新的微小肌养蛋白及相关使用方法与流程

相关申请的交叉引用本申请要求于2015年1月16日提交的美国临时申请no.62/104,537的权益，其在此通过引用整体并入。关于联邦资助研究的声明本发明是在由国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的基金no.r01ag033610的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利.本公开内容一般性地涉及微小肌养蛋白(micro-dystrophin)。本公开内容还涉及治疗患有肌营养不良、肌肉减少(sarcopenia)、心力衰竭或恶病质的对象的方法。本公开内容还涉及预防性治疗处于发生肌营养不良、肌肉减少、心力衰竭或恶病质之风险中的对象的方法。具体地，所述方法可包括向对象施用包含微小肌养蛋白基因和递送载剂的药物组合物.更特别地，所述方法可包括向患有迪谢内肌营养不良(duchennemusculardystrophy)或贝克肌营养不良(beckermusculardystrophy)的对象施用所述药物组合物。
背景技术：
：迪谢内肌营养不良(duchennemusculardystrophy，dmd)是隐性遗传的肌消耗性病症，其影响约1/3500的男性。dmd患者在肌养蛋白基因中携带导致肌养蛋白蛋白质异常表达或表达丧失的突变。dmd患者经历骨骼肌的进行性消耗和心功能障碍，这导致主要由于心脏或呼吸衰竭的步行丧失(lossofambulation)和过早死亡。遗憾的是，目前可用的治疗通常只能减缓dmd的病理状况。因此，迫切需要用于治疗dmd的组合物和方法.发明概述本公开内容至少部分地基于新的微小肌养蛋白、其组合物及相关使用方法。在本公开内容的一些实施方案中，分离和纯化的核苷酸序列包含：(a)编码蛋白质的微小肌养蛋白基因，所述蛋白质包含氨基末端肌动蛋白结合结构域、β-肌养蛋白聚糖结合结构域和含有至少四个血影蛋白样重复的血影蛋白样重复结构域，使得所述至少四个血影蛋白样重复中的两个包含神经元型一氧化氮合酶结合结构域；以及(b)调节盒(regulatorycassette)。在一个实施方案中，所述至少四个血影蛋白样重复包括血影蛋白样重复1(sr1)、血影蛋白样重复16(sr16)、血影蛋白样重复17(sr17)和血影蛋白样重复24(sr24)。在另一个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质还包含铰链结构域的至少一部分。在另一个实施方案中，铰链结构域选自铰链1结构域、铰链2结构域、铰链3结构域、铰链4结构域和铰链样结构域中的至少一种。在另一个实施方案中，调节盒选自ck8启动子和心肌肌钙蛋白t(cardiactroponint，ctnt)启动子。在一个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质具有5个血影蛋白样重复至8个血影蛋白样重复。在另一个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质与seqidno：4的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。在另一个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质与seqidno：4的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在另一个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质与seqidno：5的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。在一个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质与seqidno：5的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在另一个实施方案中，调节盒是ck8启动子，并且其中所述ck8启动子与seqidno：19的核酸序列具有至少80％的序列同一性。在另一个实施方案中，调节盒是ck8启动子，并且其中所述ck8启动子与seqidno：19的核酸序列具有至少90％的序列同一性。在另一个实施方案中，调节盒是ctnt启动子，并且其中所述ctnt启动子与seqidno：1的核酸序列具有至少80％的序列同一性。在一个实施方案中，调节盒是ctnt启动子，并且其中所述ctnt启动子与seqidno：1的核酸序列具有至少90％的序列同一性。在本公开内容的某些实施方案中，分离和纯化的核苷酸序列包含编码蛋白质的微小肌养蛋白基因，所述蛋白质包含氨基末端肌动蛋白结合结构域和至少两个彼此直接连接的血影蛋白样重复，其中所述至少两个彼此直接连接的血影蛋白样重复选自以下至少一个：与血影蛋白样重复2直接连接的血影蛋白样重复1、与血影蛋白样重复3直接连接的血影蛋白样重复2、与血影蛋白样重复16直接连接的血影蛋白样重复1、与血影蛋白样重复23直接连接的血影蛋白样重复17、与血影蛋白样重复24直接连接的血影蛋白样重复17，以及与血影蛋白样重复24直接连接的血影蛋白样重复23.在本公开内容的某些其他实施方案中，分离和纯化的核苷酸序列包含编码蛋白质的微小肌养蛋白基因，所述蛋白质按顺序包含：铰链1结构域(h1)、血影蛋白样重复1(sr1)、血影蛋白样重复16(sr16)、血影蛋白样重复17(sr17)、血影蛋白样重复24(sr24)和铰链4结构域(h4)。在一个实施方案中，h1与sr1直接连接.在另一个实施方案中，sr1与sr16直接连接。在另一个实施方案中，sr16与sr17直接连接。在另一个实施方案中，sr17与sr24直接连接。在另一个实施方案中，sr24与h4直接连接。在另一个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质还在sr1与sr16之间按顺序包含血影蛋白样重复2(sr2)和血影蛋白样重复3(sr3)。在另一个实施方案中，sr1与sr2直接连接，并且sr2进一步与sr3连接。在本公开内容的一些实施方案中，分离和纯化的核苷酸序列包含编码蛋白质的微小肌养蛋白基因，所述蛋白质按顺序包含：铰链1结构域(h1)、血影蛋白样重复1(sr1)、血影蛋白样重复16(sr16)、血影蛋白样重复17(sr17)、血影蛋白样重复23(sr23)、血影蛋白样重复24(sr24)和铰链4结构域(h4)。在一个实施方案中，h1与sr1直接连接，sr1与sr16直接连接，sr16与直接sr17连接，sr17与sr23直接连接，sr23与sr24直接连接，并且sr24与h4直接连接。在本公开内容的某些实施方案中，药物组合物包含本文中描述的分离和纯化的核苷酸序列，以及递送载剂。在一个实施方案中，递送载剂包含重组腺相关病毒载体。在另一个实施方案中，递送载剂表达微小肌养蛋白基因，使得由所述微小肌养蛋白基因编码的蛋白质与seqidno：4的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。在另一个实施方案中，递送载剂表达微小肌养蛋白基因，使得由所述微小肌养蛋白基因编码的蛋白质与seqidno：4的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在另一个实施方案中，递送载剂表达微小肌养蛋白基因，使得由所述微小肌养蛋白基因编码的蛋白质与seqidno：5的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。在另一个实施方案中，递送载剂表达微小肌养蛋白基因，使得由所述微小肌养蛋白基因编码的蛋白质与seqidno：5的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在本公开内容的一些实施方案中，本文中描述的药物组合物包含调节盒，使得所述调节盒是ck8启动子，并且所述ck8启动子与seqidno：19的核酸序列具有至少80％的序列同一性。在本公开内容的某些实施方案中，本文中描述的药物组合物包含调节盒，使得所述调节盒是ck8启动子，并且所述ck8启动子与seqidno：19的核酸序列具有至少90％的序列同一性。在本公开内容的一些实施方案中，本文中描述的药物组合物包含调节盒，使得所述调节盒是ctnt启动子，并且所述ctnt启动子与seqidno：1的核酸序列具有至少80％的序列同一性。在本公开内容的某些实施方案中，本文中描述的药物组合物包含调节盒，使得所述调节盒是ctnt启动子，并且所述ctnt启动子与seqidno：1的核酸序列具有至少90％的序列同一性。在本公开内容的一些实施方案中，药物组合物配置成降低选自以下至少一种的肌营养不良的病理影响或症状：强直性肌营养不良(myotonicmusculardystrophy)、迪谢内肌营养不良(duchennemusculardystrophy)、贝克肌营养不良(beckermusculardystrophy)、肢带型肌营养不良(limb-girdlemusculardystrophy)、面-肩-肱型肌营养不良(facioscapulohumeralmusculardystrophy)、先天性肌营养不良(congenitalmusculardystrophy)、眼咽型肌营养不良(oculopharngealmusculardystrophy)、远端型肌营养不良(distalmusculardystrophy)和埃-德肌营养不良(emery-dreifussmusculardystrophy)。本公开内容的某些实施方案中，药物组合物配置成降低选自迪谢内肌营养不良和贝克肌营养不良中至少一种的肌营养不良的病理影响或症状。在本公开内容的一些实施方案中，药物组合物配置成降低肌肉减少、心脏病和恶病质中至少一种的病理影响或症状。在本公开内容的一些具体实施方案中，药物组合物包含：含有seqidno：16的核酸序列的微小肌养蛋白基因，以及腺相关病毒(adeno-associatedvirus，aav)载体或重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus，raav)载体。在某些实施方案中，aav载体或raav载体的血清型选自血清型6、血清型8和血清型9中的至少一种.在本公开内容的一些实施方案中，药物组合物包含：编码蛋白质的微小肌养蛋白基因，使得所述蛋白质包含seqidno：4的氨基酸序列；以及腺相关病毒(aav)载体或重组腺相关病毒(raav)载体。在某些实施方案中，aav载体或raav载体的血清型选自血清型6、血清型8和血清型9中的至少一种。在本公开内容的某些实施方案中，药物组合物包含：含有seqidno：18的核酸序列的微小肌养蛋白基因，以及腺相关病毒(aav)载体或重组腺相关病毒(raav)载体。在一些实施方案中，aav载体或raav载体的血清型选自血清型6、血清型8和血清型9中的至少一种。在本公开内容的一些具体实施方案中，药物组合物包含：编码蛋白质的微小肌养蛋白基因，使得所述蛋白质包含seqidno：5的氨基酸序列；以及腺相关病毒(aav)载体或重组腺相关病毒(raav)载体。在一些实施方案中，aav载体或raav载体的血清型选自血清型6、血清型8和血清型9中的至少一种。在本公开内容的一些实施方案中，适用于治疗或预防性治疗肌营养不良的药物组合物包含：含有seqidno：16或seqidno：18的核酸序列的微小肌养蛋白基因，以及腺相关病毒(aav)载体或重组腺相关病毒(raav)载体，使得所述aav载体或所述raav载体的血清型选自血清型6、血清型8和血清型9中的至少一种。在本公开内容的某些实施方案中，适用于治疗或预防性治疗肌营养不良的药物组合物包含：含有seqidno：16或seqidno：18的核酸序列的微小肌养蛋白基因，以及腺相关病毒(aav)载体或重组腺相关病毒(raav)载体，使得所述aav载体或所述raav载体的血清型选自血清型6、血清型8和血清型9中的至少一种。在本公开内容的一些具体实施方案中，用于治疗患有肌营养不良的对象的方法包括：向所述对象施用治疗有效量的包含微小肌养蛋白基因的药物组合物，所述微小肌养蛋白基因与调节盒可操作地连接。在一个实施方案中，调节盒选自ck8启动子和心肌肌钙蛋白t(ctnt)启动子。在另一个实施方案中，调节盒配置成表达微小肌养蛋白基因，使得所述微小肌养蛋白基因在横纹肌细胞中的表达水平是所述微小肌养蛋白基因在非肌细胞中表达水平的至少100倍高.在本公开内容的某些实施方案中，本文中描述的药物组合物还包含配置成在对象中表达微小肌养蛋白基因的重组腺相关病毒载体。在一个实施方案中，微小肌养蛋白基因编码与seqidno：4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的蛋白质。在另一个实施方案中，微小肌养蛋白基因编码与seqidno：4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的蛋白质。在另一个实施方案中，微小肌养蛋白基因编码与seqidno：5的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的蛋白质。在另一个实施方案中，微小肌养蛋白基因编码与seqidno：5的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的蛋白质。在一个实施方案中，调节盒是ck8启动子，并且所述ck8启动子与seqidno：19的核酸序列具有至少80％的序列同一性。在另一个实施方案中，调节盒是ck8启动子，并且所述ck8启动子与seqidno：19的核酸序列具有至少90％的序列同一性。在另一个实施方案中，调节盒是ctnt启动子，并且所述ctnt启动子与seqidno：1的核酸序列具有至少80％的序列同一性。在另一个实施方案中，调节盒是ctnt启动子，并且所述ctnt启动子与seqidno：1的核酸序列具有至少90％的序列同一性。在一个实施方案中，微小肌养蛋白基因在对象的一种或更多种肌肉中表达微小肌养蛋白蛋白质，使得所述一种或更多种肌肉的收缩性增强.在另一个实施方案中，微小肌养蛋白基因在对象的一种或更多种骨骼肌中表达微小肌养蛋白蛋白质，使得所述一种或更多种骨骼肌中至少一种的比产力能力(specific-forcegeneratingcapacity)提高至正常比产力能力的至少40％以内。在另一个实施方案中，微小肌养蛋白基因在对象的一种或更多种心肌中表达微小肌养蛋白蛋白质，使得基线舒张期末容积缺陷恢复至正常舒张期末容积的至少40％以内。在另一个实施方案中，微小肌养蛋白基因表达微小肌养蛋白蛋白质，使得在对象中神经元型一氧化氮合酶向肌养蛋白-糖蛋白复合物的定位增强。在一些实施方案中，肌营养不良选自以下至少一种：强直性肌营养不良、迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面-肩-肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良和埃-德肌营养不良。在某些实施方案中，肌营养不良选自迪谢内肌营养不良和贝克肌营养不良中的至少一种。在本公开内容的一些实施方案中，药物组合物降低肌营养不良的病理影响或症状.