用于骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞的扩增和分化的方法和组合物与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年2月25日提交的新加坡临时申请第10201501387x号的权益，其全部内容通过引用并入到本文中用于全部目的。

本发明涉及细胞生物学、分子生物学和生物技术领域。本发明尤其涉及在细胞培养中分化、培养和扩增骨骼肌祖细胞。

背景技术：

使用肌原性干细胞作为用于各种肌肉疾病诸如骨骼肌损伤和恶病质的细胞疗法，以及用于再生医学已经尝试了数十年，但成效甚微。来源于例如诱导性多能干细胞(ipsc)的肌细胞是用于干细胞治疗以再生骨骼肌的有希望的候选物，因为他们允许异体移植。因此，为了能在治疗过程中大量应用这些肌细胞，尚需要一种用于在细胞培养中扩增和分化成肌细胞的安全且耐受良好的方法和/或组合物。

技术实现要素：

在一方面，本发明涉及一种用于从骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞制备肌纤维或肌管的组合物，其包括肉毒碱或其衍生物、脂肪酸、类固醇和其组合。

在另一方面，本发明涉及一种用于诱导骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞扩增的组合物，其包括成纤维细胞生长因子信号激动剂、notch信号激动剂、核酸和其组合。

还在另一个实施例中，本发明涉及一种用于制备肌纤维或肌管的方法，其包括将骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞与本文描述的组合物接触的步骤。

在进一步的实施例中，本发明涉及用于诱导骨骼肌祖细胞扩增的方法，其包括将骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞与本文描述的组合物接触的步骤。

附图说明

当参考详细的描述并结合非限制性实施例和附图一起考虑时，可更好地理解本发明，其中：

图1是柱形图，其显示与未处理的对照组相比，在用20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、3μmchir99021、2.5μg/mlδ-样蛋白1(dll1)和bfgf/chir/dll1组合处理的诱导性多能干细胞来源的成肌细胞中pax7mrna表达水平的比较。图中显示的数据阐明，用前述提到的化合物处理细胞导致细胞pax7表达增加，从而表明成肌细胞功能被提升了，因为已知pax7是维持成肌细胞同一性和增殖的主转录因子。

图2是热图，其描绘了在经历肌生成的诱导性人多能干细胞上实施的基于液相色谱-质谱(lc-ms)的细胞内代谢组学的结果。使用bfgf/chir/dll1进行药物处理的拟胚体(eb)富含pax7⁺成肌细胞，并且相对于没有进行药物处理的eb，显示某些代谢物诸如环腺苷酸(camp)、脱氧核苷酸(dntp)、核苷酸(ntp)和维生素b12水平较高

图3是热图，其显示在用与代谢组学调查结果相关的70种不同小分子筛选之后，与未处理的对照组相比，诱导性多能干细胞来源的成肌细胞中oct3/4、ncam、afp和pax7的mrna表达水平。图中显示的数据阐明，用诸如毛喉素、谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(ht)补充物和维生素b12的化合物处理细胞能增加细胞中的pax7和神经肌肉标志物ncam，从而表明成肌细胞功能增强，同时不增加多能性标志物oct3/4或内胚层标志物afp。

图4是折线图，其显示在暴露或不暴露于溶解于dmem培养基中的bfgf/chir/dll1和毛喉素、谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(ht)补充物和维生素b12的组合的鸡尾酒式混合物时，在来源于原代人类成体骨骼肌(hskm)、人胚胎干细胞(hes)或者诱导性人类多能干细胞(hips)的成肌细胞中的群体倍增数或增殖速率的比较。此图中显示的数据阐明，与暴露于dmem(20％fbs)培养基的任意成肌细胞相比，用前述混合物处理细胞导致种群倍增数或增殖显著增加至少2¹²倍(超过4000倍)。

图5是柱状图，其显示在暴露或不暴露于溶解于dmem培养基中的bfgf/chir/dll1和毛喉素、谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(ht)补充物和维生素b12的组合的鸡尾酒式混合物时，来源于人类成体骨骼肌(hskm)、人胚胎干细胞(hes)或者诱导性人类多能干细胞(hips)的成肌细胞中的pax7、myf5、myod1、myog、myhc的mrna表达水平。相对于在鸡尾酒式混合物中传代1代的ips-来源的成肌细胞，比较了传代6代和传代1代的两种细胞。此图中显示的数据阐明，随着时间推移至传代6代，用前述鸡尾酒式混合物处理细胞导致成肌细胞标志物pax7和myf5增加，以及分化肌细胞的标志物myog和myhc降低，从而表明所述鸡尾酒式混合物促进成肌细胞增殖并且阻止成肌细胞分化为肌细胞。与此相反，dmem(20％fbs)培养基降低成肌细胞标志物pax7和myf5，并且在一次传代期间急剧增加分化的肌细胞的标志物myod1、myog、myhc，从而表明常规的dmem培养基促进成肌细胞分化。

图6是柱状图，其显示与载剂处理(bsa0.1％)的对照组相比，在用不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、δ-样蛋白1(dll1)、δ-样蛋白4(dll4)、jagged1蛋白(jag1)、jagged2蛋白(jag2)、ht(次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)补充物，ht和dll1组合，以及ht、dll1和bfgf组合处理的诱导性多能干细胞来源的成肌细胞中pax7mrna表达水平的比较。此图中显示的数据阐明，用1×ht(10mm次黄嘌呤和1.6mm胸腺嘧啶脱氧核苷)、50μg/mldll1和20ng/mlbfgf组合处理细胞，对于增加pax7的表达(～100倍)并从而增加成肌细胞的增殖是最佳的。

图7是柱状图，其显示与载剂处理(bsa0.1％)的对照组相比，用不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、δ-样蛋白1(dll1)、δ-样蛋白4(dll4)、jagged1蛋白(jag1)、jagged2蛋白(jag2)、次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(ht)补充物，ht和dll1组合，以及ht、dll1和bfgf组合处理的成肌细胞的增殖速率比较。此图中显示的数据阐明，用1xht(10mm次黄嘌呤和1.6mm胸腺嘧啶脱氧核苷)、50μg/mldll1和20ng/mlbfgf组合处理细胞，对于增加成肌细胞增殖是最佳的(～4000倍)。

