本发明涉及一种用于分级富含蛋白质微藻的生物质的组分的方法。
背景技术：
本领域普通技术人员熟知的是，小球藻是潜在的食品来源，因为它们富含蛋白质和其他必需营养素。
它们被描述为含有45％蛋白质、20％脂肪、20％碳水化合物、5％纤维和10％矿物质和维生素。
鉴于其丰度及其氨基酸谱，微藻蛋白质因此被认为是食品中的大豆蛋白质或豌豆蛋白质的替代性来源。
蛋白质级分也可以被开发为化妆品行业、或甚至医药行业中的功能剂。
然而，由于在所述级分中存在不希望的化合物(例如叶绿素)导致包含它们的食品组合物的颜色、风味和结构方面的不希望的变化，所以微藻蛋白质的食品应用方面的发展尚不显著。
为了增加其在食品应用中的潜力，并且也为了增加其商业价值，因此必须在不影响它们的分子结构的情况下从微藻中提取这些蛋白质。
“软”提取技术将因此需要分离具有高溶解度和良好技术和功能特性的蛋白质，但是尤其绿色微藻的微藻细胞壁的刚性根本上与这一点矛盾，因为它破坏了细胞内蛋白质的提取和完整性。
因此，与其相反，常规地“硬”的物理或化学条件被用来破坏微藻细胞壁。
因此，许多研究提出了碱溶类型、通过有机溶剂提取类型或高压匀化类型的技术。
然而，在这些技术选择中，蛋白质的变性未认为是麻烦的，因为大多数的这些方法被开发用于分析的目的，或旨在提供用于产生水解蛋白质的酶消化的底物。
然而，保存细胞组分完整性的有效崩解方法应该不仅最大化产率，而且最大化提取的产物的质量。
换言之，用于优化崩解壁的方法必须例如避免：
-目标产物的化学污染，
-使用过高的破裂能；后者可能导致感兴趣的细胞内分子的不可逆变性或降解。
此外，对于大规模生产而言，对于选择的方法，重要的是可转换至这一规模。
最后，此细胞崩解步骤的引入必须是容易的，并且必须对随后的方法/处理步骤不具有负面影响。
所有这些限制影响崩解方法的效率并且由于同样原因影响其能量消耗。
这就是为什么珠磨机技术是优选的，因为它被认为对于按其天然形式释放细胞内蛋白质是有效的。
在珠磨机中，将细胞与小球形颗粒一起以悬浮液状态搅动。细胞的破碎是由剪切力、珠间碾磨以及与珠的碰撞引起的。
例如，专利us5330913中给出了适当的珠磨机的描述。这些珠使细胞破碎以便从中释放细胞内容物。然后以“水包油”乳液形式获得更小尺寸(与起源细胞相比)的颗粒的悬浮液。
通常雾化此乳液并且消除水，然而留下包含由细胞碎片、间质可溶性化合物和油构成的异质混合物的干燥粉末。
在使用这些细胞崩解技术时要解决的困难是单独地分离细胞内内容物(以便排除细胞膜碎片、糖、纤维和脂肪)以及尤其是保存蛋白质负载的质量。
在四爿藻(tetraselmissp)属的微藻的情况下，anjaschwenzfeier等人(bioresourcetechnology[生物资源技术]，2011，102，9121-9127)提出了保证分离的蛋白质的溶解度和氨基酸谱质量并且其中污染物(例如着色物质)被除去的方法，该方法包括以下步骤：
-通过珠磨机进行细胞崩解，
-将碾磨的微藻悬浮液离心，
-上清液的透析，
-穿过离子交换树脂，
-洗脱物的透析，
-脱色，然后
-洗涤和再悬浮。
然而，这种实验室方法(用于处理24g的生物质)不能放大到工业规模，其中反而将珠磨机方法用于回收完整生物质。
已经提出了替代解决方案，完全地改变了用于释放微藻细胞内内容物的技术，例如脉冲场电处理。
这是因为生物细胞暴露于高强度脉冲电场会改变细胞膜的结构。