在一些具体实施方案中，肌营养不良的病理影响或症状选自以下至少一种：肌肉疼痛、肌肉无力(muscleweakness)、肌肉疲劳、肌肉萎缩、纤维化、炎症、骨骼肌中的平均肌纤维直径增大、心肌病、6分钟步行测试时间缩短(reduced6-minutewalktesttime)、步行丧失和心泵衰竭(cardiacpumpfailure)。在一些实施方案中，本文中描述的方法包括鉴定患有肌营养不良的对象。在某些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些具体实施方案中，对象是人。在本公开内容的一些实施方案中，用于预防性治疗处于发生肌营养不良之风险中的对象的方法包括向所述对象施用治疗有效量的包含微小肌养蛋白基因的药物组合物，所述微小肌养蛋白基因与调节盒可操作地连接.在一个实施方案中，调节盒选自ck8启动子和心肌肌钙蛋白t(ctnt)启动子。在另一些实施方案中，调节盒配置成表达微小肌养蛋白基因，使得微小肌养蛋白基因在横纹肌细胞中的表达水平是微小肌养蛋白基因在非肌细胞中表达水平的至少100倍高。在一些具体实施方案中，药物组合物还包含配置成在对象中表达微小肌养蛋白基因的重组腺相关病毒载体。在某些实施方案中，微小肌养蛋白基因编码与seqidno：4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的蛋白质。在另一个实施方案中，微小肌养蛋白基因编码与seqidno：4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的蛋白质。在一些实施方案中，微小肌养蛋白基因编码与seqidno：5的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的蛋白质。在另一个实施方案中，微小肌养蛋白基因编码与seqidno：5的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的蛋白质。在某些实施方案中，调节盒是ck8启动子，并且所述ck8启动子与seqidno：19的核酸序列具有至少80％的序列同一性。在另一个实施方案中，调节盒是ck8启动子，并且所述ck8启动子与seqidno：19的核酸序列具有至少90％的序列同一性。在另一个实施方案中，调节盒是ctnt启动子，并且所述ctnt启动子与seqidno：1的核酸序列具有至少80％的序列同一性。在另一个实施方案中，调节盒是ctnt启动子，并且所述ctnt启动子与seqidno：1的核酸序列具有至少90％的序列同一性。在一些具体实施方案中，微小肌养蛋白基因在对象的一种或更多种肌肉中表达微小肌养蛋白蛋白质，使得所述一种或更多种肌肉的收缩性增强。在另一个实施方案中，微小肌养蛋白基因在对象的一种或更多种骨骼肌中表达微小肌养蛋白蛋白质，使得所述一种或更多种骨骼肌中至少一种的比产力能力提高至正常比产力能力的至少40％以内。在一些实施方案中，微小肌养蛋白基因在对象的一种或更多种心肌中表达微小肌养蛋白蛋白质，使得基线舒张期末容积缺陷恢复至正常舒张期末容积的至少40％以内。在某些实施方案中，微小肌养蛋白基因表达微小肌养蛋白蛋白质，使得在对象中神经元型一氧化氮合酶向肌养蛋白-糖蛋白复合物的定位增强。在一些具体实施方案中，肌营养不良选自以下至少一种：强直性肌营养不良、迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面-肩-肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良和埃-德肌营养不良。在一些实施方案中，肌营养不良选自迪谢内肌营养不良和贝克肌营养不良中的至少一种。在某些实施方案中，本文中描述的药物组合物降低发生肌营养不良的病理影响或症状的风险。在一个实施方案中，肌营养不良的病理影响或症状选自以下至少一种：肌肉疼痛、肌肉无力、肌肉疲劳、肌肉萎缩、纤维化、炎症、骨骼肌中的平均肌纤维直径增大、心肌病、6分钟步行测试时间缩短、步行丧失和心泵衰竭。在本公开内容的一些实施方案中，本文中描述的方法还包括鉴定处于发生肌营养不良之风险中的对象。在一个实施方案中，对象是哺乳动物。在另一个实施方案中，对象是人。本公开内容的其他特征和优点将由以下详细说明和权利要求书而显而易见.附图简述结合附图根据以下描述和所附权利要书书，本文中公开的实施方案将变得更加完全显而易见。图1a示出了如本文中公开的截短肌养蛋白构建体的一些实施方案的蛋白质结构图。nt，氨基末端结构域；h，铰链；r，血影蛋白样重复；nnosbd，神经元型一氧化氮合酶结合结构域；cr，富含半胱氨酸的结构域；ct，羧基末端结构域；syn，互养蛋白(syntrophin)结合结构域；dbbd，小肌营养蛋白(dystrobrevin)结合结构域；未标记的区域标记r15与r16之间的20个氨基酸；aa，氨基酸；以及kda，千道尔顿。图1b是示出了在对侧肌肉用作内部未经处理对照的同时向营养不良型mdx4cv小鼠的一个胫骨前肌(tibialisanterior，ta)肌肉中注射5×1010个raav/cmv-μdys载体基因组(vectorgenome，vg)的结果的western印迹。在处理后4周通过ta肌肉裂解物以及野生型和未经处理mdx4cv对照的western印迹分析来验证所有受试构建体的表达。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)用作内部上样对照。图1c和1d是分别示出了在处理后4或12周量化来自ta横切面的肌纤维的肌养蛋白表达和中央成核的图(对于每个时间点，n＝3-5/群组；平均值±s.e.m)。μdysh3用作性能的比较标准。μdys6和μdys7太大而不能使用普遍存在的巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)启动子克隆到aav表达载体中，因此，用肌原性特异性ck8启动子替代cmv启动子以允许高效包装和体内评价。因此，用ck8调节表达盒重新评价μdysh3。字符表示相对于野生型小鼠的显著性。＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001，#p＜0.0001。图2是示出了在处理后6个月代表性腓肠肌横切面的一系列显微照图。如图所示，左列中示出了肌养蛋白和经dapi染色的核，中间列中示出β肌养蛋白聚糖和dapi，并且右列中示出了神经元型一氧化氮合酶(nnos)。各行示出了野生型小鼠、经处理的mdx4cv小鼠和未经处理的mdx4cv小鼠的群组的代表性结果。比例尺，200μm。肌养蛋白糖蛋白复合物(dystrophinglycoproteincomplex，dgc)成员的募集通常取决于μdys构建体中的结合结构域。在14日龄时向营养不良型mdx4cv小鼠眶后注射1×1013vg的raav6/ck8-μdys。在处理后3和6个月，针对dgc成员对骨骼肌进行免疫染色。图3a至3d是示出了在处理后3个月评价全身处理的图。评价腓肠肌(图3a和3b)和膈肌(图3c和3d)以确定新μdys构建体的性能。量化肌肉横切面的肌养蛋白表达和中央成核的肌纤维。表现出肌养蛋白表达和/或表现出中央成核的肌纤维的水平以百分比表示(图3a和3c)。对于腓肠肌，原位测量比产力(specificforcegeneration)(图3b)，对于膈肌条，体外测量比产力(图3d)。图3d的柱中列出了每个群组的n值。对于未加括号的字符，与野生型相比：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。与经μdys2处理的小鼠相比：^p＜0.05，^^p＜0.01，^^^p＜0.001。与经μdys5处理的小鼠相比：#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。图4a至4d是示出了在处理后6个月评价全身处理的图。如图3a至3d中所述评价腓肠肌(图4a和4b)和膈肌(图4c和4d)。图4d的柱中列出了每个群组的n值.与野生型相比：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。与经μdys2处理的小鼠相比：^p＜0.05，^^p＜0.01，^^^p＜0.001。与经μdys7处理的小鼠相比：#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。图5a和5b是示出了骨骼肌中来自离心收缩的肌膜保护的程度的图。使经全身处理的小鼠(如图2和4a至4d所述)经受长度提高的离心收缩。测量腓肠肌(图5a)和膈肌条(图5b)在离心收缩前产生的最大等长力。在刺激收缩期间，肌肉以超过其最佳纤维长度的限定距离拉长.距离作为超过最佳纤维长度(lo)的百分比报道。在超过lo45％时，与野生型相比：＊p＜0.05，＊＊＊p＜0.001，＊＊＊＊p＜0.0001。在超过lo45％时，与经μdys2处理的小鼠相比：^^^p＜0.001，^^^^p＜0.0001。在超过lo45％时，与经μdys7处理的小鼠相比：图6是显示经全身测试的新μdys构建体在骨骼肌中不诱导环状纤维(ringbinden)表型的一系列显微照图。在14日龄时向对营养不良型mdx4cv小鼠眶后注射1×1013个vg。在处理后6个月，针对肌养蛋白、dapi和α-肌节肌动蛋白对腓肠肌肌肉的横切面进行免疫染色。由野生型小鼠(图“a”)和经μdysh3(图“b”)、μdys1(图“c”)、μdys2(图“d”)、μdys5(图“e”)、μdys6(图“f”)、μdys7(图“g”)处理的mdx4cv小鼠或未经处理的mdx4cv小鼠(图“h”)的群组示出了一个代表性断面。还将来自mdx4cv情况下表达δr4-r23/δct的转基因小鼠(参见harper，s.q.，等，naturemedicine8，253-261，(2002))的腓肠肌(图“i”)免疫染色作为阳性对照。箭头标记肌纤维周围的环状纤维形成的实例.比例尺，50μm。图7示出了如本文中公开的新微小肌养蛋白构建体的一些实施方案的蛋白质结构图.上面的蛋白质结构图是示出了许多已知功能性结构域的全长肌养蛋白：nt，氨基末端肌动蛋白结合结构域；h，铰链；r，血影蛋白样重复；nnosbd，神经元型一氧化氮合酶结合域；cr，富含半胱氨酸的结构域；ct，羧基末端结构域；dgbd，肌养蛋白聚糖结合结构域；syn，互养蛋白结合结构域；dbbd，小肌营养蛋白结合结构域；以及未标记区域标记r15与r16之间的20个氨基酸.ww结构域在铰链4中。左侧示出了微小肌养蛋白的蛋白质结构，其中蛋白质结构图的左侧为指定名称，并且示意图的右侧列出了结构域结构。图8是示出了对于未经处理(un；n＝s)相对于低(l；n＝3)或高(h；n＝3)aav6-l48q剂量在2周(左)和3周(右)时的左心室(leftventricle，lv)射血分数的两个图。图9是注射有aav6-l48qctnc的小鼠心脏组织(左)和未经注射对照(右)的抗ctncwestern印迹，如所示。图10a是r1的western印迹，其中以gapdh作为上样对照。图10b是r2的western印迹，其中以gapdh作为上样对照。图10c是示出了经转染的心肌细胞的hplc[datp]的图。图11是两个图。左图示出了r1r2过表达小鼠相对于对照同窝出生小鼠(littermate)的百分比缩短分数(fractionalshortening，fs)提高。右图示出了r1r2过表达小鼠相对于对照同窝出生小鼠的左心室内径(leftventricularinnerdiameter，lvid)变化。d-舒张期，s-收缩期。图12a用atp和datp示出了小鼠主动脉平滑肌收缩描记线。图12b是示出了图12a中数据概述的图。图13a示出了r1和r2的western印迹。图13b示出了作为图13a中western印迹的上样对照的α-微管蛋白。图14示出了注射有raav6-r1r2ctnt455(4.5×1013个)的小鼠和对照小鼠的骨骼肌、肺和心脏中r1和r2亚基的表达水平的初步western印迹证据(图“a”)。图14还提供了20个月后来自未经注射小鼠(图“b”)相对于注射有aav6-碱性磷酸酶的小鼠(图“c”)(参见rafael，j.a.，等，thejournalofcellbiology134，93-102(1996))的心脏组织的数据，表明aav6-r1r2ctnt455可提供稳定的长期r1r2过表达。图15是示出了在约10倍范围内向3月龄小鼠(n＝6/组)中全身注射1.5×1013、4.5×1013和1.35×1014个raav6-r1r2ctnt455载体基因组或盐水(对照)对lv功能的作用的图。图16是这样的两个图：其示出了与未经处理的梗死大鼠和未经处理的假手术大鼠相比如通过超声心动描记术测量的在梗死后第五天给予直接raav6-r1r2心脏注射的大鼠的缩短分数变化。图17是示出了图16中评估的大鼠心脏的体外neely工作心脏测量结果的图。y轴上的功率以g·cm/分钟的单位给出。观察到已梗死心脏的前负荷响应性丧失(心力衰竭)(未处理)以及接受载体的梗死心脏的前负荷响应性恢复至对照未梗死心脏的水平，从而证明心脏功能的恢复.图18示出了基于缺失假定具有相对低活性的序列的人ctnt(enh+启动子)调节盒的微型化。图19示出了相对于天然人ctnt增强子/启动子的图18缺失的转录测试；320bp形式保留约95％的活性。图20示出了与天然增强子/启动子(320bp形式)和鸡ctnt启动子/增强子相比通过添加第二微型化增强子的人ctnt455的活性提高(参见americanjournalofphysiology-cellphysiology280，c556-c564(2004))。图21是肌养蛋白血影蛋白样重复的结构以及与铰链结构域的并置的一系列示意图。左上方，示出了单独血影蛋白样重复的相互交叉折叠以显示3个相邻的重复可如何折叠在一起，其中突出显示了不同的α螺旋区段(a、b、c，a’、b’、c’，和a”、b”、c”表示三个不同血影蛋白样重复的螺旋结构域)。右上方，在天然肌养蛋白和肌营养相关蛋白(utrophin)中，一些血影蛋白样重复被铰链结构域隔开，其破坏相邻血影蛋白样重复的正常相互交叉折叠。右上方示出了血影蛋白样重复18、19和20的折叠模式及其通过铰链3的隔开。中间左侧，当将血影蛋白样重复结构域以保持正常折叠模式的方式布置时，经优化的微型肌养蛋白和微小肌养蛋白通常表现出最大功能活性；当微型肌养蛋白或微小肌养蛋白的蛋白质中存在血影蛋白样重复的非整合单元时，例如当贝克肌营养不良患者中出现移除全部外显子的天然存在缺失时，这种正常折叠被破坏。在中间右侧的示意图中示出了这后一种情况，其表示来自具有移除外显子17-48之基因组缺失的患者的肌养蛋白的连接结构域的预测结构。底部示意图示出了μdysh2(左)和μdysh3(右)蛋白中预测的折叠模式，并且还示出了微型化肌养蛋白蛋白质的功能活性的不可预知性质。虽然μdysh2和μdysh3具有类似的折叠模式，但是当在mdx小鼠骨骼肌中表达时，μdysh2导致环状纤维，而μdysh3不导致环状纤维(参见banks，g.b.，等，plosgenetics6，e1000958，(2010))。图22是使用抗肌养蛋白抗体针对肌养蛋白表达染色的mdx4cv小鼠肌肉冷冻切片的图像。发明详述本公开内容的特征在于用于治疗迪谢内肌营养不良(dmd)的组合物和方法.更特别地，本公开内容涉及用于产生用于治疗患有肌营养不良、dmd、肌肉减少、心力衰竭和/或恶病质的对象的微型肌养蛋白(mini-dystrophin)蛋白质的方法。