图8是热图，其描绘了在经历肌生成的人类诱导性多能干细胞上实施的基于液相色谱-质谱(lc-ms)的细胞内代谢组学的结果。使用bfgf/chir/dll1进行药物处理的单细胞层富含分化的肌管，并且相对于没有进行药物处理的单细胞层，显示较高的某些代谢物诸如肉毒碱、脂肪酰辅酶a、乙酰辅酶a和类固醇水平。

图9是热图，其显示在用与代谢组学调查结果相关的70种不同小分子筛选之后，与未处理对照组相比，诱导性多能干细胞来源的肌管中myog、myhc、myh3、myh8、myh7、myh2、myh1的表达水平。此图中显示的数据阐明，用一些化合物诸如肉毒碱、亚油酸、氟伐他汀、睾酮处理细胞能增加分化肌细胞的标志物myog、myhc、myh3、myh8和成体肌管标志物myh7、myh2、myh1的表达，从而表明成肌细胞分化为肌管的效率增加了。

图10是一对显微照片，其显示了在暴露于dulbecco改良的eagle培养基(dmem；2％马血清)对照培养基或clft(肉毒碱、亚油酸、氟伐他汀、睾酮)补充培养基8周之后，诱导性多能干细胞来源的肌管的形态和分化效率。此图中显示的数据阐明，在暴露于clft培养基之后粗大的多核肌管形成增多。

图11是一对显微照片，其显示了在暴露于dulbecco改良的eagle培养基(dmem；2％马血清)对照培养基或者clft(肉毒碱、亚油酸、氟伐他汀、睾酮)培养基3天之后，原代人类骨骼肌(hskm)成肌细胞来源的肌管的形态和分化效率。此图中显示的数据阐明，在暴露于clft培养基之后粗大的多核肌管形成增多。

图12是柱状图，其显示来源于原代人类成体骨骼肌(hskm)的肌管中的myog、myhc、myh3、myh8、myh7、myh2、myh1的mrna表达水平。此图中显示的数据阐明，用clft培养基处理细胞导致分化的成体肌管标志物myog、myhc、myh3、myh8、myh7、myh2、myh1增加，从而表明clft培养基增强了原代hskm成肌细胞向成体肌管的分化。

图13是柱状图，其显示与载剂处理(dmso0.5％)的对照组相比，在用不同浓度的肉毒碱、o-乙酰-肉毒碱、9-顺式-亚油酸、12-顺式-亚油酸、顺式-9-十八碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、亚麻酸、睾酮、雌二醇、9-顺式-亚油酸(l)和睾酮(t)的组合，以及肉毒碱(c)、9-顺式-亚油酸(l)和睾酮(t)的组合处理的诱导性多能干细胞来源的肌管中，成体慢mhc(myh7)和成体快mhc(myh2)的mrna表达水平的比较。此图中显示的数据阐明，用clt组合处理细胞，对于增加成体慢mhc(myh7)和成体快mhc(myh2)二者的表达，并从而增加成体肌管分化是最佳的。

定义

如本文所用的术语“肌生成”是指尤其在胚胎发育过程中，产生和形成肌肉组织。在肌生成的过程中，通过成肌细胞的分化和成熟形成成熟的肌细胞。

如本文所用的术语“成肌细胞”是指胚胎的(前体的)肌肉细胞，成熟的可收缩细胞来源该成肌细胞。这些成熟的可收缩细胞通常被称为肌细胞，其形成三种肌肉细胞(骨骼肌细胞、心肌细胞和平滑肌细胞)中的一种，所述肌细胞全都具有不同的特性。心肌和骨骼肌的条纹细胞通常被称为肌纤维。心肌细胞是形成心室的肌纤维，并且具有单个中央核。骨骼肌纤维(由融合的骨骼肌细胞构成)协助支撑和移动躯体，并且倾向于具有外周细胞核。平滑肌细胞控制非随意运动，例如食道和胃中的蠕动收缩。

如本文所用的术语“肌管”是指一般通过成肌细胞融合为多核纤维而形成的肌纤维。

如本文所用的术语“hes”或者“人类胚胎干细胞”是指来源于人类胚胎的未分化的内细胞团的干细胞。胚胎干细胞是多能的，意思是他们能够生长(即分化)为三个原胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的所有衍生物。也就是说，只要其被指定，则人类胚胎干细胞能够发育为人类成体的200种以上不同细胞类型中的每一种。胚胎干细胞以两个与众不同的性能为特征：他们的多能性，以及他们能无限复制的能力。多能性将胚胎干细胞与成体中发现的成体干细胞区别开来。因此，胚胎干细胞能生成体内所有细胞类型，而成体干细胞是多能的并且仅能够产生有限数目的细胞类型。此外，在限定条件下，胚胎干细胞自身能够无限增殖。这使得胚胎干细胞能够作为对于研究和再生医学二者有用的工具被使用，因为他们自身能够无限数量地产生，用于持续的研究和临床应用。鉴于他们的可塑性和潜在的自我更新的无限能力，已经提出将胚胎干细胞疗法用于损伤或疾病之后的再生医学和组织移植。可能通过多能干细胞治疗的疾病包括但不限于大量血液和免疫系统相关的遗传病、癌症和紊乱；青少年糖尿病；帕金森氏综合症；失明和脊髓损伤。胚胎干细胞的其他潜在用途包括人类早期发育的探究、遗传病的研究和用于毒理学检测的离体系统。

如本文中关于培养细胞所用的术语“原代”是指来自受试者直接被培养为细胞培养物的细胞。除了有些来源于肿瘤的原代细胞以外，大多数原代细胞培养物具有有限的寿命。与原代细胞相反，已建立的细胞系或永生的细胞系要么通过随机突变，要么通过精细修饰(诸如人工表达端粒基因)，而具有后天习得的无限增殖能力。