外源场引起细胞膜的充电。在足够的跨膜电压(0.5v-1v)下，磷脂的分子排列改变，这导致细胞膜失去其屏障作用，使得它可渗透。取决于使用的条件，此细胞膜透化可以是可逆的或不可逆的。
然而，为了有效提取细胞内化合物，使用此技术的本领域普通技术人员依然建议造成细胞膜的不可逆的透化，由此导致其崩解。
然后，细胞膜的此破裂促进释放细胞内容物，并且在使用补充性溶剂提取技术的情况下，也促进溶剂渗透进入细胞。
尽管是有前景的，但是不幸地，此技术并不能外推至工业规模以处理在1m3至200m3的反应器中产生的生物质。
其结果是，对于提供用于弱化微藻细胞壁的技术仍存在未满足的需求，该技术能够释放细胞内内容物，而不崩解细胞或削弱其组分的质量。
技术实现要素：
本申请人公司已经发现，这种需求可以通过将用于微藻细胞的热透化的方法与离心和沉淀(通过改变培养基的特性)的步骤组合得到满足。
因此，本申请人公司反对以下技术偏见，该技术偏见认为，用于细胞破碎的热方法，就像由机械崩解引起的剪切力，是用于降解或变性源自微藻的产物的替代的技术(richmond，1986，handbookofmicroalgalmassculture[微藻大量培养手册]，crc出版有限公司(crcpress,inc)-molinagrima等人，2003，recoveryofmicroalgalbiomassandmetabolites:processoptionsandeconomics[微藻生物质和代谢物的回收：方法选项和经济学]，biotechnol.adv.[生物技术进步]20:491-515)。
此外，一旦从细胞内区室释放，容易地进行肽分离物的回收，只要由本申请人公司开发的热处理不导致细胞壁的崩解。
最后，本发明的方法使得有可能尤其是回收和升级残余生物质，以及还有肽分离物的副产物。
具体实施方式
本发明因此涉及一种用于分级富含蛋白质微藻的生物质的组分的方法：
-通过进行细胞膜的热透化的方法，接着
-回收并升级如此经透化的残余生物质及其副产物。
更确切地说，根据本发明的方法是用于分级小球藻(chlorella)属的富含蛋白质微藻的生物质的组分的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
-提供通过发酵产生的微藻生物质，
-任选地，洗涤该生物质以便消除间质可溶性化合物，
-在50℃与150℃之间、优选在约80℃与150℃之间的温度下将该生物质热透化，持续在约10秒与约5分钟之间的时间、优选地持续在约5秒与约1分钟之间的时间，
-在如此经透化的生物质与可溶性级分之间通过离心技术、更特别是多级离心进行分离，
-任选地，通过微孔过滤回收和澄清以此方式获得的可溶性级分，以便从中除去残余不溶性物质，
-通过沉淀纯化前述可溶性级分，以便获得肽分离物和肽浓缩物。
术语“大约”旨在意指包括指示的值加或减10％、优选地其加或减5％的值范围。例如，“大约10”意指在9与11之间、优选地在9.5与10.5之间。
微藻的选择
优选地，小球藻属微藻选自由普通小球藻(chlorellavulgaris)、根腐小球藻(chlorellasorokiniana)和原壳小球藻(chlorellaprotothecoides)组成的组，并且更具体地是原壳小球藻。
在一个具体实施例中，菌株为原壳小球藻(菌株utex250-theculturecollectionofalgaeattheuniversityoftexasataustin-usa[美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养物保藏中心])。在另一个实施例中，该菌株是菌株ccap211/8d–theculturecollectionofalgaeandprotozoa,scotland,uk[英国苏格兰的藻类和原生动物培养物保藏中心])。