如以下详细描述的，本公开内容至少部分地基于以下出乎意料的发现：包含来自肌养蛋白蛋白质的蛋白质结构域的特定组合的微型肌养蛋白蛋白质(例如，包含n末端结构域、h1结构域、sr1结构域、sr16结构域、sr17结构域、sr23结构域、sr24结构域、h4结构域和cr结构域的微型肌养蛋白蛋白质)能够将肌养蛋白功能恢复至足以治疗肌营养不良、dmd、肌肉减少、心力衰竭和/或恶病质的水平.迪谢内肌营养不良(dmd)是隐性遗传的肌消耗性病症，其影响约1/3500的男性。dmd患者在肌养蛋白基因中携带导致肌养蛋白蛋白质表达异常或缺失的突变。dmd患者经历骨骼肌的进行性消耗和心脏功能障碍，导致主要由于心脏或呼吸衰竭的步行丧失和过早死亡。目前可用的治疗通常只能减缓dmd的病理状况(参见emery，a.e.h.和muntoni，f.，duchennemusculardystrophy，第三版(oxforduniversitypress，2003))。已通过直接靶向一类突变(如用外显子跳读)或用病毒载体介导的递送替代突变基因在营养不良型动物模型中证实了dmd的基因治疗方法(参见koo，t.和wood，m.j.humangenetherapy24，(2013)；benedetti，s.，等，thefebsjournal280，4263-4280，(2013)；以及seto，j.t.，等，currentgenetherapy12，139-151(2012))。重组腺相关病毒(raav)载体是用于基因治疗的潜在载体，已在dmd和肢带型肌营养不良二者的临床试验中对其进行了测试(参见mendell，j.r.，等，thenewenglandjournalofmedicine363，1429-1437，(2010)；mendell，j.r.，等，annalsofneurology68，629-638(2010)；以及herson，s.，等，brain：ajournalofneurology135，483-492，(2012)).腺相关病毒(aav)的几种血清型证实了对横纹肌的高度向性(参见seto，j.t.，等，currentgenetherapy12，139-151(2012))。设计和测试新一代dmd治疗构建体的临床前研究可受到单链raav载体基因组约4.9kb大小的限制(参见dong，b.，等，moleculartherapy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy18，87-92，(2010)；以及wu，z.，等，moleculartherapy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy18，80-86，(2010))。将肌养蛋白的肌肉特异性同种型的整个约13.9kbcdna包装到单个raav衣壳中是无法实现的，因此，可使用肌养蛋白cdna的肌肉特异性同种型的微型化合成形式。尽管已证实了两个和三个raav载体基因组的体内重组递送微型肌养蛋白或全长肌养蛋白编码序列(参见odom，g.l.，等，moleculartherapy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy19，36-45，(2011)；lostal，w.，等，humangenetherapy，(2014)；以及koo，t.，等，humangenetherapy25，98-108，(2014))，但是递送多个载体用于重构全长肌养蛋白的效率可以是非最优的，并且可提高递送载体所需的病毒衣壳蛋白的总剂量。然而，已使用部分基于在携带该基因中框内缺失的轻度贝克肌营养不良患者中表达的mrna的合理设计的肌养蛋白cdna微型形式实现有益的raav介导的基因治疗(参见beggs，a.h.，等，americanjournalofhumangenetics49，54-67(1991)；koenig，m.，等，americanjournalofhumangenetics45，498-506(1989)；goldberg，l.r.，等，annalsofneurology44，971-976，(1998)；以及england，s.b.，等，nature343，180-182(1990))。表达多种肌养蛋白截短体的转基因和经载体处理营养不良型小鼠的研究已鉴定到可能存在于功能性微小肌养蛋白(μdys)中的数个肌养蛋白基因元件(参见harper，s.q.，等，naturemedicine8，253-261，(2002))。肌养蛋白的全长横纹肌同种型可在传递收缩力通过肌膜并传出到细胞外基质中发挥作用。除维持细胞内细胞骨架与膜结合肌养蛋白糖蛋白复合物(dgc)之间的机械连接之外，肌养蛋白还可以是信号传导蛋白的支架(参见ozawa，e.myology(franzini-armstrongcengela编辑)455-470(mcgraw-hill，2004)；winder，s.j.journalofmuscleresearchandcellmotility18，617-629(1997)；以及campbell，k.p.和kahl，s.d.nature338，259-262，(1989))。肌养蛋白的氨基末端结构域可与细胞内细胞骨架的f-肌动蛋白丝结合(参见way，m.，等，febsletters301，243-245(1992)；hemmings，l.，等，thejournalofcellbiology116，1369-1380(1992)；fabbrizio，e.，等，biochemistry32，10457-10463(1993)；以及pavalko，f.m.和otey，c.a.proceedingsofthesocietyforexperimentalbiologyandmedicine205，282-293(1994))。中间的棒状结构域是最大的并且由侧接且穿插有至少4个铰链子结构域的24个血影蛋白样重复(sr)构成。棒状结构域可赋予肌养蛋白以弹性和柔性以在肌肉收缩期间维持肌膜的完整性(参见winder，s.j.journalofmuscleresearchandcellmotility18，617-629(1997))。多个sr提供可用作细胞内细胞骨架、肌膜以及dgc成员的另一些结合位点的独特区域(参见rybakova，i.n.，等，thejournalofcellbiology135，661-672(1996)；warner，l.e.，等，humanmoleculargenetics11，1095-1105(2002)；metzinger，l.，等，humanmoleculargenetics6，1185-1191(1997)；lai，y.，等，thejournalofclinicalinvestigation119，624-635，(2009)).特别地，富含半胱氨酸的结构域和相邻的铰链4区域形成p-肌养蛋白聚糖结合结构域(dgbd)(参见blake，d.j.，等，physiologicalreviews82，291-329，(2002)；ishikawa-sakurai，m.，等，humanmoleculargenetics13，693-702，(2004))，而羧基末端结构域是另一些dgc组分的支架(参见abmayrs，molecularmechanismsofmusculardystrophies(winder，s.j.编辑)14-34(landesbiosciences，2006))。具有部分功能性的微小肌养蛋白可通过保护肌膜免受收缩引起的损伤和提高产生力的能力来改善横纹肌中的营养不良病理状况.这些参数可通过经由氨基末端结构域和dgbd与f-肌动蛋白丝和p-肌养蛋白聚糖结合来实现(参见harper，s.q.，等，naturemedicine8，253-261，(2002)；warner，l.e.，等，humanmoleculargenetics11，1095-1105(2002)；cox，g.a.，等，naturegenetics8，333-339，(1994)；greenberg，d.s.，等，naturegenetics8，340-344，(1994)；gardner，k.l.，等，genetherapy13，744-751，(2006)；corrado，k.，等，thejournalofcellbiology134，873-884(1996)；以及rafael，j.a.，等，thejournalofcellbiology134，93-102(1996))。不受任何一种特定理论的约束，先前的研究表明，这两个结构域必须通过来自中央棒状结构域的至少四个sr连接，但是存在多种可构建含有至少四个sr的微型化肌养蛋白的方式。虽然已表明一些sr组合改善营养不良病理生理状况，但是另一些组合未产生具有显著功能性能力的蛋白质(参见harper，s.q.，等，naturemedicine8，253-261，(2002)；以及abmayrs，molecularmechanismsofmusculardystrophies(winder，s.j.编辑)14-34(landesbiosciences，2006))。在μdys设计中选择特定的sr可将另外的dgc组分恢复至肌膜。神经元型一氧化氮合酶(nnos)是可响应于肌肉收缩活动而参与血管舒张的信号传导蛋白(参见stamler，j.s.和meissner，g.physiologicalreviews81，209-237(2001)；brenman，j.e.，等，cell82，743-752(1995)；kobayashi，y.m.，等，nature456，511-515，(2008)；以及torelli，s.，等，neuropathologyandappliedneurobiology30，540-545，(2004))，并且sr16和17的存在可参与nnos与dgc的适当联系(参见28lai，y.等，thejournalofclinicalinvestigation119，624-635，(2009)；以及lai，y.，等，proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica110，525-530，(2013))。血影蛋白样重复20至24以及铰链4中的序列可在肌养蛋白与微管的适当联系中起作用，这对于在骨骼肌中维持细胞内结构和转矩产生是重要的(参见prins，k.w.等，thejournalofcellbiology186，363-369，(2009)；以及belanto，j.j.，等，proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica111，5723-5728，(2014))。尽管如此，已发现羧基末端结构域和大部分sr结构域是非必要的且不会严重损害横纹肌的健康(参见mccabe，e.r.，等，thejournalofclinicalinvestigation83，95-99，(1989)；crawford，g.e.，等，thejournalofcellbiology150，1399-1410(2000)；以及dunckley，m.g.，等，febsletters296，128-134(1992))。迄今测试的几种最佳微小肌养蛋白可保护肌肉免受收缩引起的损伤并在一定程度上但一般不是全部恢复dmd的营养不良型小鼠和犬模型的比产力能力(参见seto，j.t.，等，currentgenetherapy12，139-151(2012)；以及wang，z.，等，frontiersinmicrobiology2，201，(2011))。携带不同sr组合和铰链的其他微小肌养蛋白在营养不良肌肉中不能很好地发挥作用，并且功能差异的原因尚不清楚。然而，不受任何一种特定理论的约束，其可能涉及对微小肌养蛋白的弹性、折叠、稳定性以及在没有空间位阻的情况下组装dgc子部分之能力的影响。本公开内容一般性地涉及微小肌养蛋白。微小肌养蛋白可与调节盒有效连接。本公开内容还涉及治疗患有肌营养不良、肌肉减少、心力衰竭或恶病质的对象的方法。此外，本公开内容涉及预防性治疗处于发生肌营养不良、肌肉减少、心力衰竭或恶病质之风险中的对象的方法。用于治疗患有或处于发生肌营养不良、肌肉减少、心力衰竭或恶病质之风险中的对象的方法可包括向所述对象施用包含微小肌养蛋白基因和递送载剂的药物组合物.将容易理解，如本文中一般描述的实施方案是示例性的。多个实施方案的以下更详细的描述并不旨在限制本公开内容的范围，而仅是多个实施方案的代表.此外，在不脱离本公开内容的范围的情况下，本领域技术人员可改变本文中公开的方法的步骤或操作的顺序。换言之，除非为了实施方案的适当操作需要特定的步骤或操作顺序，否则可改变特定步骤或操作的顺序或使用。除非另外具体定义，否则本文中使用的技术术语具有其在本领域中理解的通常含义。为清楚起见，用实例具体定义以下术语。本文中使用的“肽”和“多肽”可以以其最广泛的意义使用来指代亚基氨基酸的序列.本公开内容的肽或多肽可包含l-氨基酸、d-氨基酸(其在体内可对l-氨基酸特异性蛋白酶具有抗性)或d-和l-氨基酸的组合。术语肽和多肽可互换使用。本文中描述的肽和多肽可以是化学合成的或重组表达的。肽和多肽可与被认为可用于给定目的的任何其他部分连接。如本领域技术人员所理解的，这样的连接可包括共价连接或非共价连接。本文中公开的氨基酸残基可通过保守替换来修饰以维持或基本上维持整体多肽结构和/或功能。本文中使用的“保守氨基酸替换”表示：疏水性氨基酸(即，ala、cys、gly、pro、met、val、ile和leu)可被其他疏水性氨基酸替换；具有大侧链的疏水性氨基酸(即，phe、tyr和trp)可被其他具有大侧链的疏水性氨基酸替换；具有带正电荷侧链的氨基酸(即，arg、his和lys)可被其他具有带正电荷侧链的氨基酸替换；具有带负电荷侧链的氨基酸(即，asp和glu)可被其他具有带负电荷侧链的氨基酸替换；以及具有极性不带电荷侧链的氨基酸(即，ser、thr、asn和gln)可被其他具有极性不带电荷侧链的氨基酸替换。治疗对象可包括向对象(例如，患者)递送有效量或者递送预防性治疗和/或治疗性治疗。“有效量”是可在对象中引起期望生理变化的化合物的量。有效量也可为研究目的而施用。“预防性治疗”包括施用于未表现出疾病或病症之体征或症状的对象或者仅表现出疾病或病症之早期体征或症状的对象的治疗，使得治疗是为了减小、预防和/或降低进一步发生疾病或病症的风险或者减小、预防和/或降低发生疾病或病症的风险而施用。因此，预防性治疗可用作针对疾病或病症的预防性治疗。“治疗性治疗”包括施用于表现出疾病或病症的症状或体征的对象的治疗，并且治疗性治疗是为了减少或消除疾病或病症的症状或体征而向对象施用.“治疗有效量”包括提供预防性治疗和/或治疗性治疗的量。治疗有效量不需要完全预防或治愈疾病或病症，但是还可提供部分益处，例如延迟疾病或病症的发生或者缓解或改善疾病或病症的至少一种症状。对于施用，可基于来自体外测定和/或动物模型研究的结果来初步估计有效量和治疗有效量(在本文中也被称为剂量)。例如，可在动物模型中配制剂量以获得包括如在细胞培养物中确定的ic50的循环浓度范围.这样的信息可用于更准确地确定目的对象中的可用剂量。施用于具体对象的实际剂量可由医师、兽医或研究者考虑例如但不限于物理和生理因素的参数来确定，所述因素包括体重、病症严重程度、疾病类型、先前或同时的治疗性干预、对象的特发病和/或施用途径。剂量的范围可以是1×108个载体基因组/kg(vg/kg)至1×1015vg/kg、1×109vg/kg至1×1014vg/kg、1×1010vg/kg至1×1013vg/kg、或1×1011vg/kg至1×1012vg/kg。