具体实施方案

肌肉组织工程是用于再生功能性缺陷的肌肉的一种重要途径。诸如但不限于骨骼肌的肌肉是一种高度复杂且异质化的组织，其在有机体中发挥众多的不同功能。生成肌肉的过程也被称为肌生成，其能够被分为若干不同的阶段。在胚胎肌生成过程中，中胚层来源的结构生成机体的第一肌纤维，并且在接下来的波动中，顺着这些初始的模板纤维生成额外的纤维。本领域中已知，在细胞培养中模拟成肌细胞的扩增和分化的尝试充满困难，例如，这一已知问题：在细胞不会由于细胞生存和扩增所需要的添加物和组分而在细胞培养中失去他们固有的分化潜能的情况下离体扩增成肌细胞。因此，在本说明书中解决了用于扩增成肌细胞和用于他们后续的分化的方法或组合物的需求。

使用针对原代人类成肌细胞(骨骼肌前体细胞)和人类胚胎干细胞/正在经历肌生成分化的诱导性多能干细胞来源的拟胚体二者的代谢组学和代谢物/药物筛选策略，已经鉴定了一种分子组合，其能够诱导人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞来源的成肌细胞和原代人类成肌细胞二者有效地分化为用于人类肌肉再生的肌纤维。因此，在一个实施例中，与人类胚胎干细胞中的pax7mrna的表达相比，如本文中公开的成肌细胞表达高水平的pax7mrna。

基于上述概括的方法，已经发现另外的分子组合，其能够在细胞培养中进一步使得所述细胞扩增。请求保护的组合物用于诱导人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞来源的pax7⁺成肌细胞和原代人类成肌细胞二者的大规模扩增是安全且耐受良好的，从而增强改善和治疗患者肌肉再生的能力。

基于人类成肌细胞对比人类肌管的代谢组学分析，以及针对成肌细胞的代谢物/药物筛选，已经发现用于将人类成肌细胞有效分化为肌管的组合物。与此相比，之前已经试验过的大多数其他代谢物和药物不能离体增强所述细胞的分化。已经在人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞来源的成肌细胞和原代人类成肌细胞上测试本文中所公开的组合物，因而与目前用于肌管分化的标准处理相比，在肌管分化方面导致大于10倍的更高效率。因此，在一个实施例中，本说明书公开了一种用于从骨骼肌干细胞或骨骼肌前体细胞制备肌纤维或肌管的组合物，其包括肉毒碱或其衍生物、脂肪酸、类固醇和其组合。

如本文中所用的术语“肉毒碱”是指来源于氨基酸的一种化合物，其存在于几乎所有的机体细胞中。因此，肉毒碱是针对大量化合的通用术语，其包括但不限于左旋肉毒碱、乙酰左旋肉毒碱和丙酰左旋肉毒碱。因此，在一个实施例中，所述肉毒碱或其衍生物是左旋肉毒碱或者酰基肉毒碱。还在另一个实施例中，所述酰基肉毒碱是o-乙酰肉毒碱、o-丙酰肉毒碱，或者o-丁酰肉毒碱。在一个进一步的实施例中，所述肉毒碱是左旋肉毒碱。

在一个实施例中，在组合物中存在的所述肉毒碱的浓度是但不限于10μm至1mm之间、5μm至0.1mm之间、0.5mm至1mm之间、至少50μm、至少100μm、至少250μm、至少500μm、大约20μm、大约70μm、大约80μm、大约90μm、大约95μm、大约100μm、大约120μm、大约180μm、大约200μm、大约500μm、大约800μm，或者大约1000μm。在一个实施例中，存在于所述组合物中的所述肉毒碱的浓度为至少0.1mm。在另一个实施例中，存在于所述组合物中的所述肉毒碱的浓度为大约0.1mm。还在另一个实施例中，存在于所述组合物中的所述肉毒碱的浓度为大约100μm。

如本文中所用的术语“脂肪酸”是指具有脂肪族尾的饱和或不饱和单羧酸，其可以包括大约4至大约28个碳原子。因此，在一个实施例中，所述脂肪酸是不饱和脂肪酸。如本文所公开的脂肪酸可以是具有通式cnh2n+1cooh，其中n是正整数的饱和单羧酸。在一个实施例中，n可以是大约4至大约28。所述脂肪酸的脂肪族尾可以不含有羟基官能团。所述脂肪酸可以以酯类形式天然存在于脂肪、蜡和精油中，或者以甘油酯形式存在于脂肪和脂肪油中。脂肪酸的实例可以包括但不限于油酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、瘤胃酸、异油酸、肉豆蔻酸油酸、棕榈酸油酸、α-亚油酸。其也可以包括任何其他的常规脂肪酸、其衍生物，和其组合。在一个实施例中，所述脂肪酸是ω3或ω6脂肪酸。在另一个实施例中，所述脂肪酸可以是但不限于亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、亚麻酸，和其衍生物。还在另一个实施例中，所述亚油酸可以是但不限于9-顺式亚油酸、12-顺式亚油酸、顺式-9-十八碳二烯酸，和顺式-12-十八碳二烯酸。在一个进一步的实施例中，所述亚油酸是9-顺式亚油酸。

在一个实施例中，存在于所述组合物中的所述脂肪酸的浓度是但不限于0.01mm至3mm之间、0.02至0.5mm之间、0.4mm至1.8mm之间、至少0.05mm、至少0.1mm、至少0.15mm、大约0.1mm、大约0.18mm、大约0.2mm、大约0.5mm、大约1mm、大约1.5mm、大约1.7mm或者大约2mm。在一个实施例中，所述脂肪酸以至少0.1mm的浓度存在于所述组合物中。在另一个实施例中，所述脂肪酸以大约0.2mm的浓度存在于所述组合物中。

