本发明涉及一种水溶液形式的诊断组合物，用于在内窥镜检查分析期间获取的活检样品中极快速地检测幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)的存在，以及用于评价其细菌载量。
背景技术：
一些胃肠道疾病(例如胃溃疡或十二指肠溃疡，尤其是活动性慢性胃炎)与幽门螺旋杆菌在胃粘膜的部分定植或弥漫性定植紧密相关。该细菌也被称为幽门弯曲杆菌(campylobacterpylori)，其通过尿素酶降解尿素。几十年前就已经知道存在于人胃粘膜的活检片段的幽门螺旋杆菌(freedberga.s.和barronl.e.“在人胃粘膜中存在螺旋菌”(thepresenceofspirochetesinhumangastricmucosa),1940,am.j.dig.dis.,7:443-5；marshallb.j.“在活动性慢性胃炎中的上皮细胞上的未知的弯曲杆菌”(unidentifiedcurvedbacilliongastricepitheliuminactivechronicgastritis),1983,lancet,1:1273-5)，并且其与b型慢性胃炎的因果相关性被广泛记载(rauws等人.1988,gastroenterology,94:33-40)，以及其参与消化性溃疡的发病机制也被广泛记载(petersonw.l.幽门“螺杆菌与消化性溃疡疾病”(helicobacterpyloriandpepticulcerdisease),1991,neweng.j.med.,324:1042-8)。幽门螺旋杆菌还被认为是十二指肠溃疡复发的风险因素(coghlanj.g.等人,“幽门弯曲杆菌和十二指肠溃疡复发12个月随访研究”(campylobacterpyloriandrecurrenceofduodenalulcersat12-monthfollow-upstudy).lancet1987；2:1109-1111)。
因此，根除该细菌使得胃炎的组织学得到了改进，增加了溃疡愈合的可能性并且对预防复发有效。
诊断幽门螺旋杆菌在胃粘膜活检物中的存在的最佳方法由组织学培养观察结合细菌培养观察构成(petersonw.l.,“幽门螺杆菌与消化性溃疡疾病”(helicobacterpyloriandpepticulcerdisease),1991n.engl.j.med.,324:1043-1048)，虽然，在一些研究中，细菌培养观察的价值受到广泛质疑(martineze.,marcos,a.,“幽门螺杆菌与消化性溃疡疾病”(helicobacterpyloriandpepticulcerdisease),1991,lancet,325:737)。
幽门螺旋杆菌的存在还可通过寻找血液抗体来确定。然而，在根除细菌后数月该测试可能仍然保持阳性，或者在与其他抗体交叉反应的情况中出现10-15％的假阳性。
确定幽门螺旋杆菌存在的另一种方法为呼吸测试c13，该方法就同位素材料和必要的仪器而言均是昂贵的。
有效的替代性的测试使用特定的细菌尿素酶活性。为此，将粘膜活检物在含有尿素和ph敏感颜色指示剂的介质中培养(owenr.j.等人,“通过胃弯曲菌快速水解尿素”(rapidureahydrolysisbygastriccampilobacters),1985,lancet,1:111)。样品中的细菌尿素酶通过尿素的水解释放氨，并且当生成的尿素的量足以使介质的ph值上升时，指示剂改变了颜色。