在另一些非限制性实例中，剂量可包括约1×108vg/kg、约1×109vg/kg、约1×1010vg/kg、约1×1011vg/kg、约1×1012vg/kg、约1×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、或约1×1015vg/kg。治疗有效量可通过在治疗方案过程(即几天、几周、几个月等)期间施用单剂量或多剂量来实现。也可使用本文中公开的化合物的可药用盐、互变异构体和异构体.示例性盐可包括但不限于：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、苯磺酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate)、糖酸盐(saccharate)、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(pamoate)(即，1，1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。本文中描述的制剂可通过但不限于注射、输液、灌注、吸入、灌洗和/或摄入来施用。施用途径可包括但不限于：静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、经表面、瘤内、肌内、囊内、心包内、脐内、眼内、经黏膜、经口、皮下和/或结膜下。在另一些非限制性实例中，施用可通过肌内注射、血管内注射、腹膜内注射或适用于向肌肉组织递送载体的任何其他方法来进行。在一些实施方案中，为了注射，制剂可例如在缓冲剂中被制成水溶液，所述缓冲剂包括但不限于hanks溶液、林格液和/或生理盐水。溶液剂可含有配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，制剂可以是冻干和/或粉末形式，其用于在使用前用合适的载剂对照(例如，无菌无热原水)重构。无论是用于研究性、预防性和/或治疗性治疗，本文中公开的任何制剂都可有利地包含任何其他可药用载体或者含有不产生可能超过施用益处的明显不利反应、变态反应或其他不期望反应的那些的载体。示例性的可药用载体和制剂在remington’spharmaceuticalsciences，第18版，mackprintingcompany，1990中进行了公开，其有关这一方面的教导通过引用并入本文。此外，可制备制剂以满足美国fda生物标准和质量控制部门(unitedstatesfda’sdivisionofbiologicalstandardsandqualitycontrol)和/或其他相关的美国和外国监管机构要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。示例性的常用可药用载体可包括但不限于：填充剂(bulkingagent)或填料、溶剂或潜溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸和维生素e)、防腐剂、等张剂、吸收延迟剂、盐、稳定剂、缓冲剂、螯合剂(例如，edta)、凝胶、黏合剂、崩解剂和/或润滑剂。示例性缓冲剂可包括但不限于：柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。示例性防腐剂可包括但不限于：酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵、氯化六烃季铵、对羟基苯甲酸烷基酯(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和/或3-戊醇。示例性等张剂可包括多羟基糖醇，其包括但不限于三羟基或更高级糖醇(例如，甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和/或甘露糖醇)。示例性稳定剂可包括但不限于：有机糖、多羟基糖醇、聚乙二醇、含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水性聚合物和/或多糖.制剂也可以是贮库(depot)制剂。在一些实施方案中，这样的长效制剂可通过但不限于植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，化合物可与合适的聚合物和/或疏水性材料(例如，配制为在可接受油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制或者作为微溶性衍生物(例如，作为微溶性盐)配制。此外，在多个实施方案中，可使用持续释放系统(例如包含至少一种化合物的固体聚合物的半透性基质)来递送化合物。已建立了多种缓释材料并且其是本领域普通技术人员公知的。缓释胶囊剂根据其化学性质可在施用后释放化合物数周多至超过100天。基因治疗方法可用于将特定蛋白质递送(例如，以持续水平)到患者或对象中.这些方法允许从业者将编码目的基因的dna直接引入到患者或对象中(体内基因治疗)或者引入到从患者、对象或供体分离的细胞中(离体基因治疗)。引入的dna随后指导患者或对象的自身细胞或移植细胞以产生期望的蛋白质产物。因此，基因递送可避免每日注射的需要.基因治疗还可允许从业者选择特定的器官或细胞靶标(例如，肌肉、肝、血细胞、脑细胞等)用于治疗。可以以数种方式将dna引入到对象的细胞中。有转染法，其包括化学法，例如磷酸钙沉淀和脂质体介导的转染；以及物理法，例如电穿孔。通常来说，转染法适用于体内基因递送。还有使用重组病毒的方法。现有的病毒介导的基因递送方法包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒和腺相关病毒(aav)载体。已经用于基因递送的一种病毒系统是腺相关病毒(aav)。aav是属于依赖细小病毒属(genusdependoparvovirus)的细小病毒。aav具有数种在其他病毒中未发现的有吸引力的特征.第一，aav可感染广泛范围的宿主细胞，包括未分裂的细胞.第二，aav可感染来自不同物种的细胞。第三，aav不与任何人或动物疾病相关并且显示在整合之后不改变宿主细胞的生物特性。事实上，据估计，人群中的80％至85％已经暴露于该病毒。最后，aav在广泛范围的物理和化学条件下是稳定的，这使其自身适于生产、储存和运输要求。aav基因组是包含4681个核苷酸的线性的单链dna分子。aav基因组通常包含在每个末端以反向末端重复(invertedterminalrepeat，itr)为侧翼的内部非重复基因组。itr的长度为大约145个碱基对(bp)。itr具有多种功能，包括作为dna复制的起点和作为病毒基因组的包装信号。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放可读框，其已知是aav复制(rep)和衣壳(cap)基因。rep和cap基因编码允许病毒复制和将病毒基因组包装到病毒粒体中的病毒蛋白质。特别地，至少四种病毒蛋白质的家族是由aavrep区表达的，根据其表观分子量命名为rep78、rep68、rep52和rep40.aavcap区编码至少三种蛋白质：vp1、vp2和vp3。aav是辅助依赖性病毒，即，其需要与辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒)共感染以形成aav病毒粒体。在不存在与辅助病毒的共感染下，aav建立潜伏状态，其中病毒基因组插入到宿主细胞的染色体中但不产生感染性病毒粒体。通过辅助病毒的后续感染“拯救”整合的基因组，允许其复制并将其基因组包装到感染性aav病毒粒体中。尽管aav可感染来自不同物种的细胞，但是辅助病毒必须与宿主细胞属于同一物种.因此，例如，人aav在经与犬腺病毒共感染的犬细胞中复制。“基因转移”或“基因递送”包括用于将外源dna插入到宿主细胞中的方法或系统。基因转移可导致未整合的经转移dna瞬时表达、染色体外复制和经转移的复制子(例如，附加体)表达，或者经转移的遗传物质整合到宿主细胞的基因组dna中。“载体”包含当与合适控制元件相连时能够复制并且可在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，例如但不限于：质粒、噬菌体、转座子、黏粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒体等.因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。“aav载体”包含来源于腺相关病毒血清型的载体，其包括但不限于：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8和aav9。aav载体可全部或部分地缺失一个或更多个aav野生型基因，例如rep和/或cap基因，但是保留功能性侧翼itr序列。功能性itr序列是拯救、复制和包装aav病毒粒体所必需的。因此，在本文中aav载体被限定为至少包含用于复制和包装病毒顺式所需的那些序列(例如，功能性itr)。itr不必是野生型核苷酸序列，并且可例如通过核苷酸的插入、缺失或置换而被改变，只要该序列提供功能性拯救、复制和包装即可。“重组aav载体”或“raav载体”包含感染性的复制缺陷型病毒，其由封装有在两侧以aavitr为侧翼的异源目的核苷酸序列的aav蛋白外壳构成。raav载体在包含aav载体、aav辅助功能和附属功能的合适的宿主细胞中产生。通过这种方式，使宿主细胞能够编码将aav载体(包含重组目的核苷酸序列)包装到用于随后基因递送的感染性重组病毒粒体颗粒中所需的aav多肽。本公开内容的第一方面涉及包含编码蛋白质的微小肌养蛋白基因的核苷酸序列。所述核苷酸序列还可包含调节盒。此外，核苷酸序列可以是分离的和/或纯化的。在一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含氨基末端肌动蛋白结合结构域、肌养蛋白聚糖结合结构域和/或血影蛋白样重复结构域。血影蛋白样重复结构域可包含至少四个血影蛋白样重复或至少四个血影蛋白样重复的部分。至少四个血影蛋白样重复中的两个可包含神经元型一氧化氮合酶结合结构域。换句话说，至少四个血影蛋白样重复可包含血影蛋白样重复16和17，或其一部分.在一些实施方案中，至少四个血影蛋白样重复可包括血影蛋白样重复1和24，或其一部分。在一些替选实施方案中，至少四个血影蛋白样重复可包含其他合适的血影蛋白样重复或其一部分(例如，血影蛋白样重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22和/或23)。在某些实施方案中，血影蛋白样重复结构域可包含4、5、6、7、8个或更多个血影蛋白样重复，或者其一部分。在某些其他实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含5个血影蛋白样重复至8个血影蛋白样重复(例如，5、6、7或8个血影蛋白样重复)。在某些其他实施方案中，血影蛋白样重复域可包含其他合适数量的血影蛋白样重复或其一部分。在一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质还可包含铰链结构域或其一部分。例如，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含选自以下至少一种的铰链结构域的至少一部分：铰链1结构域、铰链2结构域、铰链3结构域、铰链4结构域和/或铰链样结构域(例如由在血影蛋白样重复15下游的序列(seqidno：20)和在血影蛋白样重复23内的序列(seqidno：21)编码的铰链样结构域).在多个实施方案中，微小肌养蛋白基因可包含seqidno：16的核酸序列的一部分。在多个其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：16的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在多个其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：16的核酸序列具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含seqidno：4的氨基酸序列的一部分。在另一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：4的氨基酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性.在另一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：4的氨基酸序列具有100％的序列同一性。在某些实施方案中，微小肌养蛋白基因可包含seqidno：18的核酸序列的一部分。在某些其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：18的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在多个其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：18的核酸序列具有100％的序列同一性。在多个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含seqidno：5的氨基酸序列的一部分。在多个其他实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：5的氨基酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在多个其他实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：5的氨基酸序列具有100％的序列同一性。此外，微小肌养蛋白基因可包含seqidno：11至18中一种或更多种核酸序列的一部分.在某些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含seqidno：3至10中一种或更多种氨基酸序列的一部分。在某些其他实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含图7的蛋白质结构图中所示的一种或更多种蛋白质(例如，μdysh3和μdys1至μdys16)的一部分。在一些实施方案中，调节盒可选自以下至少一种：ck8启动子、心肌肌钙蛋白t(ctnt)启动子和/或其他合适的调节盒。在某些实施方案中，调节盒可以是ck8启动子并且ck8启动子可包含seqidno：19的核酸序列的一部分。在某些其他实施方案中，调节盒可以是ck8启动子并且ck8启动子可至少与seqidno：19的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在某些其他实施方案中，调节盒可以是ck8启动子并且ck8启动子可与seqidno：19的核酸序列具有100％的序列同一性。在多个实施方案中，调节盒可以是ctnt启动子并且ctnt启动子可包含seqidno：1的核酸序列的一部分。在多个其他实施方案中，调节盒可以是ctnt启动子并且ctnt启动子可至少与seqidno：1的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性.