如本文中所用的术语“类固醇”指具有排列为特殊构象的四个环的有机化合物。类固醇核心结构由十七个碳原子组成，结合于四个“稠合”的环中：三个6-元环己环和一个5-元环戊环。类固醇因连接于这个四环核心的官能团和环的氧化态而不同。所有的类固醇在细胞中由固醇羊毛固醇(动物和真菌)或者环阿屯醇(植物)制备。羊毛固醇和环阿屯醇来源于三萜角鯊烯环化。在人类中，类固醇激素诸如性激素包括但不限于雌性激素、黄体酮、雄性激素、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、醛固酮、雌二醇、雌素酮、雌三醇、皮质醇、骨化三醇、骨化二醇，以及其衍生物和类似物。如本文所用的术语类固醇包含天然类固醇和合成类固醇二者，以及其衍生物和类似物。因此，在一个实施例中，所述类固醇是性类固醇。在另一个实施例中，所述性类固醇是雄性激素或者雌性激素。还在另一个实施例中，所述类固醇是睾酮、雌二醇或其衍生物。在进一步的实施例中，所述类固醇是二氢睾酮。

在一个实施例中，在组合物中存在的所述类固醇的浓度是但不限于0.5nm至150nm之间、1nm至100nm之间、50nm至75nm之间、至少0.8nm、至少1.6nm、至少8nm、大约3nm、大约5nm、大约10nm、大约11nm、大约15nm、大约20nm、大约40nm、大约60nm，或者大约80nm。在一个实施例中，所述类固醇以至少10nm的浓度存在于所述组合物中。在一个实施例中，所述类固醇以大约10mm的浓度存在。

如本文中公开的组合物可以包括进一步的他汀类任选成分。如本文中所用的术语“他汀类”也被称为hmg-coa还原酶抑制剂，是指能抑制在胆固醇制备中起到关键作用的hmg-coa还原酶的一类降胆固醇化合物和/或分子。高胆固醇水平已经与心血管疾病(cvd)相关联。他汀类已知也能促进在肝脏中制备低密度脂蛋白(ldl)-结合受体，通常导致ldl水平显著降低和血浆中循环的高密度脂蛋白(hld)适度增加。他汀类的实例是但不限于1型或2型他汀类，其能够包括但不限于氟伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀、匹伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀和其衍生物。在一个实施例中，所述他汀类是1型或2型他汀类。在另一个实施例中，所述他汀类是但不限于氟伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀和其衍生物。

如本文中所用术语“祖细胞”是指与干细胞类似，具有分化为特异细胞类型的能力，但是已经比干细胞更特异(也就是说，它比真正的干细胞已经进一步向下进入分化途径)，并且被推动分化为其“靶标”细胞的生物细胞。祖细胞也可以被描述为是寡能的或单能的。干细胞和祖细胞之间最重要的不同之处在于干细胞能够无限复制，而祖细胞仅能够分裂有限次数。人类中发现的祖细胞的实例例如但不限于发现于肌肉中的卫星细胞、发现于表皮基底细胞中的骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、成血管细胞或者内皮祖细胞，以及胚细胞。因此，在一个实施例中，所述骨骼肌祖细胞是肌卫星细胞。在另一个实例中，所述骨骼肌干细胞是成肌细胞。

本说明书涉及用于将成肌细胞分化为例如肌管的组合物的用途。在一个实例中，如本文中公开的组合物包括肉毒碱、脂肪酸和类固醇。在另一个实例中，如本文中公开的组合物包括左旋肉毒碱、脂肪酸和类固醇。在另一个实施例中，所述组合物包括肉毒碱、亚油酸和类固醇。还在另一个实施例中，如本文中公开的组合物包括肉毒碱、脂肪酸和睾酮。在一个进一步的实施例中，所述组合物包括左旋肉毒碱、脂肪酸和睾酮。在另一个实施例中，如本文中公开的组合物包括肉毒碱、亚油酸和睾酮。在一个进一步的实施例中，如本文中公开的组合物包括左旋肉毒碱、亚油酸和睾酮。还在另一个实施例中，如本文中公开的组合物包括以大约0.1mm浓度存在的左旋肉毒碱，以大约0.2mm浓度存在的亚油酸和以大约10nm浓度存在的睾酮。

具有分化潜能的细胞的另一个来源是例如诱导性多能干细胞。如本文中所用的术语“诱导性多能干细胞”是指能够直接从成体细胞生成的一种多能干细胞类型。因为这些多能干细胞能够无限增殖，并且能在机体内产生各种其他细胞类型，诸如但不限于神经元、心脏细胞、胰腺细胞和肝细胞，因此这些多能细胞代表了能够用于替代那些由于损伤或疾病而损失的细胞的单一来源。由于诱导性多能干细胞能够直接来源于成体组织，因此他们不仅规避了对于可以从其中分离多能干细胞的胚胎的需求，而且也能够以与患者匹配的模式来制备，其意味着每个个体能够拥有他们自己的多能干细胞性，不存在与移植物或外源组织相关的免疫排斥风险。因此，在一个实施例中，所述成肌细胞来源于胚胎干(es)细胞，诱导性多能干(ips)细胞，间充质干细胞、神经干细胞或者专能干细胞。在另一个实施例中，所述成肌细胞是原代成肌细胞。还在另一个实施例中，所述骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞来源于哺乳动物。在另一个实施例中，所述骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞来源于人类、啮齿类，或者灵长类。

此外，基于人类成肌细胞的代谢组学分析和针对成肌细胞的代谢物/药物筛选，已经找到用于大规模扩增人类成肌细胞的方法以及组合物。之前的研究提示，成纤维细胞生长因子(fgf)和wnt信号在胚胎肌生成中起到重要作用。基于这一点，本说明书将成纤维细胞生长因子(碱性成纤维细胞生长因子，bfgf)和wnt信号激动剂(chir99201)与notch激动剂(dll1)与基于代谢调查结果的其他组分(例如毛喉素(camp激动剂)、谷氨酰胺、次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷，以及钴胺素相组合。与此相比，之前已经测试的大多数其他代谢物和药物不能扩增培养的成肌细胞。本文中请求保护的组合物已经在人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞来源的成肌细胞和原代人类成肌细胞二者上进行试验和测试，使得细胞培养扩增4000倍。本文中公开的进一步的组合物能够并诱导人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源的pax7⁺成肌细胞二者大规模扩增，用于例如高通量药物筛选、疾病建模和成肌细胞移植。因此，在一个实施例中，本说明书公开了一种用于诱导骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞扩增的组合物，其包括成纤维细胞生长因子信号激动剂、notch信号激动剂、核酸和其组合。

