使用的γ反转录病毒载体的长末端重复序列。内部核糖体进入位点缩写为ires。转录后调控元件缩写为opre。使用嘌呤霉素抗性基因(pac)进行选择。

图2：ht1080细胞上的反转录病毒上清液的滴定。

与较小的构建体如包含efs启动子的构建体(例如159或194)相比，较大的构建体(例如161和164，其中serpina1cdna由全长ef1a启动子驱动)虽然具有充足的滴度但产生减少。在本实验中，用慢病毒构建体215获得了最高的滴度。

图3：用病毒表达构建体转导的细胞的胞内流式细胞术分析。

图3a：用病毒表达构建体转导的原代人msc的胞内流式细胞术分析-icaat阳性细胞％。图3a描绘了用不同的γ-反转录病毒表达构建体和慢病毒表达构建体转导后胞内aat染色阳性的msc的百分比。图3b：用病毒表达构建体转导的原代人msc的胞内流式细胞术分析-平均荧光强度(mfi)。图3b描绘了用不同的γ-反转录病毒表达构建体和慢病毒表达构建体转导的msc的均荧光强度(mfi)值。所有测试的载体构建体均能够转导原代人msc，并且在所有转导的样品中通过胞内流式细胞术检测转基因aat。通过icaat阳性细胞％测量的转导效率的差异最可能是由于用于转导所使用的病毒上清的不同的起始滴度。通过mfi分析的不同表达水平是使用不同的启动子以及变化的基因盒分布(genecassetteconstellations)的结果。

图4：由elisa评估转基因aat的表达。

通过elisa在所有样品中证实原代人msc中的转基因aat的表达。表达量的差异是由于载体中使用不同的启动子以及变化的基因盒分布。

图5：通过由转导的msc所表达的aat抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。

由转导的原代人msc表达的aat是功能性的，并且以与含有10％血清或约1.5μmspck的培养基相当的水平抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。

图6：实验设计blm诱导的肺纤维化模型(改编自tashiro等人,2015)。

实施例

通过以下实施例进一步描述本发明。这些实施例不意图限制本发明的范围。实验例涉及能够使α-1抗胰蛋白酶(aat)由遗传修饰的msc表达的技术的开发。实施例进一步涉及涵盖肺部病症的治疗的治疗性试验。

在优选的实施方式中，实施例涉及结合α-1抗胰蛋白酶(aat)的抗炎作用与原代人间充质干细胞(msc)的免疫调节特性的新的基因治疗产品的临床前开发，所述新的基因治疗产品用于治疗炎性肺部疾病。

1.反转录病毒载体构建体的设计和克隆：

使用如julialodge,peterlund,steveminchin(2007)基因克隆(genecloning),newyork:tylorandfrancisgroup中描述的标准克隆技术构建转基因表达盒。这些构建体表达的基因是人serpina1cdna{智人(homosapiens)丝氨酸蛋白酶肽酶抑制剂肽酶抑制剂，分支1(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员1(serpina1)，转录变体1，mrna；ncbi参考序列：nm_000295.4，编码α-1抗胰蛋白酶(aat)}。还评估了根据seqidno2的上文描述的密码子优化cdna。

本文描述的serpina1基因通过激活不同的组成型启动子来表达，所述组成型启动子如人eef1a1真核翻译延伸因子1α1启动子(pef1a)、短形式的人eef1a1真核翻译延伸因子1α1启动子(pefs)、或人磷酸甘油酸激酶启动子(ppgk)。启动子也可以是诱导型启动子，如tie2、rantes或hsp70启动子。

该基因可以或不可以与标签序列(例如标记蛋白/肽，例如血凝素标签或his标签)融合，以便随后容易地检测表达(hinrikgaroff，1985，细胞生物学年度综述(annualreviewofcellbiology)，vol1：403-445)。

表达盒可以包括或可以不包括由选择性标记基因(如细胞表面标记物或抗性基因(例如用于赋予嘌呤霉素抗性的pac基因))组成的第二转基因盒以在随后的过程中允许富集基因修饰的细胞(davidp.clark,nanettej.pazdernik,2009,生物科技：应用基因革命(biotechnology:applyingthegeneticrevolution),london:elsevier)。基因由单独的启动子或位于serpina1表达盒内的ires序列的3’端的启动子驱动。

为了评估潜在的位置效应，将serpina1和pac盒以不同的分布(constellations)克隆(pac盒克隆在serpina1盒5’，以及serpina1盒克隆在pac盒5’)，参见图1。