在多个其他实施方案中，调节盒可以是ctnt启动子并且ctnt启动子可与seqidno：1的核酸序列具有100％的序列同一性。本公开内容的另一个方面涉及包含如以上讨论的核苷酸序列的药物组合物.在一些实施方案中，药物组合物还可包含递送载剂。例如，药物组合物可包含含有调节盒和编码蛋白质的微小肌养蛋白基因的核苷酸序列，并且药物组合物还可包含递送载剂。药物组合物的核苷酸序列可以是分离和纯化的核苷酸序列。在多个实施方案中，递送载剂可包含腺相关病毒(aav)载体或重组腺相关病毒(raav)载体。aav载体可以是血清型6aav(aav6)。同样地，raav载体可以是血清型6raav(raav6)。aav载体可以是血清型8aav(aav8)。同样地，raav载体可以是血清型8raav(raav8)。aav载体可以是血清型9aav(aav9)。同样地，raav载体可以是血清型9raav(raav9).raav载体可由经来源于aav血清型6的衣壳蛋白假型化的aav2基因组反向末端重复(itr)序列构成(raav2/6).aav或raav的其他合适的血清型也在本公开内容的范围内。在一些实施方案中，如以上讨论的，递送载剂可表达或配置成表达微小肌养蛋白基因。在多个实施方案中，微小肌养蛋白基因可包含seqidno：16的核酸序列的一部分。在多个其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：16的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在多个其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：16的核酸序列具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含seqidno：4的氨基酸序列的一部分。在另一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：4的氨基酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在另一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：4的氨基酸序列具有100％的序列同一性。在某些实施方案中，微小肌养蛋白基因可包含seqidno：18的核酸序列的一部分。在某些其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：18的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。在某些其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：18的核酸序列具有100％的序列同一性。在多个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含seqidno：5的氨基酸序列的一部分。在多个其他实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：5的氨基酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在多个其他实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：5的氨基酸序列具有100％的序列同一性。此外，如以上讨论的，调节盒可选自以下至少一种：ck8启动子、心肌肌钙蛋白t(ctnt)启动子和/或其他合适的调节盒。在某些实施方案中，调节盒可以是ck8启动子并且ck8启动子可包含seqidno：19的核酸序列的一部分.在某些其他实施方案中，调节盒可以是ck8启动子并且ck8启动子可与seqidno：19的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在某些其他实施方案中，调节盒可以是ck8启动子并且ck8启动子可与seqidno：19的核酸序列具有100％的序列同一性。在多个实施方案中，调节盒可以是ctnt启动子并且ctnt启动子可包含seqidno：1的核酸序列的一部分。在多个其他实施方案中，调节盒可以是ctnt启动子并且ctnt启动子可至少与seqidno：1的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在多个其他实施方案中，调节盒可以是ctnt启动子并且ctnt启动子可与seqidno：1的核酸序列具有100％的序列同一性.在一些实施方案中，药物组合物可配置成降低肌营养不良的病理影响或症状。肌营养不良可选自以下至少一种：强直性肌营养不良、迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面-肩-肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、埃-德肌营养不良和/或其他合适的肌营养不良.在另一些实施方案中，药物组合物可配置成降低选自迪谢内肌营养不良和/或贝克肌营养不良中至少一种的肌营养不良的病理影响或症状。在某些实施方案中，药物组合物可配置成降低肌肉减少、心脏病和/或恶病质中至少一种的病理影响或症状。本公开内容的另一个方面涉及用于治疗患有肌营养不良、肌肉减少、心脏病和/或恶病质的对象的方法。所述方法可包括向对象施用包含与调节盒连接的微小肌养蛋白基因的药物组合物。所述方法可包括向对象施用治疗有效量的药物组合物。此外，微小肌养蛋白基因可与调节盒可操作地连接。在一些实施方案中，所述方法可包括向对象施用药物组合物，其中药物组合物还包含aav载体、raav载体和/或其他合适的递送载剂。递送载剂可在对象中表达或配置成在对象中表达微小肌养蛋白基因。如以上讨论的，在多个实施方案中，微小肌养蛋白基因可包含seqidno：16的核酸序列的一部分。在多个其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：16的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在多个其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：16的核酸序列具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含seqidno：4的氨基酸序列的一部分.在另一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：4的氨基酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性.在另一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：4的氨基酸序列具有100％的序列同一性。在某些实施方案中，微小肌养蛋白基因可包含seqidno：18的核酸序列的一部分。在某些其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：18的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在某些其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可与seqidno：18的核酸序列具有100％的序列同一性。在多个实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可包含seqidno：5的氨基酸序列的一部分.在多个其他实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：5的氨基酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性.在多个其他实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质可与seqidno：5的氨基酸序列具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，调节盒可表达或配置成表达微小肌养蛋白基因，使得微小肌养蛋白基因在横纹肌细胞中的表达水平是微小肌养蛋白基因在非肌细胞中表达水平的至少100倍高。例如，微小肌养蛋白基因在对象横纹肌细胞中的表达水平可以是对象肺细胞中的至少100倍高。在另一些实施方案中，调节盒可表达或配置成表达微小肌养蛋白基因，使得微小肌养蛋白基因在横纹肌细胞中的表达水平是微小肌养蛋白基因在非肌细胞中表达水平的至少50倍高至150倍高、至少75倍高至125倍高、或至少90倍高至110倍高。如以上讨论的，调节盒可选自以下至少一种：ck8启动子、心肌肌钙蛋白t(ctnt)启动子和/或其他合适的调节盒。在某些实施方案中，调节盒可以是ck8启动子并且ck8启动子可包含seqidno：19的核酸序列的一部分。在某些其他实施方案中，调节盒可以是ck8启动子并且ck8启动子可与seqidno：19的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在某些其他实施方案中，调节盒可以是ck8启动子并且ck8启动子可与seqidno：19的核酸序列具有100％序列同一性。在多个实施方案中，调节盒可以是ctnt启动子并且ctnt启动子可包含seqidno：1的核酸序列的一部分。在多个其他实施方案中，调节盒可以是ctnt启动子并且ctnt启动子可至少与seqidno：1的核酸序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在多个其他实施方案中，调节盒可以是ctnt启动子并且ctnt启动子可与seqidno：1的核酸序列具有100％的序列同一性。在一些实施方案中，微小肌养蛋白基因可在对象的一种或更多种肌肉中表达或者配置成在其中表达微小肌养蛋白蛋白质，使得一种或更多种肌肉的收缩性增强或提高。在某些实施方案中，微小肌养蛋白基因可在对象的一种或更多种骨骼肌中表达或者配置成在其中表达微小肌养蛋白蛋白质，使得一种或更多种骨骼肌中至少一种的比产力能力增强或提高至正常比产力能力的至少10％、至少20％、至少30％或至少40％以内.在某些其他实施方案中，微小肌养蛋白基因可在对象的一种或更多种心肌中表达或者配置成在其中表达微小肌养蛋白蛋白质，使得基线舒张期末容积缺陷恢复至正常舒张期末容积的至少10％、至少20％、至少30％或至少40％以内。在多个实施方案中，微小肌养蛋白基因可表达或配置成表达微小肌养蛋白蛋白质，使得在对象中神经元型一氧化氮合酶向肌养蛋白-糖蛋白复合物的定位增强或提高。在一些实施方案中，如以上讨论的，所述方法可包括治疗患有以下至少一种的对象：强直性肌营养不良、迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面-肩-肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、埃-德肌营养不良和/或其他合适的肌营养不良。在另一些实施方案中，所述方法可包括治疗患有迪谢内肌营养不良和/或贝克肌营养不良中至少一种的对象。在某些实施方案中，药物组合物可降低或配置成降低肌营养不良、肌肉减少、心脏病和/或恶病质的病理影响或症状。肌营养不良的病理影响或症状可选自以下至少一种：肌肉疼痛、肌肉无力、肌肉疲劳、肌肉萎缩、纤维化、炎症、骨骼肌中的平均肌纤维直径增大、心肌病、6分钟步行测试时间缩短、步行丧失、心泵衰竭和/或一种或更多种其他合适的病理影响或症状。肌肉减少的病理影响或症状可选自肌肉消耗和/或肌肉无力中的至少一种。心脏病的病理影响或症状可选自心肌病、血液动力学降低和/或心律失常中的至少一种。恶病质的病理影响或症状可选自肌肉消耗和/或肌肉无力中的至少一种。治疗患有肌营养不良的对象的方法还可包括鉴定患有肌营养不良的对象。类似地，治疗患有肌肉减少、心脏病和/或恶病质的对象的方法还可包括分别鉴定患有肌肉减少、心脏病和/或恶病质的对象。在一些实施方案中，对象可以是哺乳动物。在某些实施方案中，对象可以是人。本公开内容的另一个方面涉及用于预防性治疗处于发生肌营养不良、肌肉减少、心脏病和/或恶病质之风险中的对象的方法。所述方法可包括参照治疗患有肌营养不良、肌肉减少、心脏病和/或恶病质的对象的方法向对象施用如上所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法可包括治疗处于发生以下至少一种之风险中的对象：强直性肌营养不良、迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面-肩-肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良、埃-德肌营养不良和/或其他合适的肌营养不良。在另一些实施方案中，所述方法可包括治疗处于发生迪谢内肌营养不良和/或贝克肌营养不良中至少一种之风险中的对象。在某些实施方案中，药物组合物可降低或配置成降低发生肌营养不良、肌肉减少、心脏病和/或恶病质的病理影响或症状的风险。治疗处于发生肌营养不良、肌肉减少、心脏病和/或恶病质之风险中的对象的方法还可包括分别鉴定处于发生肌营养不良、肌肉减少、心脏病和/或恶病质之风险中的对象。在一些实施方案中，对象可以是哺乳动物。在某些实施方案中，对象可以是人。本公开内容的另一个方面涉及调节盒，其包含增强和/或靶向药物组合物(例如，微小肌养蛋白基因)的表达的增强子和/或启动子.在一些实施方案中，用于增强和/或靶向药物组合物的表达的增强子或启动子可包含基因、肽、多肽和/或调节rna的至少一部分。药物组合物的靶向表达可包括药物组合物在对象的特定细胞类型、组织和/或器官中的表达。例如，ctnt455(seqidno：1)可用于心脏特异性表达。在某些实施方案中，增强子或启动子可表达或配置成表达包含肽的药物组合物。在多个实施方案中，增强子或启动子可在发育、受损和/或患病肌肉(即，可能正进行再生的肌肉)中表达或者配置成在其中表达肽。人ctnt455rc(seqidno：1)可在稳态成熟骨骼肌中无转录活性。如以上讨论的，增强子和/或启动子可与药物组合物有效连接，即用于增强和/或靶向药物组合物的表达。此外，药物组合物可与一个或增强子和/或启动子有效连接。在一些实施方案中，本文中公开的药物组合物的表达可帮助心肌再生。例如，人ctnt455rc(seqidno：1)可增强或靶向药物组合物在受伤和/或再生心肌中的瞬时表达.在一些实施方案中，本文中公开的药物组合物的表达可帮助防止心肌和/或心肌细胞的损失。在某些实施方案中，本文中公开的药物组合物的表达可帮助再生骨骼肌。在多个实施方案中，本文中公开的药物组合物的表达可帮助防止骨骼肌的坏死和/或损耗。本公开内容的另一个方面涉及包含微小肌养蛋白基因的核苷酸序列，其中微小肌养蛋白基因可编码包含至少两个彼此直接连接的血影蛋白样重复的蛋白质。在一些实施方案中，至少两个彼此直接连接的血影蛋白样重复可选自以下至少一种：与血影蛋白样重复2(sr2)直接连接的血影蛋白样重复1(sr1)、与血影蛋白样重复3(sr3)直接连接的sr2、与血影蛋白样重复16(sr16)直接连接的sr1、与血影蛋白样重复23(sr23)直接连接的血影蛋白样重复17(sr17)、与血影蛋白样重复24(sr24)直接连接的sr17和/或与sr24直接连接的sr23。