尿素酶不通过人体生成，事实上，仅偶尔地，活检片段可能含有源自其它细菌的尿素酶，然而，其它菌株(例如变形杆菌(proteus)、假单胞菌(pseudomonas)和大肠杆菌(e.coli))含有的尿素酶的水平要低得多(kasperg.,dickgiessern.“从胃上皮分离与幽门弯曲杆菌不同的弯曲菌样细菌”(isolationfromgastricepitheliumofcampylobacter-likebacteriathataredistinctfromcampylobacterpyloridis),1985lancet8420:111-112)。
与该机理一致的是，已经开发了各种关于粘膜活检物的诊断测试。这些诊断测试包括marshall(第4,748,113号美国专利，1988年5月31日)和jackson(第5,439,801号美国专利，1995年8月8日)要求的技术方案。
二者均描述了一种测试组合物，该测试组合物含有尿素，所述尿素通过-幽门螺旋杆菌尿素酶生成氨。该反应造成介质的ph增加，这通过指示剂颜色变化来指示。
在marshall测试中，培养介质为含有酚红作为ph指示剂的凝胶，当从尿素中释放的氨使ph增加到至少6.9时，指示剂从黄色变为红色。缓冲反应系统以使受血液或肠液污染的片段不升高ph值而造成假阳性结果。该测试要求培养(incubation)时间在30-40℃下为3小时，并且在室温下再额外要求培养最高达21小时。约75％的受幽门螺旋杆菌感染的活检物在20分钟内示出了阳性结果，并且90％在3小时内示出了阳性结果。然而，为了验证阴性结果，需要24小时。
jackson测试也在琼脂凝胶中进行，在该测试中，在不存在缓冲系统的情况下，使用两种颜色指示剂(甲基红和溴百里酚蓝)以及防腐剂(对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)。超过95％的测试在20分钟内为阳性，一些测试可能花费一个小时，但是所有的测试在4小时内均变为阳性。因此，进行该方法不需要如marshall测试一样等待24小时以保证最终的结果。此外，从桃色到浅绿、深绿、浅蓝和深蓝的宽泛的颜色范围还提供了感染水平的半定量。另外，尿素酶反应在ph低于6.2时发生，这增加了测试的特异性，因为除幽门螺旋杆菌外的微生物(例如变形杆菌、假单胞菌和大肠杆菌)在酸性ph下不反应。
已经开发了其它测试：clo-
具体地，示出的灵敏度对应：
clo-测试：在5分钟时15％；在30时60％；以及在24小时的88％；
pronto-dry：在5分钟时30％；在10分钟时50％；以及在60分钟时90％；
rut：在5分钟时70％；在24小时的91％；
mru：在5分钟时85％；在30分钟时92％。
因此，虽然这些测试的应答时间即使低于之前的应答时间，但是仍不能确保门诊的可执行性。
具体地，上文提及的方法中确定的缺点可概括在以下几点中：
1)marshall测试
具有高尿素酶活性的活检物不多久就在片段周围显出红颜色。然而，在存在低酶活性的情况中，低量的氨显著延长了获得颜色变化所必需的培养时间。这一缺陷是由于用作指示剂的酚红不具有足够的酸性变色范围(6.9至8.4，同时pka7.9)。在ph大于6.5时进行该测试可导致因幽门螺旋杆菌中存在不同的细菌(变形杆菌、假单胞菌、大肠杆菌)的假阳性反应。这些方面除了延长了所需的培养时间外，还降低了测试的灵敏度和特异性。
2)jackson测试：
继ph变化后的颜色谱不总是很好区分，尤其是在5.5-7.0的中间ph值时，这一特征在存在低尿素酶活性的情况下使得结果不确定(浅绿：阴性；深绿：阳性)。