如本文中所用的术语“成纤维细胞生长因子”是指一个生长因子家族，其成员已知涉及但不限于血管生成、创伤修复、胚胎发育和各种内分泌信号通路。成纤维细胞生长因子(fgf)通常是肝素结合蛋白且与细胞表面相连的硫酸类肝素蛋白多糖相互作用，已经显示其相互作用对于成纤维细胞生长因子信号传导是必不可少的。已知成纤维细胞生长因子是各种细胞和组织的增殖和分化过程中的关键角色。如本文中所用的术语“激动剂”是指与受体结合并激活受体以产生生物响应的分子(具有化学来源、合成来源或者天然来源)。与激动剂引起作用相反，拮抗剂阻碍激动剂的作用。反向激动剂引起与激动剂的作用相反的作用。因此，“成纤维细胞生长因子激动剂”是指与成纤维细胞生长因子一样与相同受体结合并且引起相同生物反应的分子。因此，在一个实施例中，所述成纤维细胞生长因子信号激动剂是成纤维细胞生长因子(fgf)。在另一个实施例中，所述成纤维细胞生长因子信号激动剂可以是但不限于fgf1、fgf2、fgf3、fgf4、fgf5、fgf6、fgf7、fgf8、fgf9、fgf10、fgf11、fgf12、fgf13、fgf14、fgf15、fgf16、fgf17、fgf18、fgf19、fgf20、fgf21、fgf22，和fgf23。还在另一个实施例中，所述成纤维细胞生长因子信号受体激动剂是fgf2(碱性成纤维细胞生长因子，bfgf)或其衍生物。在一个进一步的实施例中，所述成纤维细胞生长因子信号受体激动剂是fgf2(碱性成纤维细胞生长因子，bfgf)。

在一个实施例中，存在于所述组合物中的所述成纤维细胞生长因子激动剂的浓度是但不限于1ng/ml至250ng/ml之间、100ng/ml至200ng/ml之间、15ng/ml至35ng/ml之间、至少5ng/ml、至少18ng/ml、至少25ng/ml、至少45ng/ml、大约2ng/ml、大约10ng/ml、大约18ng/ml、大约23ng/ml、大约35ng/ml、大约50ng/ml，或者大约150ng/ml。在一个实施例中，所述成纤维细胞生长因子激动剂以至少20ng/ml的浓度存在于所述组合物中。在另一个实施例中，所述成纤维细胞生长因子激动剂以大约20ng/ml的浓度存在于所述组合物中。

如本文中所用的术语“notch信号激动剂”是指作为针对notch信号通路的激动剂起作用的分子。notch信号通路是多细胞有机体中进化保守的通路，其在发育过程中调节细胞命运决定，并且维持成体组织体内平衡。notch通路介导近分泌细胞信号，其中信号传递细胞和信号接收细胞都受到配体-受体串扰的影响，通过所述配体-受体串扰调节神经元、心脏、免疫和内分泌发育中的大量细胞命运决定因子。notch受体通常是但不限于单次跨膜蛋白，其由功能性细胞外结构域(necd)、跨膜(tm)结构域，和细胞内的结构域(nicd)组成。notch受体通过配体结合以由deltex调控和由numb抑制的方式被激活。在哺乳动物信号传递细胞中，δ-样(dll1、dll3、dll4)和jagged(jag1、jag2)家族的成员担当notch信号受体的结合配体的实例。因此，在一个实施例中，notch信号激动剂是δ-样配体(dll)、jagged/serrate配体，或其衍生物。在另一个实施例中，所述δ-样配体(dll)选自由δ-样1(dll1)、δ-样3(dll3)，和δ-样4(dll4)组成的群组。还在另一个实施例中，所述δ-样配体(dll)是δ-样1。还在另一个实施例中，所述jagged/serrate配体选自由jagged1(jag1)、jagged2(jag2)和serrate组成的群组。

在一个实施例中，存在于所述组合物中的所述notch信号激动剂的浓度是但不限于0.1μg/ml至80μg/ml之间、5μg/ml至20μg/ml之间、15至60μg/ml之间、40至78μg/ml之间、至少1μg/ml、至少10μg/ml、至少20μg/ml、至少30μg/ml、至少40μg/ml、至少50μg/ml、至少60μg/ml、大约8μg/ml、大约18μg/ml、大约26μg/ml、大约35μg/ml、大约45μg/ml、大约48μg/ml、大约50μg/ml、大约55μg/ml、大约64μg/ml，或者大约75μg/ml。在一个实施例中，所述notch信号激动剂以至少45μg/ml的浓度存在于所述组合物中。在一个实施例中，所述notch信号激动剂以大约50μg/ml的浓度存在于所述组合物中。

如本文中所用的术语“核酸”是指生物高分子或者生物大分子，是所有已知生命形式的必需物质。核酸包，括但不限于dna(脱氧核糖核酸)和rna(核糖核酸)由被称为核苷酸的单体组成。生物核酸的基本成分是核苷酸，每个核苷酸包括戊糖(核糖或脱氧核糖)、磷酸基团和核碱基。如果糖是脱氧核糖，则所述聚合物是dna(脱氧核糖核酸)。如果糖是核糖，则所述聚合物是rna(核糖核酸)。当所有三种成分组合在一起时，他们形成核酸。核苷酸也被称为磷酸核苷酸。如本文中所用的术语“核碱基”是指被发现与核苷中的糖相连接的含氮生物化合物(含氮碱基)——脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)的基本构件。在遗传学中经常被简称为碱基，他们形成碱基对和相互堆叠的能力直接导致dna和rna的螺旋结构。因此，在一个实施例中，所述核酸来源于选自由次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、肌苷、黄嘌呤、前述含氮碱基的衍生物，和其组合组成的群组的含氮碱基。在另一个实施例中，如本文中公开的组合物包括至少一种、至少两种、一种、两种、三种、四种，或更多种核酸。还在另一个实施例中，所述组合物包括两种核酸。