微小肌养蛋白基因还可编码包含氨基末端肌动蛋白结合结构域和/或β-肌养蛋白聚糖结合结构域的蛋白质。本公开内容的另一个方面涉及包含微小肌养蛋白基因的核苷酸序列，其中微小肌养蛋白基因可编码按顺序包含以下的蛋白质：铰链1结构域(h1)、sr1、sr16、sr17、sr24和/或铰链4结构域(h4)。在一些实施方案中，h1可与sr1直接连接.在多个实施方案中，sr1可与sr16直接连接.在某些实施方案中，sr16可与sr17直接连接.在一些实施方案中，sr17可与sr24直接连接。在多个实施方案中，sr24可与h4直接连接。在一些实施方案中，由微小肌养蛋白基因编码的蛋白质还可按顺序包含sr2和sr3，其中sr2和sr3可设置在sr1与sr16之间。此外，sr1可与sr2直接连接并且sr2可进一步与sr3连接。本公开内容的另一个方面涉及包含编码蛋白质的微小肌养蛋白基因的核苷酸序列，其中微小肌养蛋白基因可编码按顺序包含以下的蛋白质：h1、sr1、sr16、sr17、sr23、sr24和/或h4。在一些实施方案中，h1可与sr1直接连接，sr1可与sr16直接连接，sr16可与sr17直接连接，sr17可与sr23直接连接，sr23可与sr24直接连接，和/或sr24可与h4直接连接。本公开内容的另一个方面涉及药物组合物，其可包含含有seqidno：16的核酸序列的微小肌养蛋白基因和腺相关病毒(aav)载体或重组腺相关病毒(raav)载体。在一些实施方案中，aav载体或raav载体的血清型可选自血清型6、血清型8、血清型9或其他合适的血清型中的至少一种。本公开内容的另一个方面涉及药物组合物，其可包含编码蛋白质的微小肌养蛋白基因和aav载体或raav载体，其中所述蛋白质可包含seqidno：4的氨基酸序列。在某些实施方案中，aav载体或raav载体的血清型可选自血清型6、血清型8、血清型9或其他合适的血清型中的至少一种.本公开内容的另一个方面涉及药物组合物，其可包含含有seqidno：18的核酸序列的微小肌养蛋白基因和aav载体或raav载体。在多个实施方案中，aav载体或raav载体的血清型选自血清型6、血清型8、血清型9或其他合适的血清型中的至少一种.本公开内容的另一个方面涉及药物组合物，其可包含编码蛋白质的微小肌养蛋白基因和aav载体或raav载体，其中所述蛋白质可包含seqidno：5的氨基酸序列。在一些实施方案中，aav载体或raav载体的血清型选自血清型6、血清型8、血清型9或其他合适的血清型中的至少一种。本公开内容的另一个方面涉及用于治疗或预防性治疗肌营养不良、肌肉减少、心力衰竭和/或恶病质的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可包含微小肌养蛋白基因.在某些实施方案中，微小肌养蛋白基因可包含seqidno：16或seqidno：18的核酸序列和aav载体或raav载体。在多个实施方案中，aav载体或raav载体的血清型可选自血清型6、血清型8、血清型9或其他合适的血清型中的至少一种。本公开内容的另一个方面涉及用于治疗或预防性治疗肌营养不良、肌肉减少、心力衰竭和/或恶病质的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可包含微小肌养蛋白基因。在某些实施方案中，微小肌养蛋白基因可包含seqidno：16或seqidno：18的核酸序列和aav载体或raav载体。在多个实施方案中，aav载体或raav载体的血清型可选自血清型6、血清型8、血清型9或其他合适的血清型中的至少一种。实施例以下实施例是对所公开方法和组合物进行的举例说明。根据本公开内容，本领域技术人员将认识到，所公开方法和组合物的这些实施例的变化方案及其他实施例也是可能的而无需过度试验。实施例1-微小肌养蛋白的开发为了开发具有改善的性能的微小肌养蛋白，评估了占编码区的大约80％的肌养蛋白中央棒状结构域的多种结构改造。产生包含以下的新构建体：全长蛋白质中存在的24个血影蛋白样重复(sr)中4至6个的独特组合并且存在或不存在内部铰链结构域。通过向营养不良型mdx小鼠进行raav介导的递送，然后在三个月和六个月后对骨骼肌进行病理生理学分析来评价这些新的微小肌养蛋白.通过关注于提高功能活性同时允许肌养蛋白糖蛋白复合物(dgc)的更完全恢复，设计了μdys克隆的数种形式。将所设计的μdys克隆与先前表征的δh2-r23+h3/δct克隆(μdysh3)进行比较，所述该δh2-r23+h3/δct克隆在mdx小鼠的横纹机中可以是高功能性的(参见banks，g.b.，等，plosgenetics6，e1000958，(2010))。这些构建体的设计至少部分地集中于中央棒状结构域，试图提高表达这些构建体的肌肉的收缩性并且恢复神经元型一氧化氮合酶(nnos)向dgc的定位(参见lai，y.，等，thejournalofclinicalinvestigation119，624-635，(2009)；和lai，y.，等，proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica110，525-530，(2013))。还测试了功能性能力和递送携带4、5或6个sr的较大构建体的能力。为了允许这些较大μdys克隆的稳定包装，并入由肌肉肌酸激酶基因改造的小基因调节盒(rc)。该ck8rc可显示出强肌肉限制性表达，但是该ck8rc的尺寸小于500bp(参见goncalves，m.a.，等，moleculartherapy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy19，1331-1341，(2011)；和martari，m.，等，humangenetherapy20，759-766，(2009))。实施例2-微小肌养蛋白克隆的设计设计了7种新的微小肌养蛋白(μdys)克隆以测试棒状结构域结构的变化。7种微小肌养蛋白克隆各自保留了n末端肌动蛋白结合结构域(n-abd)和肌养蛋白聚糖结合结构域(dgbd)的编码序列，然而，每种μdys克隆并入了新的sr组合和铰链结构域，目标在于产生可由raav载体递送和表达的功能特性提高的μdys克隆。还在迪谢内肌营养不良(dmd)的小鼠模型中测试每种μdys克隆，如以下讨论的。μdysh3和这7种新μdys构建体的氨基酸序列和核酸序列的seqidno列于表1中。表1：微小肌养蛋白构建体的序列微小肌养蛋白构建体氨基酸序列核酸序列μdysh3seqidno：3seqidno：11μdys1seqidno：6seqidno：12μdys2seqidno：7seqidno：13μdys3seqidno：8seqidno：14μdys4seqidno：9seqidno：15μdys5seqidno：4seqidno：16μdys6seqidno：10seqidno：17μdys7seqidno：5seqidno：18先前研究表明，μdys克隆中铰链结构域的选择可影响蛋白质的功能(参见banks，g.b.，等，plosgenetics6，e1000958，(2010))。评估替选和/或较短铰链结构域是否可替代μdys克隆μdysh3中使用的铰链3结构域(见同上).已经表明，包含sr16和17可提高一些μdys克隆的功能(例如，通过向dgc募集nnos)。因此，还在多种铰链结构域和其他sr的情况下测试了sr16和17。还使新连接的产生最小化(即，其中将全长蛋白质中正常不彼此相邻的结构域放置在一起的连接)。另外，还评估了包含5或6个sr的组合对μdys克隆功能的影响。与μdysh3克隆和全长蛋白质相比的7种新μdys克隆的结构示于图1a中。测试了肌养蛋白中的两个区域替代铰链3的能力。棒状结构域的铰链区富含脯氨酸但是缺乏构成血影蛋白样重复的三股螺旋型卷曲螺旋(triple-helicalcoiled-coil)的α-螺旋特征基序(alpha-helicalsignaturemotif)(参见winder，s.j.，等，febsletters369，27-33(1995))。sr23在α螺旋b和c之间包含富含脯氨酸的接头(参见例如，图21)。评估该序列(与sr23的α-螺旋c一起)是否可自身(μdys1)、邻接sr16-17(μdys2)或与h3一起(μdys4)用作铰链结构域。一种另外的构建体用整个sr23替代铰链3(μdys5；参见图1a)。还测试了由前述位于sr15与sr16之间的20个氨基酸插入物构成的第二铰链样区域(seqidno：20)(μdys6)(参见winder，s.j.，等，febsletters369，27-33(1995))。设计了另外的构建体以在这些铰链的情况下测试sr结构域的多种组合。已经表明，sr结构域的背景可对其功能是重要的，因此，测试了由sr20的第一半段和sr24的最后半段构成的杂合sr是否会提高μdys功能(μdys3)。该杂合sr将正常邻近铰链3的sr20部分与合并到铰链4中的sr24部分合并(参见图1a)。类似的考虑影响上述μdys6构建体的设计，其中位于sr15与sr16之间的新铰链在其邻近sr16-17中的nnos位置区域的正常情况下使用。还将该后一种构建体与类似构建体直接进行比较，但是该类似构建体使用铰链3而不是来自sr15与sr16之间的短铰链样区域(参见图1b)。还注意到并入5或6个sr结构域的μdys克隆5至7潜在地提高蛋白质的整体功能(参见harper，s.q.等，naturemedicine8，253-261，(2002))。实施例3-部分血影蛋白样重复的功能性可取决于棒状结构域组成通过产生由cmv启动子调节的raav6载体与μdysh3克隆比较地进行μdys克隆1至7的初步功能筛选。向5至6周龄营养不良型mdx4cv雄性小鼠的一个胫骨前肌(ta)肌肉中肌内注射5×1010个载体基因组(vg)的剂量(参见chapman，v.m.，等，proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica86，1292-1296(1989))，其中对侧肌肉用作内部阴性对照(n＝4至5只小鼠/构建体)。在注射后4周和12周时测量肌养蛋白表达和中央成核(退化/再生的标志)(参见图1c和1d)以确定每种构建体表达得如何，表达是否持续以及构建体是否能够阻止或降低正在进行的肌纤维坏死。所有构建体均产生预期大小的μdys蛋白，如通过western印迹分析所示的(参见图1b)。在该年龄和载体剂量/注射的ta肌肉下，与野生型c57bl/6小鼠相比，所有经处理的mdx4cv群组均具有显著更少的肌养蛋白阳性(dys+)肌纤维(p＜0.001)，但是在微小肌养蛋白中观察到功能差异。构建体μdys3和μdys4不如μdysh3表现得好，如通过在注射后4周至12周肌养蛋白阳性肌纤维的减少所证明的。截止注射后12周，与μdysh3相比，构建体μdys-1、2和5显示出更多的肌养蛋白阳性肌纤维(参见图1d)。相对于由ck8启动子驱动的μdysh3，进行μdys6和μdys7的初步筛选。相对于μdysh3，截止注射后12周，这两种新构建体均产生相当水平的转导(dys+)和中央成核(cnf+)肌纤维(参见图1d)。在这两个时间点量化表现出肌养蛋白表达和中央成核二者的肌纤维(参见图1c和1d)。在经处理的群组中在注射后4周至12周，dys+和cnf+肌纤维的水平降低，但是仍保持高于野生型肌肉中。这是否是微小肌养蛋白构建体的差功能性或次优剂量的结果通过单独的初步筛选仍是无法确定的，这促使进行全身施用以进行进一步评价。实施例4-新μdys构建体减弱呼吸肌和后肢骨骼肌中的病理状况再克隆μdys-1、2、3、4、5和μdysh3载体以用较小的肌肉特异性ck8启动子替代cmv，使得能够与包含6个sr的较大构建体(μdys6和7)直接进行比较。对于全身性处理，通过眶后注射向14日龄的mdx4cv雄性小鼠递送1013vg的推注。在注射后3或6个月时，评估经处理的小鼠以及年龄匹配的未经处理对照和野生型对照。设计该试验以监测μdys构建体的表达并评估其可停止营养不良病理生理学的相对程度。通过对腓肠肌和膈肌的冷冻切片进行免疫荧光染色来测量μdys表达的持续性。还验证了dgc成员β-肌养蛋白聚糖和nnos(对于可适用的构建体)向肌膜的募集(参见图2)。在注射后3个月时，所有经处理的组在腓肠肌和隔肌二者的肌纤维中的肌膜处肌养蛋白表达均大于60％。中央成核的肌养蛋白阳性肌纤维的百分比与野生型对照没有显著性差异(参见图3a和3c)。在该时间点，与μdys5相比，观察到μdys2在腓肠肌和隔肌中以显著更低的水平表达(参见图3a和3c)。与注射有μdys1、μdys5和μdysh3的动物相比，经μdys2处理的小鼠在膈肌中也具有显著更少的经转导肌纤维(参见图3c)。相反地，与所有其他经处理的组相比，注射有μdys5的小鼠在腓肠肌中显示出显著更高数量的经转导肌纤维(参见图3a)。相同肌肉的形态学分析说明，所有经处理组的中央成核肌纤维的百分比均显著降低。在膈肌中，在野生型和经处理的组之间中央成核肌纤维的百分比没有显著性差异。然而，在腓肠肌中，与野生型(0％)相比，注射有μdys2和μdysh3的小鼠显示出显著更高水平的中央成核(分别为19％和20％，p＜0.001)。功能性肌养蛋白的缺乏可损害dgc的组装。这可导致机械力传递丧失以及对收缩引起的损伤的易感性提高(参见emery，a.e.h.和muntoni，f.，duchennemusculardystrophy，第三版(牛津大学出版社，2003)；以及ozawa，e.myology(franzini-armstrongcengela编辑)455-470(mcgraw-hill，2004)).一些raav-μdys载体的表达已经证明能够在营养不良型动物模型中提高比产力和对收缩引起的损伤的抗性(参见seto，j.t.，等，currentgenetherapy12，139-151(2012))。评估了哪些新μdys构建体在注射后3个月可改善这些量度(参见图3c和3d)。分别制备腓肠肌条和膈肌条用于原位和体外测量机械特性。与未经处理的营养不良型对照相比，在所有经处理的组中腓肠肌中的比产力均提高(参见图3b)。仅注射有μdys1和μdys2的小鼠在膈肌条中显示出提高的比力(specificforce)(与未经处理小鼠中的98kn/m2相比，分别为156kn/m2和110kn/m2)(参见图3d)。此外，所有新μdys构建体的表达均提高对收缩引起的损伤的抗性，但是彼此相比不存在显著性差异。截止注射后3个月，营养不良病理状况显示停止，但是生理学表现没有显著改善。可使用更长的时间点来进一步评估μdys构建体的功能。实施例5-长期表达暴露μdys构建体的功能差异与在处理后3个月时的分析相比，截止处理后6个月，大部分经处理的组均展现出降低的肌养蛋白表达和伴随的显示中央成核之肌纤维的百分比提高，但是程度不同.然而，显示肌养蛋白表达和中央成核二者的肌纤维的百分比与野生型对照没有显著性差异(参见图4a和4c)。在6个月时，注射有μdys1、μdys5、μdys6、μdys7和μdysh3的小鼠在腓肠肌中显示≥60％肌养蛋白阳性肌纤维和在膈肌中显示≥74％。在3个月的过程期间，μdys2的转导水平在腓肠肌中降低大约2倍(从63％降低至31％阳性肌纤维)，并且在膈肌中降低20％，使其性能成为受试构建体中最差的(p＜0.001；参见图4a和4c).除两种受试构建体之外，对于所有经处理的群组，退化/再生的程度在这两种肌肉中都提高。