应进一步改进现有的测试，从而增加其灵敏度，缩短测定时间和减少可能的假阴性结果，尤其是考虑可能造成假阴性结果的因素，例如：
-感染的片段化分布：疾病可能具有斑片分布，为了避免假阴性结果，应该获取并分析更多的胃活检物。
-肠化生：幽门螺旋杆菌不定植肠化生区，因此，这些区域的广泛存在可导致假阴性结果；另外，在这种情形中，进行多次粘膜活检是合适的；
-服用抗生素和抗分泌剂：幽门螺旋杆菌对摄入的这些药剂是敏感的，这些药剂可抑制但不会破坏感染；
-最合适的ph指示剂的选择。
ph指示剂为弱酸或弱碱，根据溶液的ph改变它们的分子结构，随之造成颜色改变。为了获得合理的灵敏度，指示剂须从非离解形式的浅色，例如黄色，变色为离解形式的深色，例如红色或蓝色。颜色变化的点对应于其中未离解形式的量等于离解形式的量(pka＝ph)并且指示剂呈中间颜色的情况。事实上，颜色变化的点足够地宽以被认为是包括了ph＝pka±1值的范围的颜色变化范围。因此，选择的指示剂应该具有比溶液的初始ph稍高的pka。
意大利专利申请itrm20030399公开了一种用于诊断测试中的组合物，其开发了水溶液形式的尿素酶，该水溶液形式的尿素酶能够快速揭示在于活检片段中存在幽门螺旋杆菌。因为其增加的灵敏度显著缩短了应答时间，因此该发明提供了一种完全动态使用的测试方案。该组合物含有在ph6.8的去离子水中的10％尿素；和至少一种ph指示剂，该ph指示剂的pka在6.0至7.0之间的范围内并且浓度为确定最终ph为约5的浓度。然而，该测试也具有某些限制：除了在高至中等细菌载量的情况下，在5分钟反应时间内有高度敏感度(100％)外，对于低细菌载量，只有55％的测试样品在5分钟内进行反应，以及90％在30分钟内改变颜色。另外，两种不同指示剂的使用并不总是对接近于反应物pka的中间ph值(7.0至7.9)时的轻微颜色变化提供易于读取的结果，有时在受幽门螺旋杆菌轻微感染的情况下会造成对结果存在质疑的解释。此外，10％尿素不保证足够酸性的ph以适于长期储存诊断试剂。
还应考虑的是，近年来，广泛使用的通用抗生素治疗增加了低幽门螺旋杆菌载量的检测，这进一步降低了测试的灵敏度。
因此，仍然强烈感到需要开发新的试剂和方法以在胃镜检查期间定期检测活检物中幽门螺旋杆菌的存在，从而降低成本和缩短执行时间，替代常规诊断技术(组织学测试、培养测试、尿素呼吸测试)，所述新的试剂和方法使用基于尿素酶活性的改进的测试，在胃粘膜组织活检物上进行。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种用于诊断用途的改进的组合物，从而能够以快速及可靠的方式检测活检片段中幽门螺旋杆菌的存在，即使在细菌载量低的情形中也是如此。
提供一种用于诊断测试的改进的组合物，从而能够快速并可靠地检测活检片段中幽门螺旋杆菌的存在，即使在细菌载量低的情形中也是如此，该技术问题通过本发明的组合物得到解决，所述本发明的组合物的特征在于，其包含在盐水中的5％的尿素和溴百里酚蓝。
令人惊奇的是，已经发现与现有技术水平的组合物相比，诊断组合物中存在的尿素的量得到了显著的下降，诊断测试改进了敏感度和特异性方面的性能，其稳定了ph并且允许以更加快速和更加可靠的方式检测基于胃溃疡和十二指肠溃疡的细菌感染的存在。
发明详述
应注意，出于本发明的目的，表述：诊断组合物、诊断试剂、酶底物在本文中用作同义词。
本发明的第一目的在于提供一种水溶液形式的组合物以进行诊断测试，从而能够在胃镜检查分析期间快速检测胃粘膜活检物中幽门螺旋杆菌的存在，所述组合物包含在生理溶液(0.9％氯化钠)中的5％尿素和pka等于7.0的ph指示剂。