在一个实施例中，在所述组合物中存在的所述核酸的浓度是但不限于0.1mm至15mm之间、1.4mm至5mm之间、1mm至10mm之间、5mm至7.5mm之间、至少0.8mm、至少1.6mm、大约1.1mm、大约1.5mm、大约2mm、大约4mm、大约8mm、大约1.2mm、大约2.8mm、大约3mm、大约6mm、大约10mm、大约11mm，或者大约12mm。在一个实施例中，所述核酸以至少1.6mm的浓度存在于所述组合物中。在另一个实施例中，所述核酸以至少10mm的浓度存在于所述组合物中。还在另一个实施例中，所述核酸以大约1.6mm的浓度存在。在进一步的实施例中，所述核酸以大约10mm的浓度存在。还在另一个实施例中，所述组合物包括两种核酸，其中一种核酸以1mm的浓度存在并且另一种核酸以0.16mm的浓度存在。在另一个实施例中，一种核酸以10mm的浓度存在并且另一种核酸以0.16mm的浓度存在。在进一步的实施例中，一种核酸以100mm的浓度存在并且另一种核酸以16mm的浓度存在。

本说明书涉及用于例如扩增成肌细胞的组合物的用途。在一个实施例中，如本文中公开的组合物包括成纤维细胞生长因子、notch信号激动剂，和至少一种核酸。在另一个实施例中，如本文中公开的组合物包括成纤维细胞生长因子、notch信号激动剂和至少两种核酸。还在另一个实施例中，如本文中公开的组合物包括碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、notch信号激动剂和至少两种核酸。在另一个实施例中，如本文中公开的组合物包括成纤维细胞生长因子、δ-样配体1(dll1)和至少两种核酸。在另一个实施例中，如本文中公开的组合物包括成纤维细胞生长因子、notch信号激动剂和至少两种核酸，其中所述两种核酸是次黄嘌呤和胸腺嘧啶。还在另一个实施例中，如本文公开的组合物包括碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、notch信号激动剂和至少两种核酸，其中所述两种核酸是次黄嘌呤和胸腺嘧啶。在另一个实施例中，如本文中公开的组合物包括成纤维细胞生长因子、δ-样配体1(dll1)和至少两种核酸，其中所述两种核酸是次黄嘌呤和胸腺嘧啶。在另一个实施例中，如本文公开的组合物包括碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、δ-样配体1(dll1)和至少两种核酸，其中所述两种核酸是次黄嘌呤和胸腺嘧啶。

在一个实施例中，如本文公开的组合物包括以大约20ng/ml的浓度存在的碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、以大约50μg/ml的浓度存在的δ-样配体1(dll1)，和分别以大约10mm和大约1.6mm浓度存在的至少两种核酸次黄嘌呤和胸腺嘧啶。

如本文中公开的组合物可以任选地包括一种或多种下述组分：wnt信号激动剂、腺苷酸环化酶、维生素和盐。

如本文中所用的术语“wnt信号激动剂”是指作为针对wnt信号通路的激动剂起作用的分子。wnt信号通路一般而言被认为是由将信号通过细胞表面受体传递到细胞中的蛋白质组成的信号传导通路的群组。已知三种wnt信号通路：经典wnt通路、非经典平面细胞极化通路和非经典wnt/钙离子通路。所有三种通路都通过wnt蛋白配体与卷曲受体家族结合而被激活，其将生物信号传递给散布在细胞中的蛋白质。经典wnt通路导致基因转录的调控。非经典平面细胞极化通路调节负责细胞形状的细胞骨架。非经典wnt/钙离子通路调节细胞中的钙离子。wnt信号通路使用邻近的细胞-细胞通讯(旁分泌)或者相同的-细胞通讯(自分泌)。本领域中已知这些信号通路在动物中是高度进化保守的，意味着这些通路在不同动物物种之间是相似的。也已知wnt信号在癌变和在胚胎发育中起作用。wnt信号激动剂的实例可以是但不限于6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1h-咪唑-2-基)-2嘧啶-氨基]乙基]氨基]-3吡啶甲腈(chir99021)、锂盐、6-溴靛玉红-3-肟(bio)、n2-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(1h-咪唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)乙基)-5-硝基-2,6-吡啶二胺(chir98014)、n-(4-甲氧基苄基)-n'-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲(ara014418)、(4z)-4-(2-氨基-4-氧代-4h-咪唑-5-亚基)-2-溴-1,5,6,7-四氢-吡咯并[2,3-c]氮杂卓-8-酮(hymenialdisine)、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3s,4r)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-苯并吡(flavopiridol)、7-丁基-6-(4-甲氧基苯基)-5h-吡咯并[2,3-b]吡嗪(aloisine)、3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-吡咯-2,5-二酮(sb216763)、3-[(3-氯-4-羟苯基)氨基]-4-(2-硝苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮(sb415286)、9-溴-7,12-二氢吲哚并[3,2-d][1]苯并氮杂卓-6(5h)-酮(kenpaullone)和其衍生物。

如本文中所用的术语“腺苷酸环化酶”是指基本上在所有细胞中具有关键调控作用的一种酶。其是已知最多源的酶：已经公开了六种不同的类型，也就是类型i至vi，都催化相同的反应，但代表不具有已知序列或结构同源性的无关基因家族。最著名的腺苷酸环化酶类型是类型iii或者类型ac-iii。ac-iii广泛存在于真核生物中并且在许多人类组织中具有重要作用。腺苷酸环化酶的所有类别都催化三磷酸腺苷(atp)转换为3',5'-环腺苷酸(camp)和焦磷酸。一般需要镁离子，其与酶的机制似乎密切相关。然后腺苷酸环化酶产生的camp通过特异的camp-结合蛋白质(转录因子、酶(例如camp依赖的激酶)，或者离子转运蛋白)充当调节信号。因此，在一个实施例中，所述腺苷酸环化酶信号激动剂是半日花烷型二萜并且优选是毛喉素或其衍生物。在另一个实施例中，所述腺苷酸环化酶信号激动剂可以是但不限于camp的非可水解类似物、异丙醇、血管活性肠肽、钙离子载体、膜去极化剂、camp刺激巨噬细胞衍生因子、巨噬细胞活化剂、磷酸二酯酶抑制剂、脑垂体腺苷酸环化酶活化肽(pacap)、霍乱毒素、前列腺素化合物、β2-肾上腺素能受体激动剂，和其衍生物。