μdys1的中央成核在膈肌中保持在3％，且μdysh3在腓肠肌中从20％降低至8％(参见图4a和4c)。尽管通过处理后6个月的数据观察到的形态学趋势，但是比产力仍高于来自未经处理对照的肌肉中。一种构建体μdys5的注射使得在腓肠肌(225相对于226kn/m2；参见图4b)和膈肌(148相对于160kn/m2；参见图4d)二者中产力水平都接近野生型小鼠中的那些。基于先前使用包含6至8个sr的微型肌养蛋白的研究，预测包含6个sr的μdys构建体会产生最大的比力并且提供最大的保护免于收缩引起的损伤(参见harper，s.q.，等，naturemedicine8，253-261，(2002))。然而，经μdys6和μdys7处理小鼠在腓肠肌中的比产力显著高于未经处理的对照(分别为p＜0.01和p＜0.0001)，但是不是最高的(参见图4b和4d)。作为替代地，注射有μdys5的小鼠显示出最高水平的比产力。较大的构建体也不一定在保护免于收缩引起的损伤方面最好。例如，注射有μdys6的小鼠在腓肠肌中具有最大的力缺损，而μdys7提供最高的保护免于收缩引起的损伤(参见图5a)。然而，在表达μdys6和μdys7以及μdys5和μdysh3的小鼠中，在膈肌条中对收缩引起的损伤的抗性是最高的(参见图5b)。肌肉组之间在μdys6和μdys7之间的对比结果以及在腓肠肌内力缺损的显著性差异(p＜0.0001)表明特定μdys构建体的性能可能受调节表达盒和所评估肌肉的影响(参见harper，s.q.，等，naturemedicine8，253-261，(2002)；和salva，m.z.，等，moleculartherapy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy15，320-329，(2007))。该观点还用μdys2处理来例证，其中相对于未经处理的对照，对收缩引起的损伤的易感性在腓肠肌中降低但是在膈肌中出乎意料地加剧(参见图5a和5b).实施例6-通过raav6+心脏持异性启动子的基因递送产生用于wt和l48qctnc的载体(分别为raav6-wtctnc和raav6-l48qctnc)。产生具有包含心脏特异性启动子(ctnt455)的raav基因组和c末端c-myc标记的质粒。可通过capo4沉淀法将ctnc变体转基因表达盒(具有mcherry荧光报道子)与包装/辅助质粒pdgm6一起共转染到hek293细胞中。可从培养物中收集载体，冻融并可收集上清液.亲和纯化可使用hitraptm肝素柱(gehealthcarelifesciencestm，piscataway，nj)。可在蔗糖梯度(40％)上浓缩病毒，以27,000rpm(18小时，4℃)离心，并在hanks平衡溶液中再增溶。可使用sv40多聚腺苷酸化区寡核苷酸32p端标记的探针用southern印迹杂交相对于质粒标准物来确定载体基因组，并通过qpcr验证。图8示出了各自以低(l；0.6×1012)和高(h；1.2×1012)病毒颗粒剂量全身性注射(眼内)到3只小鼠中的raav6-l48qctnc的第一使用。超声心动描记术表明，在注射后两周与未经注射(un)的对照相比左心室(lv)射血分数提高约20％并且在3周时提高30％至40％。使用对照腺病毒载体的全身性注射不改变lv功能。通过sds-page分离来自一只经raav6-l48qctnc-myc转染的小鼠(和未经注射的对照)的肌原纤维，并用抗ctnc探查western印迹。myc标签的存在导致ctnc的迁移较慢(参见图9)，并且通过密度测定法确定ctnc-myc与天然ctnc的比例为约40％(类似使用腺病毒和转基因动物看到的那些，参见以下)。实施例7-ctnc变体对心脏功能的急性和慢性作用可使用raav6-ctnc载体和转基因小鼠来评估ctnc变体对心脏功能的急性和慢性作用。为了确定对肌丝功能的急性变化的响应，可通过尾静脉或眼眶内注射具有心脏特异性启动子(ctnt455)的raav6-ctnc变体(例如，wt、l48q、l57q或161q)来转染正常成年小鼠。可通过阻遏mhc启动子直到成年，用l48qctnc和161qctnc转基因小鼠进行平行试验.可用没有阻遏启动子的小鼠进行另外的研究以确定这些ctnc变体对正常心脏发育和功能的作用。可在1、2、3和6月龄时进行超声心动描记术评估以确定任何功能变化的发生和进展。可通过用异丙肾上腺素进行β-肾上腺素能刺激来使一些动物受应激。在超声心动描记术之后，一些动物可经历使用millartm导管方案的血液动力学测量，可对另一些动物实施安乐死并解剖心脏用于工作心脏方案或者用于完整或经剥皮肉柱(trabeculae)制备物、培养的心肌细胞或肌原纤维制备物。实施例8-使用raav6构建体的组织特异性靶向在raav6构建体中使用由不同基因启动子驱动的碱性磷酸酶来评估组织特异性。表2(参见下文)将两种心脏特异性启动子(肌酸激酶7(ck7))和心脏肌钙蛋白t(ctnt455))与非特异性巨细胞病毒(cmv)启动子进行比较，其中值相对于ta中的ck7归一化.ctnt455可导致在心脏中高表达而在其他组织中几乎不表达至不表达。这种特异性可降低r1r2过表达在非心脏组织中的影响的可能性。datp对小鼠主动脉平滑肌力发展没有显著作用。为了研究升高的datp的潜在全身影响，确定datp是否影响小鼠主动脉平滑肌收缩。图12a显示，对于作为收缩底物的datp相对于atp，经剥皮肌肉条中的背对背收缩没有不同，并且多次试验的数据总结于图12b中。此外，对照测量结果表明，datp不改变控制平滑肌肌球蛋白与肌动蛋白结合的肌球蛋白轻链磷酸化的水平。实施例9-用于心脏特异性靶向的重组aav6-r1r2使用raav6载体来急性提高r1r2(和[datp])的心脏水平。可产生具有包含心脏特异性启动子(ctnt455)的重组raav基因组的质粒。可通过capo4沉淀法将r1r2转基因表达盒与包装/辅助质粒pdgm6一起共转染到hek293细胞中。可从培养物中收集载体，冻融，并可收集上清液.亲和纯化可使用hitraptm肝素柱(gehealthcarelifesciencestm，piscataway，nj).可在蔗糖梯度(40％)上浓缩载体，以27,000rpm(18小时，4℃)离心，并在hanks平衡溶液中再增溶。可使用sv40多聚腺苷酸化区寡核苷酸32p末端标记探针用southern印迹杂交相对于质粒标准物来确定载体基因组，并通过qpcr验证。表2：ck7、cmv和ctnt455启动子的比较ck7cmvctnt455胫骨前肌13.10心脏1.95.11.6肺0.020.090.01肝0.020.090.004主动脉0.010.130.005在raav6构建体中使用由不同基因启动子驱动的碱性磷酸酶来评估心脏靶向构建体的选择.表2将两种横纹肌特异性启动子(肌酸激酶7(ck7)和心脏肌钙蛋白t(ctnt455))与非特异性巨细胞病毒(cmv)启动子进行比较，其中值相对于ta中的ck7归一化。ctnt455可导致在心脏中高表达，但是在其他组织中几乎不表达至不表达，因此降低r1r2过表达在非心脏组织中的影响的可能性.图14a示出了关于此的western印迹证据，其中与对照小鼠的心脏相比，来自注射有raav6-r1r2ctnt455(4.5e13)的小鼠的心脏组织表达高r1和r2亚基。注意，上面的条带是非特异性染色，其中箭头指向r1和r2蛋白(通过分子量标记鉴定的)。与心脏相比r1和r2表达在肺中极其低并且在骨骼肌中没有改变。这在图14中根据来自未经注射小鼠(图“b”)相对于注射有raav6-碱性磷酸酶的小鼠(图“c”)的心脏组织得到证明，表明raav6-r1r2ctnt455可提供稳定的长期r1r2过表达。稳定的raav6转基因表达还已经显示在大鼠中持续12周或更久并且在狗中持续至少6个月或更久。研究可确定raav6-r1r2ctnt455注射剂量、时程和提高的lv泵功能的稳定性、心脏组织r1r2水平和[datp]之间的关系。图15示出了向3个月大的小鼠(n＝6/组)中注射3种载体剂量(即1.5×1013、4.5×1013和1.35×1014个raav6-r1r2ctnt455载体基因组)或盐水(对照)对lv功能的作用.在一周之后在高剂量下和在两周之后在所有剂量下，lv缩短分数(fs)显著提高。其中截止6周时效果等同。fs的提高幅度为25％至50％，指示使用相对低的载体剂量可实现的效果。实施例10-转基因r1r2过表达小鼠(tg-r1r2)可利用过表达rr的两种亚基(rrm1和rrm2)的双转基因小鼠。图13示出了两种亚基在心肌中的过表达，其中这些tg-r1r2小鼠的密度测定计算值是野生型(wt)小鼠的对应值的33.7±7.6(rrm1)和23.7±3.4(rrm2)倍大.注意，对于rrm2，上面的条带(＊)是非特异性的。在wt组织中内源性rrm2蛋白是不可检出的，但是在tg-r1r2小鼠中其显示为在背景条带下面的条带。尽管还未评估心脏组织的datp水平，但是在骨骼肌中[datp]提高10倍，酶亚基对应地提高3.3±2.1(rrm1)和35.7±11.1(rrm2)倍。datp的这一提高幅度类似于对在培养物中经腺病毒r1r2转染的心肌细胞所确定的(参见图10)。在6至8个月龄时对tg-r1r2小鼠进行初步超声心动描记术(测量连续3周)揭示缩短分数(fs)平均提高＞50％，且舒张期lv内径(lvidd)减小15％。如图11所示的，这些差异(相对于wt对照)的幅度类似于初步腺病毒-r1r2注射实验的值。实施例11-升高的细胞r1r2和[datp]对心脏功能的急性作用急性r1r2过表达(通过raav6-r1r2载体)可在小鼠心脏中提高[datp]，使得收缩和舒张功能提高.这可反映在以下方面：1)提高的心肌细胞和肌原纤维收缩以及更快的驰松(部分地由于提高的横桥周期动力学)；2)基础心脏代谢提高且不损害能量储存；以及3)动作电位持续时间不改变或缩短(由于增强的ca2+隔离(sequestration))。可通过尾静脉或眼眶内注射具有心脏特异性启动子ctnt455的raav6-r1r2载体来转染正常成年fvb/n小鼠(如上所述)，其中以假注射和使用仅包含ctnt45的raav6作为对照。在注射之后，可每周进行超声心动描记术(多至6周)以确定最佳(最大作用)时间点进行进一步评估。初步研究可如下表征心脏功能：体内使用超声心动描记术，然后进行原位血液动力学测量，或者离体使用langendorff灌注的心脏进行能量研究并使用工作心脏装置来评估泵性能。在所选的时间点，可对另一些小鼠实施安乐死并解剖心脏用于完整或经剥皮的肉柱制备物、分离的心肌细胞、肌原纤维制备物、蛋白质分析和(免疫)组织学。这些测量结果可提供用于在急性r1r2过表达下心脏功能改变的分子机制。实施例12-肌丝和sr蛋白剖析(profiling)在所有条件下收缩功能、ca2+瞬态(transient)、sr触发活性(sparkactivity)和/或ca2+负荷的变化可与肌丝蛋白(ctn1、ctnt、mlc-2、cmybp-c和tm)、sr蛋白(plb、ryr)和肌膜蛋白(ncx、pmca和l型ca2+通道)的同种型、丰度和磷酸化相关联。可使用rt-pcr和western印迹分析来确定mrna和蛋白质表达的变化。可制备sr蛋白级分。如果电生理学测量结果指示变化，则可使用特异性抗体来评估离子通道。可通过western印迹(参见图10)或免疫组织化学进行r1r2表达的分析，并与实验终点相关联。可通过确定r1r2在非心脏组织(例如骨骼肌和肺)中的表达来评估ctnt455启动子的特异性。可使用diamond磷蛋白凝胶染色(与ruby蛋白质凝胶染色)和western印迹分析来剖析磷酸化。对于位点特异性丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，可进行质谱。在所选的分析时间点下，r1r2过表达和提高的[datp]可提高梗死心脏的心脏表现。可提高对高ca2+挑战、β-肾上腺素能刺激和提高前负荷的响应。图16中评估的心脏的体外neely工作心脏测量结果显示已经梗死心脏(未处理)的前负荷响应性丧失(心力衰竭)，但是显示接受载体的梗死心脏的前负荷响应性恢复至对照未梗死心脏的水平，从而证明心脏功能的恢复。参照图17，其中功率以g·cm/分钟的单位给出，该作用可通过减轻慢性β-肾上腺素能刺激而发生(其可通过监测血浆激素来评估)。这在多尺度分析中可反映为改善的：1)ca2+瞬态；2)肌丝收缩和松弛幅度以及动力学；以及3)能量特征。还可看到经处理和未经处理的心脏之间在α-和β-肾上腺素能介导的心肌细胞蛋白质磷酸化中的差异。实施例13-携带ck8-μdys5的aav9载体向8周龄mdx4cv小鼠的ta肌肉中注射(肌内)2.5×1011个携带ck8-μdys5表达盒之aav9载体的载体基因组。两周后，处死小鼠并使用抗肌养蛋白抗体针对肌养蛋白表达对肌肉冷冻切片进行染色。如图22所示的，在经注射的肌肉中观察到μdys5蛋白的广泛且稳健的表达。aav9载体可包含与aav反向末端重复(itr)连接的表达盒(例如，启动子、cdna和聚(a)位点)。itr可来自aav2。aav9载体可包含含有表达盒和使用来自aav9的衣壳蛋白包装到载体中的itr的基因组dna。seqidno：22是连接有反向末端重复(itr)的ck8-μdys5盒的一个示例性核酸序列。这样的序列可用于产生aav6、aav9等。还可向该序列添加不同的内含子、聚(a)位点、间隔区等。实施例14-动物试验在该研究中使用基于c57bl/6近交系繁育的雄性野生型和营养不良型mdx4cv小鼠。根据华盛顿大学的机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommitteeoftheuniversityofwashington)进行动物试验.对于初步筛选，向5至6周龄营养不良型mdx4cv小鼠的ta肌肉中施用5×1010vg的raav6载体。向对照小鼠注射hanks平衡盐水溶液作为假操作。在全身性分析中，通过眶后注射向14日龄mdx4cv雄性静脉内施用1013vg的raav6载体。在处理后3个月或6个月时处死小鼠用于进一步评价.实施例15-载体克隆和病毒产生所有的微小肌养蛋白转基因都使用标准的克隆技术工程化(参见chamberlain，j.，pcr-mediatedmutagenesis，doi：10.1038/npg.els.0003766(2004))。使用在大部分中央棒状结构域侧翼的mfei/xhoi或nhei/xhoi限制性位点将经改造的区域亚克隆到在aav载体基因组主链质粒(parap4)内的μdys铰链3中(δh2-r23/δct，+h3)(参见banks，g.b.，等，plosgenetics6，e1000958，(2010))。将来自兔β-珠蛋白基因的多聚腺苷酸化信号亚克隆到紧接于μdyscdna羧基末端之后。由巨细胞病毒立即早期启动子和增强子构成的cmv启动子驱动微小肌养蛋白cdna的表达.将ck8调节盒(参见goncalves，m.a.，等，moleculartherapy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy19，1331-1341，(2011))亚克隆在sphi/sacii位点中以替代cmv启动子并驱动微小肌养蛋白cdna在肌源性细胞中表达。如先前描述的制备重组aav6载体(参见gregorevic，p.，等，naturemedicine12，787-789，(2006))。简言之，将表达构建体与pdgm6包装质粒一起共转染到hek293细胞中，并随后收获，并通过过滤、肝素亲和色谱和超速离心的组合进行纯化。