然后将图1中公开的表达盒通过标准克隆技术插入合适的载体系统，例如γ-反转录病毒骨架(例如psers11、ep2019134a1)或慢病毒骨架(例如美国专利8,846,385，通过引用将其全文并入本文)。

在γ-反转录病毒构建体中，在表达盒3’存在opre序列。反转录病毒骨架含有长末端重复序列(ltr)，其位于盒的5’端和3’端。5’-ltr含有sv40增强子、rsv启动子、sffvpr和u5区。3’-ltr含有sffvpu3区、sffvr和u5区以及polya信号，所述sffvpu3区具有缺失，并且因此为载体提供了自我失活(sin)。

在慢病毒构建体中，在表达盒3’存在opre序列。慢病毒骨架含有长末端重复序列(ltr)，其位于盒的5’端和3’端。5’-ltr含有cmv启动子和hiv-1r和u5区。3’-ltr含有hiv-1u3区、hiv-1r和u5区以及polya信号，所述hiv-1u3区具有缺失，并且因此为载体提供了自我失活(sin)。

2.反转录病毒上清的滴定：

通过瞬时转染293t细胞产生编码指定的载体的病毒颗粒(soneoka等人,nucleicacidsresearch,1995)。为了确定病毒滴度，在第1天将ht1080纤维肉瘤细胞接种于12孔板，在第2天将病毒上清按不同稀释度添加至细胞，使用三个对照孔来确定每孔中的细胞数。转导后3天，通过检测aat蛋白的胞内流式细胞术测定分析转导效率。为了增强蛋白的检测，在染色之前，用golgiplug蛋白转运抑制剂(bd,555029)处理细胞16至24小时以防止细胞溶质蛋白分泌。根据制造商的指示，使用bdcytofix/cytoperm固定和透化溶液(bd，554722)使细胞透化，用fitc缀合的抗α1抗胰蛋白酶抗体(abcam，ab19170；每100μl染色反应1μl抗体，并高达1×10⁶个细胞，在黑暗中在4℃下温育20至30分钟)将表达aat的细胞染色。在beckmancoulterfc500流式细胞仪上分析细胞。在滴度计算中仅包括<25％的icaat阳性细胞的值。

结果参见图2。

3.人间充质干细胞(msc)的制备：

如d.j.prockop,d.g.phinney,b.a.bunnell,分子生物学中的方法(methodsinmolecularbiology)449,间充质干细胞(mesenchymalstemcells),托托瓦:胡玛娜出版社(totowa:humanapress)中的pittinger,m.f.(2008)中来自成人骨髓的间充质干细胞(mesenchymalstemcellsfromadultbonemarrow)所描述，通过塑料贴附法从骨髓分离人msc，并且在生长培养基(例如含有fbs的dmem)中培养所述msc。

4.msc的遗传修饰：

用如murray等人,1999人类基因治疗(humangenetherapy).10(11):1743-1752和davis等人,2004生物物理学期刊(biophysicaljournal)第86卷1234–1242描述的并进行修改来进行原代msc的转导。详细地：用聚l-赖氨酸(pll)(例如sigma-aldrich,p4707-50ml)来包被6孔培养板或12孔培养板(例如corning)；用pbs将pll溶液(0.01％)稀释至0.001％的终浓度。每孔使用1至2ml的稀释的pll。在室温下将板温育至少2小时。温育后，用pbs洗涤板一次。将(稀释的)病毒上清以0.8至2ml的终体积添加至每个pll包被的孔中。在4℃下以2000×g离心负载的板30分钟。然后弃去上清，将1×10⁵个msc以2ml的体积接种于6孔板中的一个孔中，或将4×10⁴个细胞以1ml的体积接种于12孔板的孔中。在37℃下在5％co2下温育板用于进一步的使用。

5.通过胞内流式细胞术评估转基因aat表达：

为了评估原代人msc中的转导效率和aat表达，制备细胞并如上描述用0.25至10的感染复数(moi)转导细胞。用嘌呤霉素(sigmaaldrich,p9620-10ml,[10mg/ml],终浓度：1至5μg/ml)选择转导的细胞5至8天。通过如上描述的胞内流式细胞术分析选择的细胞。

所有测试的载体构建体均能够转导原代人msc，在所有转导的样品中通过胞内流式细胞术检测转基因aat。通过icaat阳性细胞％测量的转导效率的差异最可能是由于用于转导的病毒上清的不同起始滴度导致的，使得进一步分离和培养时的任何的提供的细胞群可能提供适合的aat表达。通过mfi分析的不同表达水平是由于使用的不同的启动子以及变化的基因盒分布(constellations)的结果。