如本文中所用的术语“维生素”是指有机体需要有限量的有机化合物和必要营养素。当有机体无法合成足够量的化合物时，有机化学化合物(或者相关的化合物组)被称为维生素，并且必须通过饮食获得。因此，术语“维生素”取决于环境和特别是有机体。例如，抗坏血酸(维生素c的一种形式)是人类的维生素，但不是大多数其他的动物有机体的维生素。按照惯例，术语“维生素”既不包括其他必需营养素，诸如膳食矿物质、必需脂肪酸或者必需氨基酸(其需要量比维生素更大)，也不包括能够促进健康的其他大量营养素，并且对于维持有机体健康是需要较少的。目前普遍认同十三种维生素。他们是维生素a、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b5、维生素b6、维生素b7、维生素b9、维生素b12、维生素c、维生素d、维生素e和维生素k。一般通过维生素的生物活性和化学活性，而不是通过他们的结构将其分类。因此，每种“维生素”是指都显示与特定维生素相关的生物活性的许多类维生素化合物。例如，一组化合物被归类为按照依字母顺序排列的维生素“通用描述符”标题，诸如“维生素a”，其包括化合物视黄醛、视黄醇和四种已知的类胡萝卜素。维生素顾名思义能够在机体内转化为活性形式的维生素，且有时也可相互转化。维生素具有多种多样的生化功能。有些维生素诸如维生素d具有激素样功能，作为矿物质新陈代谢的调节因子，或者细胞和组织生长和分化的调节因子(诸如维生素a的有些形式)。其他维生素作为抗氧化剂起作用(例如维生素e，有时是维生素c)。最大量的维生素，维生素b复合物主要作为酶辅因子(辅酶)或它们的前体起作用。辅酶作为新陈代谢中的催化剂辅助酶的工作。在这个角色中，维生素可以作为辅基的一部分与酶紧密结合。例如，生物素是参与制备脂肪酸的酶的一部分。维生素也可以作为辅酶，具有在分子之间运载化学基团或电子的功能的可拆分分子，不那么紧密地与酶催化剂结合。例如，叶酸在细胞中可以运载甲基、甲酰基和亚甲基基团。尽管辅助酶-底物反应的这些作用是维生素最著名的功能，维生素的其他功能是同等重要的。因此，在实施例中，维生素可以是维生素b复合物。在另一个实施例中，维生素可以是维生素b12或者钴胺素。

本文中也公开了使用所请求保护的组合物的方法。因此，在一个实施例中，本说明书中公开了一种用于制备肌纤维或肌管的方法，其包含将骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞与本文中公开的组合物接触。在另一个实施例中，本说明书公开了一种用于诱导骨骼肌祖细胞扩增的方法，其包括将骨骼肌干细胞或骨骼肌祖细胞与本文中公开的组合物接触的步骤。

本文中公开的组合物的其他用途包括在例如但不限于恶病质过程中解决肌肉团退化的问题，所述恶病质是例如在所有癌症、慢性肾病、慢性阻塞性肺病(copd)、获得性免疫缺陷综合症(aids)或其他慢性疾病、少肌症(老化相关的肌肉耗损)、肌肉萎缩、肌肉营养失调和糖尿病中肌肉的快速损失造成的结果。

在此说明性地描述的本发明，可以适合在不包括未在此所具体公开的元素或者元素集合、限制或者限制集合的情况下被实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等等，应该被理解为广义的，并不带有限制性。另外，在此所采用的术语和表述是被用来作为说明书的术语而不是限制，而且，这些术语和表述的使用并不是为了排除在此所显示和描述的特征或者其部分特征的任何等同术语和表述，但是被认识到的是，在本发明所要求保护的范围内，各种变更都是可能的。因此，应该被理解的是，尽管本发明已经通过优选实施方案和任选的特征来被具体描述，此处所公开的其中的经实施的发明的变更和变化可以被那些本领域中的技术人员所采用，而且这些变更和变化被认为是在本发明的范围内的。

本发明已经在此广泛并概括地描述。每个较窄种类和在公开的概括描述下的下位概念也形成本发明的一部分。其包括，本发明的带有限制性条款或者否定限制的概括描述，把任何主题从此概括中去掉，而不管被去除的材料是否在此被详细地叙述。

其他实施例在下述的权利要求和非限制性实施例中。另外，在本发明的特征或者方面根据马库什组被描述的地方，那些本领域中的技术人将认识到，本发明也因此参考马库什组中的任何单独成员或者其成员的亚组而被描述。

实验部分

通过模拟和优化肌生成过程中激发的胚胎信号通路(图1)，确定了加入标准dmem培养基(20％fbs,1％青霉素-链霉素)中的wnt/β-连环蛋白激动剂chir99021(3μm)、fgf激动剂bfgf(20ng/ml)和notch激动剂dll1(2.5μg/ml)能够特化人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞经历超过45天的肌生成，以转化为pax7+成肌细胞。这一组合仅能特化人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞瞬时转化为成肌细胞，但不能诱导pax7⁺成肌细胞的大规模扩增。为了得出成肌细胞扩增的必需代谢条件，相对于富含成肌细胞的拟胚体(eb)和分化的肌管单细胞层，在未经药物处理或经药物处理的诱导性人类多能干细胞上实施lc-ms代谢组学(图2)。

发现代谢物在人类成肌细胞中特异地增加，从而显示人类成肌细胞需要的代谢物流。这些包括环amp(camp)、核苷酸(dntp和ntp)，和钴胺素(维生素b12)的增加。