根据本发明的组合物的最终ph值为约4.8。
根据本发明，所述ph指示剂为溴百里酚蓝，其为一种弱酸性的有机化合物，其常规形式(酸)为黄色，而其共轭碱为蓝色。由于两种形式之间的这一颜色差异，溴百里酚蓝被用作ph指示剂。此外，用于根据本发明的组合物的溴百里酚蓝具有合适的ph值的范围，以用于与反应生成的氨的存在相符合的颜色变化(在黄色-绿色-蓝色范围内)，从而通过简易地检测颜色变化来区分存在的细菌载量(绿色＝低；蓝色＝强烈)。
这一技术特征与市场上可获得的使用酚红作为颜色指示剂的大多数测试相比无疑是有优势的，因为目前最常见的中等至低的细菌载量决定了颜色变化缓慢，因此，通常没有很好地进行定义。这是因为从黄色(阴性)到深红色(阳性)的颜色变化经过了粉红渐变，这导致不能明确地将活检物的极浅的粉红色和由于弱阳性导致的粉红色区分开来。
根据本发明，组合物中溴百里酚蓝的量在0.5％至10％的范围内。优选地，组合物中溴百里酚蓝的量在2％至6％范围内，在本发明的一个特别优选的实施方式中，组合物中的溴百里酚蓝的量为4％。
根据本发明的诊断组合物非常简单，不需要包括防腐剂、抗微生物剂或缓冲剂。这一特征有助于尿素的降解反应更快，并因此还有助于使检测速度最大化。使用本发明的组合物，可从活检物外周观察到颜色变化，颜色梯度指示了样品中存在的感染载量(infectiousload)，这使得在内窥镜检查结束时就已得到了诊断。
虽然使用本发明组合物的尿素酶任选地在碱性ph下进行，但是有利的是，阳性反应从小于6.2的ph值起就开始出现。这增加了测试的特异性，条件是除幽门螺旋杆菌外的一些其他微生物，例如变形杆菌、假单胞菌和大肠杆菌虽可存在于活检切片中，但是它们在酸性ph溶液中不反应，从而避免了假阳性应答的可能性。
根据本发明的组合物是极其简单和特别稳定的，这使得能够生产一种分析系统，其中，诊断试剂的量可以变化并且限制为最小必需量以确保活检样品被完全浸没。以这种方式，在反应介质中生成了高浓度的氨，这造成ph值迅速升高，因而快速检测到尿素酶。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述诊断组合物在使用前即刻制备，通过向溶液中加入0.5％-10％溴百里酚蓝的生理溶液，更优选地，加入4％溴百里酚蓝的生理溶液进行制备，所需的尿素的量为获得5％的终浓度。
本发明的改进的诊断组合物的特征在于比现有技术的诊断组合物的灵敏度更高，因此特异性更高，以提供反应的更优的性能，所述反应基于允许使用一半量底物(即尿素)的诊断方法。在专利申请itrm20030399中描述的组合物含有约10％的尿素和两种ph指示剂——1％溴百里酚蓝和2％酚红，与该组合物的使用相比，本组合物的检测灵敏度和特异性均有所增加并且接近于100％。
此外，特别有趣的是通过特别选择尿素溶于其中的溶剂介质所确定的令人惊奇的效果，这是因为溴百里酚蓝在生理溶液中比在用作溶剂介质的去离子水或水醇溶液中结果更加稳定和敏感。使用水-醇溶液(60％盐水和40％乙醇)作为尿素粉末和ph指示剂的溶剂介质对染料溴百里酚蓝的溶解显示出积极的影响，但是对检测反应的灵敏度和特异性具有负面影响，尤其是在使用质子泵抑制剂和其它药物的那些患者中，在内窥镜检查的前几天普遍不推荐摄入质子泵抑制剂和其它药物。
具体地，与现有技术的组合物相比，使用本组合物产生的主要改进包括：
-即用溶液的ph的稳定性更高；
-保持100％的特异性；
-在高-中等细菌载量的情形中，在5分钟内保持100％灵敏度；对于低细菌裁量，在5分钟内，灵敏度增加到最高达90％。