结果参见图3。

6.通过elisa评估转基因aat的表达：

用表达aat和pac基因的指定的反转录病毒构建体转导人msc。如上所述用嘌呤霉素选择细胞，并将1×10⁵个细胞接种到6孔或12孔板上。在48小时后收集上清(1至2ml)，并根据制造商的指示通过elisa(α-1抗胰蛋白酶(serpina1)人elisa试剂盒,abcam,ab108799)分析所述上清。将产生的数据归一化为1×10⁵个细胞和载体拷贝数(vcn)。

通过elisa在所有样品中证实原代人msc中的转基因aat表达。表达的量的差异是由于载体中使用的不同的启动子以及变化的基因盒分布，使得提供的每个样品在蛋白水平上的充分的aat表达成为可能以获得希望的效果。

结果参见图4。

7.由转导的msc表达的aat抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶：

用表达aat和pac基因的指定的反转录病毒构建体转导人msc。用嘌呤霉素选择细胞，将选择的细胞接种于6孔板或12孔板的不含血清的dmem中。在48小时后收集上清(1至2ml)，根据制造商的指示通过嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂筛选试剂盒(abcam,ab118971)分析上清。在不含血清的dmem中以未稀释(1:1)至1:16的不同稀释度分析转导的msc的上清。不同浓度的spck和含有血清(bio-m和bio-1)的培养基作为阳性对照包括，dmem用作阴性对照。

嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制是用于检测体外aat活性的功能性测定。本文提供的构建体显示了对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的有效抑制，从而表明了由实施例的修饰的msc表达功能性aat。

结果参见图5。

8.msc表达的aat对单核细胞的免疫调节作用的评估：

使用ivanj.fuss,marjoriee.kanof,phillipd.smith,heddyzola,2009curr.protoc.immunol.85:7.1.1-7.1.8描述的聚蔗糖密度梯度离心从人血液中分离外周血单核细胞(pbmc)。为了评估aat-msc的体外免疫调节作用，如janciauskiene等人,生物化学与生物物理学研究通讯(biochemicalandbiophysicalresearchcommunications),2004描述的进行lps诱导的人类单核细胞激活。简单来说，用脂多糖(lps)刺激单核细胞，通过elisa在上清中评估msc表达的aat对促炎细胞因子(如tnfα和il-1β)的分泌的作用以及对由人单核细胞表达抗炎细胞因子(如il-10)的作用。

当在由遗传修饰的msc分泌的aat的存在(来自转导以表达aat的msc的上清)下培养人原代单核细胞时，从单核细胞培养物收获的上清中的促炎细胞因子(tnfα、il-1α)的表达显著降低，而抗炎细胞因子如il-10的水平提高。

9.在动物模型中施用aat-msc的免疫调节作用的评估：

制备用于体内实验的细胞并如上所述遗传修饰所述细胞。在深低温保存或收获用于施用之前，进一步选择并扩增转导的细胞。在注射前将细胞解冻，用pbs或任何其它合适的缓冲液洗涤和重悬，或从培养瓶分离，用pbs或任何其它合适的缓冲液洗涤和重悬，然后注射。

10.博来霉素(blm)诱导的肺纤维化：

为了测试体内aat-msc的免疫调节作用和抗纤维化作用，如tashiro等人,转化科学(translationalscience)2015描述的进行了博来霉素诱导的肺纤维化的小鼠模型。

简单来说，在c57bl/6小鼠中诱导blm肺纤维化。施用麻醉后，通过经插管的直接气管内滴注以2.5u每kg体重施用溶解于50μl无菌盐水中的blm硫酸盐(sigma-aldrich)。blm施用后24至72小时，每只动物通过尾静脉注射或气管内施用接受200μlpbs(对照)、200μlpbs中的1×10⁶个未转导的msc或200μlpbs中的1×10⁶个aat转导的msc。每隔一天通过眶后采血监测血清aat水平，通过elisa进行aat蛋白的后续检测。

施用blm后14至21天处死小鼠。

从小鼠收获左侧肺叶用于蛋白和信使rna(mrna)分析。对于形态测量学和病理学研究，通过在10％中性缓冲福尔马林中浸泡24小时来固定右侧肺叶，然后将其转移至4℃的pbs。将样品石蜡包埋，获得切片用于苏木精-伊红和马松三色染色。使用对马松三色染色载玻片的半定量阿希克夫法(ashcroftmethod)评估肺纤维化(ashcroft等人,临床病理学期刊(journalofclinicalpathology)1988)。