发酵条件的选择
在异养条件下并且在不存在光的情况下的培养通常导致产生具有按干细胞的重量计45％至70％的蛋白质含量(通过测量氮含量n×6.25进行评估)的小球藻生物质。
优选的是用富含蛋白质微藻的生物质开始，该生物质具有例如大于60％的蛋白质含量(表达为n.6.25)。在这种情况下，本申请人公司建议使用其已经开发的新颖方法，并且该新颖方法包括：
-第一发酵步骤，有限的氮，其中用nh3/koh混合物进行ph调节，并然后
-通过用单独nh3进行的ph调节来除去此氮限制的第二步骤。
因此，这些操作条件使得有可能快速获得具有大于60％的n.6.25、约65％的n.6.25的蛋白质含量以及低着色的生物质。产率是按固体重量计从45％至50％，并且生物质的最终浓度是在80g/l与120g/l之间。
生物质的处理
然后通过固液分离、通过正面过滤或切向过滤、或通过另外为本领域普通技术人员已知的任何手段收集生物质。
任选地，本申请人公司然后建议以这样一种方式洗涤该生物质，该方式是通过生物质的一系列的浓缩(通过离心)/稀释来消除间质可溶性化合物。
出于本发明的目的，术语“间质可溶性化合物”意指发酵培养基中的所有可溶性有机污染物，例如水溶性化合物如盐、残余葡萄糖、具有2或3的聚合度(或dp)的寡糖、或肽。
然后将以此方式纯化了其间质可溶性化合物的此生物质优先调节至按重量计在15％与30％之间的固体含量，优选调节至在20％与30％之间的固体含量。
生物质的热透化
在50℃与150℃之间、优选在约80℃与150℃之间的温度下进行热处理，持续约10秒与约5分钟之间的时间、优选地持续约5秒与约5分钟之间的时间、优选地持续约10秒与约1分钟之间的时间。在优选的实施例中，该热处理在约140℃的温度下进行约10秒。在另一个优选的实施例中，该热处理在约85℃的温度下进行约1分钟。
此处理使得有可能允许细胞内组分扩散进反应介质。
最后，这些步骤结束时，将该生物质优选地冷却至低于40℃的温度，或甚至在约4℃下冷冻。
不希望受具体理论束缚，本申请人公司认为，在这些操作条件下进行的热处理可以因此充当细胞膜弱化方法，该方法允许自发释放细胞内区室的可溶性组分，或甚至释放细胞外基质。
除了离子物质，有机物质例如碳水化合物(主要是dp1和dp2)、肽和多肽也从细胞排出。
相反地，脂质和疏水有机化合物保留在细胞中，由此清晰地证明，细胞被透化并且未被裂解或破坏。
因此，根据本发明的方法不导致乳液形成，而是的确形成水性悬浮液。
所有这些可溶性物质通过经透化的细胞膜的释放类似于透析类型的自由扩散的过程。
因此，时滞可能是必需的以便允许在透化细胞膜的热处理后充分的扩散。
在文献中，用于脉冲场透化酵母细胞膜(为了从其提取蛋白质)的方法需要从4h至6h(ganeva等人，2003，analyticalbiochemistry[分析生物化学]，315，77-84)。
根据本发明，使用在约5秒与约5分钟之间的短得多的反应时间。
经透化的生物质和可溶性级分的分离
然后通过离心技术、更特别是多级离心在如此经透化的生物质与可溶性级分之间进行分离。
必要的话，如此获得的可溶性级分可以通过微孔过滤来澄清，以便使其不含残余不溶性物质，并且取决于其固体含量，通过蒸发或通过本领域普通技术人员另外已知的任何其他手段的浓缩可以在接着的纯化之前进行。