-更好地识别颜色变化，从而改进了中间ph的读取；
-对感染载量进行了更好的分类(低＝活检物周围绿色；中等＝活检物周围蓝色；高＝深蓝色散布)。
此外，液体制剂允许更加快速地扩散由尿素酶反应产生的氨，并且不存在缓冲液不会降低反应速率，因而缩短了诊断组合物的反应时间。
本发明的另一个目的在于提供一种组合物用于在胃镜检查期间快速及可靠地诊断细菌幽门螺旋杆菌，所述组合物包含在ph＝4.8的盐水(0.9％氯化钠)中的5％尿素和溴百里酚蓝，溴百里酚蓝在0.5％至10％的范围内，优选在2％至6％的范围内，甚至更优选4％溴百里酚蓝。
本发明的另一个目的为一种诊断试剂盒，以通过评价活检组织中尿素酶的活性，超快速检测在胃镜检查期间采集的胃粘膜活检物中幽门螺旋杆菌的存在及细菌载量，所述诊断试剂盒包含：
-具有凹形圆形底部的透明管，其由聚乙烯或具有类似性质的任意其它塑料材料制成，该透明管含有1ml的0.5-10％的溴百里酚蓝的生理溶液；该管配有螺旋盖，该螺旋盖也由塑料材料制成，其具有小槽，通过隔膜封闭，该小槽含有必需量的粉末尿素，因此，最终溶液为：在ph为4.8的盐水溶液(0.9％氯化钠)中的5％尿素、0.5-10％的溴百里酚蓝；
-两个粘贴标签，一个用于登记待粘附到所述管外部的数据，另一个具有在报告中输入的产品批号的说明以提供用于检测幽门螺旋杆菌的产品的认证；
-带有技术注解和使用说明的说明书。
处于使用前的形式的诊断组合物，其中需要将尿素粉末加入到含有溴百里酚蓝的盐水溶液中，即，当溴百里酚蓝与尿素仍然是分离时，所述诊断组合物在-9℃和45℃的极限温度下具有两年的储存期限；当两种组分——溴百里酚蓝溶液，其在盐水溶液中；和尿素粉末——混合在一起时，所述组合物在室温下稳定48小时，在+4℃下稳定多于两周。
本发明的另一个目的为一种用于在胃镜检查期间超快速检测胃粘膜活检物中幽门螺旋杆菌的存在及细菌载量的方法，所述方法通过使用诊断组合物评价活检组织样品中尿素酶的活性进行，所述诊断组合物为：在生理溶液中的5％尿素和0.5-10％溴百里酚蓝，优选4％溴百里酚蓝，所述方法包含以下步骤：
-使活检样品与诊断溶液接触，所述诊断溶液为ph等于4.8的5％尿素和溴百里酚蓝的生理盐水溶液，这通过完全浸没于毫升(aml)的溶液中进行，
-等待5分钟颜色变化以读取结果。
在本发明一个特别优选的实施方式中，用于通过评价活检组织样品中尿素酶的活性，在胃镜检查期间超快速检测胃粘膜活检物中幽门螺旋杆菌的存在及细菌载量的方法，其实施通过使用诊断试剂盒进行，这也是本发明的目的，使用的诊断组合物包含在生理溶液中的5％尿素和0.5％-10％溴百里酚蓝，优选4％百里酚蓝，所述方法包含以下步骤：
-推动管的盖子以造成隔膜的破裂并接着开启含有尿素粉末的内部储器，以使尿素粉末溶于溴百里酚蓝溶液中；
-摇动管以混合各组分；
-旋开盖子并将一片或两片胃粘膜活检物放置(deposit)在液体诊断组分中，不进行摇动；
-等待5分钟颜色变化。
在细菌载量非常低的情况下，所述测试可能花费15分钟。
如果总的溶液的颜色迅速扩散成浅绿色，则液体可能被存在于进行活检用的钳子的表面上的血液或胆汁污染。在这种情况下，建议从管中取出活检物并将其浸入新的管中。
使用根据本发明的诊断组合物和相关的方法对在胃镜检查期间进行测试的操作者和患者来说均确定了相当大的优势和益处，并且积极地影响了患者的诊断结果和治疗结果。
使用根据本发明的诊断组合物及其相关的方法允许在胃粘膜中确定细菌载量，从而提供低、中等、高的感染水平的证据，甚至在患者在内窥镜检查的日子内服用质子泵抑制剂和禁忌药物的情况下也是如此。