实验设计的综述参见图6。

在第21天处死的时间点，通过阿希克夫分数未经msc处理的blm小鼠显示了肺纤维化，而用msc或aat-msc处理的小鼠显示降低的纤维化。这种降低在接受了表达aat的msc的组中更显著。

11.环磷酰胺促进的1型糖尿病：

为了评估aat-msc对体内糖尿病发展的影响，进行了环磷酰胺促进的1型糖尿病的小鼠模型(改编自brode等人,免疫学期刊(thejournalofimmunology)2006)。

获得nod小鼠，其中到40周龄时，雌性小鼠中糖尿病的发病率为75％。为了促进和使糖尿病同步，向8周龄雌性nod小鼠单次腹腔内注射环磷酰胺(cy)(200mg/kg体重于0.9％生理盐水中)对其进行处理。然后将小鼠随机分为处理组和对照组。环磷酰胺处理后1至5天，每只动物通过尾静脉注射或腹腔内注射接受200μlpbs(对照)、200μlpbs中的1×10⁶个未转导的msc或200μlpbs中的1×10⁶个aat转导的msc。每周监测小鼠的高血糖症，直到其按照两次连续的(间隔>24小时)非空腹血糖水平>240mg/dl的定义的，成为糖尿病小鼠。

接受cy和pbs的所有对照小鼠在30天内均发展出糖尿病，而用msc或aat-msc处理的小鼠中糖尿病的发作延迟。有趣的是，在用aat-msc处理的小鼠中，与未修饰的msc相比，糖尿病发展的延迟增加了2周。

12.msu/c16.0诱导的痛风性关节炎：

为了评估aat-msc对体内痛风性关节炎的抗炎作用，进行了msu/c16.0诱导的痛风性关节炎的小鼠模型(改编自joosten等人,风湿病年鉴(annalsoftherheumaticdiseases)2015)。

雄性c57bl/6小鼠获得自杰克逊实验室(jacksonlaboratories)(巴尔港，缅因，usa)，并且在10至12周时使用。在诱导痛风性关节炎之前的1至3天，每只动物通过腹腔内施用接受200μlpbs(对照)、200μlpbs中的1×10⁶个未转导的msc或200μlpbs中的1×10⁶个aat转导的msc。通过将在10μlpbs中混合了200μmc16.0/牛血清白蛋白(bsa)的300μgmsu晶体关节内注射至未实验的小鼠(naivemice)的右膝关节，诱导关节炎症。关节内注射4小时后，确定肉眼可见的关节肿胀。分离滑膜组织并在37℃下在组织培养培养基中培养2小时，或直接转移至200μltriton×100(在pbs中为0.5％)。此外，移出膝关节用于病理学。

用未修饰的msc或aat-msc处理抑制了mscu/c16.0诱导的关节炎症；然而，当用aat-msc处理小鼠时，炎症更显著地降低。

13.aat-msc对mhc匹配的少数抗原不同的鼠移植模型的gvhd预防的作用：

为了评估aat-msc的可能的抗gvhd作用，进行鼠移植模型(mhc匹配的，少数抗原不同的)(改编自marcondes等人,血液(blood)2011)。

10至14周龄的平均体重为28g的c57/bl6j小鼠(h-2^b；杰克逊实验室)接受单次剂量的1000cgy全身照射，然后通过尾静脉内注射t细胞消除(t-celldepleted)的骨髓(5×10⁶个细胞)，以及来自c3h.sw-h2b/snj供体(h-2bc；杰克逊实验室)的cd8+脾淋巴细胞(0.2×10⁶个细胞)。将小鼠随机分为处理组和对照组。在照射和供体细胞融合之前，通过腹腔内注射或尾动脉内注射给予实验组中的小鼠200μlpbs中的1×10⁶个未转导的msc或200μlpbs中的1×10⁶个aat转导的msc。还向对照组中的小鼠腹腔内注射或静脉内注射200μlpbs。通过标准评分系统(cooke等人,血液(blood)1996)评估了gvhd：在第0天获得并记录体重，之后每周进行一次。通过将5个标准的分数：(体重改变、姿态(弓背)、活动性、皮毛纹理和皮肤完整性的百分比)(最大分数＝10)求和生成每周临床指数。继续收集血液样品用于细胞因子测定。

与对照小鼠相比，用未修饰的msc或aat-msc处理导致减弱或预防gvhd以及优秀的存活率。有趣的是，与天然msc相比，aat-msc的有益效果更突出。