所得可溶性级分最后基本上由蛋白质(50％-80％w/w)和碳水化合物(5％-25％w/w)构成。
残余生物质的升级
可溶性物质已经从其分离的残余生物质可以作为其营养分布被重新校准的整个成分经受升级。
确切地，蛋白质含量降低-因为它被部分地以肽的形式夹带在可溶性物质中-并且这有利地重新平衡了碳水化合物和脂质级分的平衡。
通过离心分离之后的残余生物质可以“还被碾磨”(根据希望的应用特性)，优先通过机械碾磨。
常规地，将生物质稳定(ph调节(约7)，添加抗氧化剂等)，并且然后在通过雾化干燥之前进行热处理(巴氏杀菌，出于细菌控制的目的)。通过蒸发浓缩的步骤可以在该热处理之前(与干燥偶联的优化)。
通过沉淀的蛋白质分离物的纯化
本发明的方法在此通过经由改变培养基的特性的沉淀导致感兴趣的肽的分离。
因此，本申请人公司建议如以下进行：
-通过改变培养基的物理化学特性促进所有的或一部分肽级分的沉淀。
如前述步骤中描述的获得的粗可溶性物质的冷却引发一部分的可溶性肽沉淀的现象。
观察到沉淀对较高分子量具有相当选择性。冷却温度低于10℃，优选地低于4℃。
某些操作条件使得有可能促进此现象：除了温度，ph必须在2.5与6.5之间并优选地接近phi，即在3与5之间。
类似地，培养基的离子强度可以适配为促进沉淀。因此，通过大大降低离子强度，“盐溶”现象可能被减弱，并且蛋白质的溶解度因此可以降低(通过降低溶剂化层)。
因此，在沉淀之前可以添加脱矿质操作。这在阳离子和阴离子树脂上进行，透析、过滤或通过本领域普通技术人员另外已知的任何手段进行。
相反地，通过大大增加离子强度，经由“盐析”现象可利用的水降低，并且以此方式蛋白质具有沉淀的倾向。该方法不是优选的，因此对于如此提取的蛋白质分离物而言，然后显著的脱矿质将是必需的。
在调制溶剂化层的同一视角下，可以通过添加溶剂(如乙醇)来降低培养基的极性(其中培养基脱水)，这将使得有可能通过大大降低其溶解度而产生更定量的蛋白质级分的沉淀。
-通过回收沉淀的级分，该级分然后任选地在干燥之前浓缩。
该沉淀的级分的分离通过简单的倾析和重相的回收或任选地通过在最佳温度条件下的离心来进行。
可以任选地在干燥之前重新调节ph。
通过雾化、冷冻干燥或通过本领域普通技术人员另外已知的任何其他手段进行干燥。
在干燥之前，通过蒸发浓缩的步骤的结合可以使得有可能在能量方面优化操作。如果使用溶剂如乙醇来进行其再循环，则其可以是尤其合理的。
利用这些方法使得有可能从残余的盐和糖中纯化具有高含量的肽和多肽的级分。
然后以按重量计大于90％获得可溶性蛋白质分离物。
残余物的升级
当分离物已经被如此提取时，可溶性相(分离之后的轻相)可以原样升级为蛋白质浓缩物(取决于其残余的蛋白质含量)或可以经受新的纯化过程以从其萃取残余肽。
当沉淀是部分的(例如在水相中部分沉淀)时，这可能取决于实验条件而是尤其合理的。在这种情况下，可以通过以与对于蛋白质分离物描述的相同的方式改变物理化学环境来提取通常具有较低分子量(更可溶)的残余肽。
例如，可以在此阶段进行溶剂如乙醇的结合，以通过大大降低其溶解度而产生此残余蛋白质级分的沉淀。
如果残余物被预先脱水，则溶剂的作用将更为有效。这可以进行到某一固体含量(通过蒸发)或进行到完全干燥(例如通过雾化)。
在沉淀之后，此级分的ph可以任选地再调节，并且然后在通过雾化、冷冻干燥或通过本领域普通技术人员另外已知的任何手段干燥之前，任选地进行通过蒸发的浓缩(这可以允许溶剂的再循环)。