因此，测试腺苷酸环化酶激动剂毛喉素以诱导camp合成，并且施用钴胺素以检测这些化合物能否促进人类成肌细胞的扩增。还检测了谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷——其全是核苷酸合成的限速因子——是否能够促进人类成肌细胞的扩增。针对这一背景，筛选了各种其他的小分子药物和代谢物，包括氨基酸和脂肪酸，从而测试了他们对于成肌细胞扩增的效果。然后对暴露于这些70种条件的诱导性人类多能干细胞来源的成肌细胞进行实时聚合酶链式反应(qpcr)筛选各种谱系标志物(多能性标志物oct3/4、神经肌肉标志物ncam、内胚层标志物afp、肌肉标志物pax7)(图3)。

结果表明，毛喉素、钴胺素、谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷各自单独能够在fgf/wnt/notch诱导的从诱导性人类多能干细胞的肌生成过程中特异地增加pax7表达。这些结果表明，毛喉素、钴胺素、谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的鸡尾酒式混合物能够在由fgf/wnt/notch特化之后促进成肌细胞扩增。

为了验证这一假设，在dmem培养基(20％fbs,1％亲霉素-链霉素)补充碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、chir99021、dll1、毛喉素、钴胺素、谷氨酰胺、次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的鸡尾酒式混合物中培养人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞来源的成肌细胞。将如本文中所使用的来自wicell研究中心股份有限公司(麦迪逊，威斯康辛)制备和销售的wa01细胞系的人类胚胎干细胞培养至传代31代。将来自内部产生的bj1-ipsc细胞系的诱导性多能干细胞培养至传代56代。能够在该鸡尾酒式混合物中扩增人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞来源的成肌细胞至少6次传代，每次传以1：4的比例在6孔板的每个孔中分离(每代、每孔接种60,000个细胞)。这转化为初始的60,000个细胞的超过2¹²倍的扩增，或者大于4000倍的扩增(图4)。有意思的是，当对人类的原代成体成肌细胞(hskm)进行相同的处理时，观察到人类的原代成体成肌细胞发生相似的扩增，表明所公开的组合物/鸡尾酒式混合物能够扩增人类胚胎干细胞/诱导性人类多能干细胞来源的成肌细胞和原代成体成肌细胞(图4)。基因表达谱证明这些培养的成肌细胞6次传代后保持pax7⁺；myf5⁺(图5)。与此相比，dmem(20％fbs,1％亲霉素-链霉素)不能扩增成肌细胞，因为它们快速地分化为myog⁺；myhc⁺的肌管(图4和图5)。

随着进一步以不同浓度优化各种成分(图6)，获得了包含fgf2(20ng/ml)、dll1(50ug/ml)和ht补充物(10mm次黄嘌呤、1.6mm胸腺嘧啶脱氧核苷)的最佳组合物，从而从组合物中排除了其他成分。这一优化的组合物产生甚至更高水平(近百倍)的成肌细胞标志物pax7。其也超过4000倍地扩增成肌细胞的数量(图7)。

为了阐明增强肌管分化的必需代谢条件，相对于成肌细胞拟胚体(eb)和分化细胞的单细胞层，对经肌原性药物处理或未经经肌原性药物处理的诱导性人类多能干细胞实施液相色谱-质谱代谢组学(图8)。发现代谢物在人类肌管中特异增加，因而暗示人类肌管所需的代谢物流。这些代谢物包括肉毒碱、脂肪酸-辅酶a、乙酰-辅酶a和固醇的增加。

因此，测试了肉毒碱促进脂肪酸氧化，脂肪酸亚油酸、花生四烯酸和棕榈酸为脂肪酸氧化提供燃料。还测试了类固醇合成的他汀类抑制剂诸如氟伐他汀和类似睾酮或黄体酮的类固醇是否能够促进人类肌管分化。针对这一背景，也筛选了大量其他小分子药物和代谢物(包括氧化磷酸化抑制剂和维生素)，以测试他们对于肌管分化的效果。然后对暴露于这些70种条件的诱导性人类多能干细胞来源的成肌细胞针对各种成肌分化标志物进行qpcr筛选(图9)。这些结果表明，肉毒碱、o-乙酰肉毒碱、亚油酸、氟伐他汀和睾酮各自单独能够在药物诱导的从诱导性人类多能干细胞的肌生成过程中特异地增加myod、myog和myhc(肌球蛋白重链)表达。这些结果也表明，肉毒碱/o-乙酰肉毒碱、亚油酸、氟伐他汀和睾酮的鸡尾酒式混合物能够促进肌管分化。

为了验证这一假设，在标准分化培养基(dmem2％马血清,1％青霉素-链霉素；“对照”)中或者补充有肉毒碱、亚油酸、氟伐他汀和睾酮(clft)的混合物的标准分化培养基中培养诱导性多能干细胞来源的成肌细胞。该clft组合物能够加速或增强人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞来源的成肌细胞分化为肌管(图10)。有意思的是，当对原代人类成体成肌细胞进行相同的处理时，观察到原代人类成体成肌细胞肌分化为肌管的作用类似地增强了，表明我们的clft补充物能够增强胚胎干细胞/诱导性多能干细胞来源的成肌细胞和原代成体成肌细胞二者的分化(图11)。针对各种肌管标志物诸如myog和myhc的基因表达谱证明，clft组合物相对于对照培养基，能够使许多的肌原性的分化标志物增强10倍以上(大于10倍)(图12)。

随着进一步以不同浓度优化各种脂肪酸的变型(图13)，建立了包括左旋肉毒碱(0.1mm)、9-顺式-亚油酸(cla，0.2mm)和二氢睾酮(dht，10nm)的最佳组合物，从而从混合物中排除了氟伐他汀。这一组合物产生甚至更高水平(近百倍)的慢抽搐的肌球蛋白重链标志物和快抽搐的肌球蛋白重链标志物(分别为myh7和myh2)，表明成肌细胞向肌管的分化已经完成。