通过southern印迹和定量pcr分析，并且总是与该研究中使用的其他制备物相比较地量化病毒制备物以确保在处理营养不良型小鼠中的相等给药。实施例16-组织学分析在生理学分析之后，处死小鼠用于尸检。将肌肉包埋在o.c.t.化合物(水溶性二醇和树脂的最佳切片温度配方)(sakurafinetekusatm，torrance，ca)中并冷冻在经液氮冷却的异戊烷中。使用大约10μm厚的横切片进行免疫荧光研究。在磷酸钾缓冲盐水(kpbs)中的2％明胶和1％tween-20中封闭切片.用在磷酸钾缓冲盐水中的0.2％明胶(kpbs-g)洗涤切片，并随后孵育经在kpbs-g中的2％正常山羊血清中稀释的一抗。然后，将切片在kpbs-g中清洗三次，然后与二抗和dapi(4′，6-二脒-2′-苯基吲哚二盐酸盐)(st.louis，mo)一起孵育。再在kpbs-g中洗涤三次之后，将载玻片封固在goldantifademountant(一种液体封固剂)(lifetechnologiestm，grandisland，ny)中。一抗包括兔多克隆n末端抗肌养蛋白抗体(参见harper，s.q.，等，naturemedicine8，253-261，(2002))、与alexa488dye(一种绿荧光染料)(lifetechnologiestm)缀合的小鼠单克隆抗肌养蛋白(manex1011b克隆1c7，developmentalstudieshybridomabank(dshb)，universityofiowa，iowacity，ia)、与dylighttm594(一种胺反应性染料)(thermofisherscientifictm，rockford，il)缀合的小鼠抗β肌养蛋白聚糖(mandag2克隆7d11，dshb)、大鼠抗α2-层黏连蛋白(克隆4h8-2，st.louis，mo)和兔抗nnos(z-rnn3，lifetechnologiestm)。二抗为分别与alexa660远红染料(farreddye)或alexa594红色荧光染料缀合的山羊抗兔或抗大鼠(lifetechnologiestm)。在使用dptm软件的olympustmszx16tm解剖荧光显微镜(olympustm，centervalley，pa)上捕捉图像.实施例17-免疫印迹将来自初步筛选的小鼠的ta肌肉急速冷冻在液氮中并随后通过经干冰冷却的研钵和研杵进行研磨。将肌肉在补充有completetmmini蛋白酶抑制剂混合物片剂(rochetm，indianapolis，in)的激酶测定裂解缓冲液(1％tritonx-100，50mmtris-hcl，ph7.5，150mmnacl、1mmedta中匀浆。使用piercetmcoomassieplus(bradford)测定(piercetm，rockford，il)确定裂解物的蛋白质浓度。将40μg的蛋白质混悬在补充有100mm二硫苏糖醇的lds样品缓冲液(lifetechnologiestm)中并上样到4％至12％bis-tris聚丙烯酰胺凝胶(lifetechnologiestm)上。在运行凝胶并将样品转移到amershamtmhybondtmp聚偏二氟乙烯膜(gehealthcarelifesciencestm，piscataway，nj)上之后，使用在pbs中的10％脱脂奶粉将印迹封闭.然后，将印迹与一抗在pbs中的5％脱脂奶粉、0.1％tween-20(pbst)中孵育。在pbst中洗涤三次之后，将二抗在pbst中的5％脱脂奶粉中孵育，然后在pbst中洗涤四次。一抗包括小鼠抗肌养蛋白(manex1011b克隆1c7，dshb)和作为上样对照的兔抗甘油醛3-磷酸脱氢酶(g9545，)。二抗包括驴抗兔或小鼠(jacksonimmunoresearchlaboratoriestm，westgrove，pa)。使用piercetmeclpluswestern印迹底物(thermofisherscientifictm)显影印迹并使用stormtm860成像系统(gehealthcarelifesciencestm)进行扫描。实施例18-骨骼肌的功能分析如先前所述但在提及的改进下原位(腓肠肌)和体外(膈肌)测定肌肉的产力和对收缩引起的损伤的易感性(参见banks，g.b.，等，humanmoleculargenetics17，3975-3986，(2008)；和gregorevic，p.，等，theamericanjournalofpathology161，2263-2272，(2002))。在最佳肌肉纤维长度下确定最大等长力，并随后在刺激(701ctm型，高功率，两相刺激器，aurorascientifictm)下使肌肉经历一系列的逐渐提高长度变化。分别通过以150hz和180hz刺激来测量腓肠肌和膈肌的最大等长强直性力。以30秒的时间间隔进行离心收缩，每次包括在固定长度下进行刺激以允许150ms(腓肠肌)或100ms(膈肌)的峰值等长力，然后在肌肉的物理伸长期间继续200ms(腓肠肌)或300ms(膈肌)的刺激。施加最佳长度的0％至45％的一系列长度变化或应变以加强收缩特性的超负荷和对肌肉结构的损害。在即将进行后续离心收缩之前产生的峰值等长力中测量离心收缩的结果。用2，2，2-三溴乙醇麻醉小鼠以使其对触觉刺激没有响应并随后准备用于腓肠肌的原位分析.通过踝处的切口使跟腱暴露，将其用3-0编织丝(ethicontm，cincinnati，oh)缝合，切断并紧固于双模式力传感器-伺服电动机(305b-lrtm型，aurorascientifictm，ontario，ca)的杠杆臂。通过插入穿过膝的不锈钢针并通过将后爪绑到定制的聚(甲基丙烯酸甲酯)平台上来将小鼠固定并紧固到装置。通过两个针电极刺激腓肠肌，这两个针电极插入穿过在膝和髋之间区域中的腓神经的任一侧上的皮肤。在三个轴上操纵伺服马达(servomotor)的位置以帮助确定最佳肌肉纤维长度.通过还允许数据获取的labviewtm软件(nationalaustin，tx)控制伺服马达.对于膈肌的体外制备，在腓肠肌分析之后将经麻醉的小鼠处死，并将整个膈肌和周围的胸廓快速切割到包含通过5％co2-95％o2混合物鼓泡的氧合tyrode溶液(ph7.3)的皿中(参见lannergren，j.，bruton，等，thejournalofphysiology526pt3，597-611(2000))，该溶液包含(mm)：nacl121、kcl5、cacl21.8、mgcl20.5、nah2po40.4、nahco324、葡萄糖5.5溶液。在显微镜下分离膈肌条，其由纵向布置的全长肌肉纤维、中心腱的一部分、以及在条远端的肋骨和肋间肌的一部分构成。使用针引导的编织外科手术用丝(6-0，p1；ethicontm)在中心腱处系住肌肉条，通过肋骨部分缝合(5-0；ethicontm)，并随后紧固到具有控温水平浴的原位小鼠装置(809atm型，aurorascientifictm)。用上述经鼓泡的tryode溶液填充装置浴，并维持在25℃。在上文针对膈肌所述的条件下，确定最佳纤维长度并以与腓肠肌分析类似的方式评估等长和离心收缩特性。通过分别将最大等长力相对于腓肠肌或膈肌条的质量(mass)归一化来确定两个肌肉组的比力。使用以下方程：比力＝最大力×羽状角度(pennation)×肌肉长度×1.04密度/肌肉重量(参见burkholder，t.j.，等，journalofmorphology221，177-190，(1994))。羽状角度是骨骼肌纤维束自身在肌肉的腱之间取向的角度。对于腓肠肌，通过先前的研究确定该角度(参见banks，g.b.，等，plosgenetics6，e1000958，(2010))。膈肌条以使得肌纤维在肋的半键肌连接处至肌腱连接处之间以直线收缩的方式分离(参见gregorevic，p.，等，theamericanjournalofpathology161，2263-2272，(2002))。腓肠肌和膈肌的羽状角度分别等于0.45和1。实施例19-ctnt455调节盒的构建如本文中所述的，构建ctnt455调节盒(seqidno：1；455表示rc中碱基对的数目)。从人细胞制备dna。基于与大鼠和鸡ctnt序列的序列相似性，使用pcr引物来扩增ctnt增强子/启动子区。将野生型ctnt增强子/启动子与人胎盘碱性磷酸酶(ap)edna连接，并产生质粒dna。将ctnt-ap质粒转染到新生大鼠心肌细胞和正分化的小鼠骨骼肌细胞中。野生型人ctntrc(seqidno：2)在心肌和骨骼肌细胞培养物中都具有高活性。ctnt在骨骼肌中的表达初始是在预期之外。然而，不受任何一种特定理论的约束，ctnt在骨骼肌中的表达可能是由于在早期骨骼肌发育期间和在肌肉再生期间心脏基因表达的正常激活。这种特性可潜在地对一些基因治疗应用(例如在仅在肌肉再生期间瞬时表达治疗性蛋白质中)是有益的。然后，如下微型化野生型ctnt增强子：除去非保守的碱基序列(基于人、大鼠、狗和鸡之间的比较)以及一些保守的序列基序，然后如上所述进行转染测试以验证缺失不降低转录活性(参见图18和19)。为了获得更高的活性，测试向ctnt启动子添加多个微型化的ctnt增强子是否会提高活性.这些测试在心肌和骨骼肌培养物中进行并且发现ctnt455(包含一个额外的增强子)是最高活性的(参见图20).为了确定ctnt455在体内是否具有活性，将ctnt455-ap构建体包装在raav6中，并通过眶后全身性递送将载体施用到小鼠。4周之后，对小鼠实施安乐死并测定心肌和骨骼肌以及非肌组织中的rc表达水平。数据表明ctnt455在心肌中具有高转录活性，但是在骨骼肌和所有非肌组织二者中转录沉默(参见表2；还参见标题为“cellandgenebasedmethodstoimprovecardiacfunction”的pct申请no.pct/us2012/039897，其全部内容通过引用并入本文)。实施例20-统计学分析所有结果均作为平均值±标准误差平均值报道。使用单因素及双因素anova和tukey事后多重比较检验确定群组之间的差异。所有数据分析均使用graphpadtmprismtm6软件(sandiego，ca)进行。如本领域普通技术人员会理解的，本文中公开的每个实施方案可包含特定的所述要素、步骤、成分或组分，基本上由其组成，或者由其组成。本文中使用的承接术语“包括/包含”意指包括但不限于并且允许包括甚至大量的未指出的要素、步骤、成分或组分。承接短语“由...组成”不包括未指出的任何要素、步骤、成分或组分。承接短语“基本上由...组成”将实施方案的范围限制于指出的要素、步骤、成分或组分以及不在实质上影响实施方案的那些。除非另外指出，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、特性(例如分子量)、反应条件等的所有数值均应被理解为在所有情况下被术语“约/大约”修饰。因此，除非相反地说明，否则说明书和所附权利要求书中所述的数值参数是近似值，其可根据试图通过本发明获得的期望特性而变化。至少并且并非试图将等同原则的应用限制于权利要求书的范围，每个数值参数应至少根据所报道有效数字的数值并应用普通舍入技术(roundingtechnique)来解释。当需要进一步清楚时，术语“约/大约”当与所述数值或范围结合使用时具有本领域技术人员合理赋予其的含义，即，表示稍大于或稍小于所述值或范围，至在所述值的±20％、所述值的±19％、所述值的±18％、所述值的±17％、所述值的±16％、所述值的±15％、所述值的±14％、所述值的±13％、所述值的±12％、所述值的±11％、所述值的±10％、所述值的±9％、所述值的±8％、所述值的±7％、所述值的±6％、所述值的±5％、所述值的±4％、所述值的±3％、所述值的±2％、或所述值的±1％的范围内.尽管说明本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中所述的数值尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地包含某些由在其各自测试测量结果中发现的标准偏差不可避免地导致的误差。除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求书的上下文中)中使用的没有数量词修饰的名词应被解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中对值范围的记载仅旨在用作单独地提及落入该范围的每个单独值的速记方法。除非本文中另外指出，否则每个单独值并入本说明书中，如同其在本文中单独记载一样。除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，并且除非另有声明，否则不对本发明的范围构成限制.说明书中的语言不应被解释为表明任何未要求保护的要素是实施本发明所必要的。本文中公开的发明的替选要素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员可单独地或以与其他组成员或见于本文中的其他要素的任意组合提及和要求保护。预期出于方便和/或专利性的原因，一个或更多个组成员可包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包括或删除时，本说明书被认为包含经如此修改由此满足对所附权利要求书中所用的全部马库什组(markushgroup)的书面描述的组。在本文中描述了本发明的某些实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。当然，在阅读上述描述后，这些描述的实施方案的变化方案对本领域普通技术人员将变得显而易见.申请人预期技术人员适当地使用这样的变化方案，并且申请人打算以不同于本文中具体描述的方式实施本公开内容的多个实施方案。因此，本公开内容包括根据适用法律允许的所附权利要求书中所述主题的所有修改方案和等同方案。此外，除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则本公开内容涵盖其所有可能变化方案中上述要素的任意组合。此外，在本说明书通篇多次引用专利和印刷出版物。上述引用的参考文献和印刷出版物各自独立地通过引用整体并入本文。应理解，本公开内容的实施方案是对本公开内容的原理进行举例说明。可使用的其他修改方案也在本公开内容的范围内。因此，根据本文中的教导可利用例如但不限于本公开内容的替选配置。因此，本公开内容不限于如精确地所示和所描述的那些。本文中所示的细节仅作为实例和用于本公开内容优选实施方案的举例说明性讨论，并且提出是为了提供被认为是本公开内容多个实施方案的原理和概念方面的最有用且容易理解描述的内容。除非在实例中清楚且明确地修改或者当含义的应用术语使任何结构无意义或基本上无意义时，在任何将来结构中意指并且旨在以本公开内容中使用的定义和解释为准，在术语的结构使其无意义或基本上无意义的情况下，定义应从webster词典，第3版或本领域普通技术人员已知的字典例如牛津生物化学与分子生物学词典(oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology)(anthonysmith编辑，oxforduniversitypress，oxford，2004)中获取。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的潜在原理的情况下，可对上述实施方案的细节进行许多改变。因此，本发明的范围应仅由所附权利要求书决定。当前第1页12