从以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例旨在是说明性的，并且是非限制性的。
实例
实例1.：具有高蛋白质含量的原壳小球藻的生产
所用菌株是原壳小球藻(菌株ccap211/8d-英国苏格兰的藻类和原生动物培养物保藏中心)。
预培养：
-在500ml锥形瓶中150ml培养基；
-该培养基的组成：40g/l葡萄糖+10g/l酵母提取物。
在以下条件下进行培育：
-时间：72h；
-温度：28℃；
-振荡：110rpm(伊孚森莫特顿(inforsmultitron)培育器)。
分批并然后分批补料模式的培养
制备和初始分批培养基
-制备并过滤koh(在400g/l(41％))/nh3(在20％v/v(59％))的混合物；
-以121℃/20min灭菌20l发酵罐；
-用2个500ml的锥形瓶的预培养物接种(15的od600nm)；
-用20％v/vnh3使达到ph4.5；
-300rpm的起始振荡速度；
-通风：20l/min的空气；
-po2调节为30％；
进料
-葡萄糖：500g/l
-硫酸铵：5g/l
-磷酸氢二铵：20g/l
-磷酸：16g/l
-七水硫酸镁：12g/l
-硫酸铁：170mg/l
-硝酸钙：610mg/l
-微量元素的溶液：45ml/l
-维生素的溶液：4.5ml/l
重要的是注意到铵盐、镁盐和磷酸的原料被开发以便限制发酵培养基的盐含量并被优化以便维持最终脱色的生物质的n.6.25含量。
发酵程序
-在接种之前提供20g/l的当量
-当葡萄糖浓度是0g/l时，以指数分布形式开始进料(μ＝0.07h-1)；
-用41％koh/59％nh3混合物调节ph为5.2
-当2kg的葡萄糖已经被微藻消耗时，转化系统至用单独的nh3的ph调节。
结果：
此发酵程序使得有可能获得具有超过65％蛋白质(表达为n.6.25)的生物质。
实例2.原壳小球藻生物质的热透化和通过沉淀回收可溶性级分
根据实例1生产的生物质以105g/l的细胞固体含量收获，其中纯度为80％(纯度由生物质的固体含量与总固体含量的比例定义)。
该生物质然后：
-通过在线稀释[1:1](v水v必须(vwatervmust))洗涤并浓缩并在alfalavalfeux510板式离心机上离心，并使达到220g/l的固体含量和93％的纯度(纯度由生物质的固体含量与总固体含量的比例定义)，并然后
-用氢氧化钾将ph调节至7，
-在间接蒸汽板式换热器上用htst进行热处理使生物质达到85℃、通过保温维持1分钟，接着在二醇-水板式换热器上冷却至4℃。
以中等规模进行该热处理以便限制生物质的部分溶解，其纯度降低至68％。
根据定义，细胞外介质中可溶性物质的盐析导致该级分中细胞固体相对于总固体含量的降低。
在这个阶段，生物质的组成如下：
-总氨基酸：48.73％
-总糖：27.02％
-总脂肪酸：15.10％
-灰分和其他：9.15％
粗可溶性物质的分离
通过生物质的热透化源于盐析的可溶性物质的分离通过离心分离进行。
为了优化分离产率和质量，在第二阶段在线地进行轻微的稀释[0.5:1](v水v必须)(以具有串联的两个alfalavalfeux510离心机的配置)，其中将来自该第二阶段的上清液再循环到第一阶段。因此回收来自该第一阶段的上清液，并浓缩澄清的可溶性物质。
此“粗”可溶性物质具有以下组成：
-总氨基酸：77.3％
-总糖：17.6％
-灰分和其他：5.1％
蛋白质分离物的纯化
分离后取的可溶性物质的样品用于针对获得蛋白质分离物的纯化。
为了选择性沉淀肽级分，在搅拌下将750g的具有9.5％固体含量的粗可溶性物质置于夹套反应器中。
用磷酸将该粗可溶性物质的ph调节至4.5。
在停止搅拌之后，将温度降低至4℃。
将这些条件维持8小时。
因此进行富含较高分子量肽的重相的倾析。
然后通过在分液漏斗中简单相分离提取重相，其中质量产率为28％并具有37.2％的固体含量。
将此提取物冻干至97％的固体含量。
此分离物的组成详细如下：
-总氨基酸：95.9％
-总糖：2.44％
-灰分和其他：1.66％
该蛋白质分离物的氨基酸谱分布如下：
-谷氨酸：49.9％
-精氨酸：47.21％
-其他：2.89％
因此，该分离物的特征在于约95％的基本上由精氨酸和谷氨酸形成的氨基酸丰度(基于总氨基酸的分布分析)。
残余物的纯化
分离物的沉淀和分离后的轻相可以经受纯化，以便浓缩尚未沉淀的蛋白质级分(具有较低分子量)。
在分离之后(具有72％的质量产率)，最初具有8.9％固体含量的此相通过蒸发浓缩(15毫巴，-43℃，在buchir-215实验室旋转蒸发仪上)至45.4％的固体含量，以便使培养基部分脱水以便随后促进乙醇的作用。
在此阶段，该浓缩物具有以下组成：
-总氨基酸：68.5％
-总糖：23.46％
-灰分和其他：8.04％
为了沉淀蛋白质级分，进行通过添加乙醇的脱水。
添加一体积的乙醇(每体积浓缩物)，并且由培养基中溶解度的损失导致的蛋白质聚集几乎瞬间发生。
通过以4000g离心10分钟回收粒料(beckmancoulteravantij-20xp)。
然后将其在真空烘箱中持续24小时干燥至92.3％的固体含量。
如此获得的提取物的组成详细如下：
-总氨基酸：73.19％
-总糖：20.45％
-灰分和其他：6.36％
然后可将此提取物作为蛋白质浓缩物升级。
实例3.在溶解之后残余生物质的处理
将在实例2中获得的富含蛋白质的粗不溶性物质从残余生物质分离，该残余生物质可以用允许其升级的方法进行处理。
将提取的生物质(处于22％的细胞固体含量)在水平珠磨机模块(netzschlme500-0.6mm硅酸锆珠)上碾磨至85％的碾磨度。
然后用50％氢氧化钾将碾磨的细胞材料调节至ph7。
在spx强制循环蒸发器上的浓缩通过环连续进料进行，其中进入在真空下的具有维持在40℃下的温度的闪蒸器之前将温度调节至75℃，在该闪蒸器中发生蒸发。
将浓缩的生物质从该闪蒸器中连续地取出至spxuht模块，以便用在70℃下预热、接着在140℃下以约10秒的规模直接注入蒸汽并在真空下快速冷却至40℃进行热处理。
然后将生物质在geafiltermatfmd200雾化器上雾化至95％的固体含量。
如此获得的生物质具有以下组成：
-总氨基酸：27.1％
-总脂肪酸：27.1％
-总糖：35.8％
-灰分和其他：10％
如此获得的生物质具有的优点为具有在碳水化合物、蛋白质和脂质级分中的平衡的营养分布。如下所示，氨基酸谱此外通过选择性上游除去富含精氨酸和谷氨酸的可溶性级分而重新平衡。
该生物质中的氨基酸分布如下：
-天冬氨酸：6.05
-苏氨酸：3.91％
-丝氨酸：3.56％
-谷氨酸：23.84％
-甘氨酸：3.56％
-丙氨酸：5.69％
-缬氨酸：4.27％
-异亮氨酸：2.31％
-亮氨酸：5.87％
-酪氨酸：2.49％
-苯丙氨酸：3.20％
-赖氨酸：3.74％
-组氨酸：1.60％
-精氨酸：25.98％
-脯氨酸：3.91％