实验研究
实施例1——通过使用根据本发明的诊断组合物进行的临床研究，所述根据本发明的诊断组合物包含在盐水中的5％尿素、4％的溴百里酚蓝。
对318名患者进行临床试验以证明根据本发明的组合物及相关方法的有效性，特别地，该研究旨在证明所述组合物的高灵敏度也针对服用了抗胃分泌保护剂——兰索拉唑(lansoprazole)型的那些患者，抗胃分泌保护剂降低了酶-尿素酶活性并且使酶反应在胃镜检查期间或紧接着在胃镜检查之后进行得更为缓慢。
将该研究招募的318名患者分成两组。第一组包括255名患者，其未服用抗胃分泌保护剂药物；63名患者服用了抗胃分泌保护剂。为了验证根据本发明的诊断测试的结果，使所有患者在相同时间内用三种不同技术进行幽门螺旋杆菌的存在的分析：
-根据本发明的方法对活检物进行快速测试，
-活检物的组织学检查；
-呼吸测试(尿素呼吸测试)。
根据本领域专家已知的技术进行活检物的组织学检查和呼吸测试(尿素呼吸测试)，同时根据本发明的方法对活检物进行快速测试。
具体而言，从胃粘膜中获取约1mm3大小的活检物，并将其置于含有本发明的诊断组合物的所述测试管中以待分析。诊断组合物通过以下获得：将合适量的尿素混合在溴百里酚蓝溶液中以具有最终的即用溶液，所述最终的即用溶液为ph等于4.8的5％尿素和4％的溴百里酚蓝的生理溶液。
结果
使用根据本发明的组合物的诊断测试示出了100％的特异性和93％的整体灵敏度，其中，对于中等-高幽门螺旋杆菌载量来说，灵敏度为100％，对于极低幽门螺旋杆菌载量来说，灵敏度为92％。
在第一组的未服用抗胃分泌保护剂药物(兰索拉唑)的295名受测试患者中，185名患者结果为未受幽门螺旋杆菌感染影响，110名患者结果为受到感染；通过该测试获得的结果已经通过用其它两种诊断方法获得的数据得到证实。因为快速测试为阴性，并且在24小时后读取仍是阴性，而组织学测试和呼吸测试显示出了低水平的阳性结果(假阴性)，因此九例显示出了结果差异。
在第二组中，41份活检物未发现幽门螺旋杆菌，62份活检物受细菌感染。4份活检物得到了怀疑结果：它们为阴性，如果在24小时以后读取，它们仍然是阴性，而呼吸测试和/或组织学检查则为弱阳性。
因此，在398名被招募的患者中，385名显示出该测试与其它测试中的至少一个测试快速相关，因此，该测试显示出了100％特异性及93％的整体灵敏度。
在两组中，服用及未服用抗胃分泌保护剂药物之间均未显示出灵敏度和特异性方面的差异。
该研究结果证明了根据本发明的组合物和方法是检测幽门螺旋杆菌的实用工具，所述组合物和方法可在胃镜检查研究期间直接进行，结果具有高的灵敏度和特异性，二者分别为93％和100％；特别有用和有利的是，即使是在胃镜检查的日子里服用了抗分泌剂的患者中，结果也具有高度可靠性。
实施例2——通过使用诊断组合物进行的临床研究，所述诊断组合物含有10％尿素，其在ph6.8的去离子水中；1％的溴百里酚蓝和2％酚红。
通过使用如专利申请itrm20030399所述的诊断组合物，所述组合物含有10％尿素，其在ph6.8的去离子水中；1％的溴百里酚蓝和2％酚红，与组织学数据相比获得了88％的整体灵敏度，组织学数据被认定为诊断细菌存在的标准参考。在这一情况中，研究招募了86名患者，他们未用抗胃分泌保护剂药物进行治疗；在这86名患者中，29名结果为没有幽门螺旋杆菌，57名结果为受到感染。在这些57份受感染的活检物中，7份具有高的细菌载量，27份呈现中等载量，23份呈现低的感染水平。在这23份具有极低的细菌载量的活检样品中，7份在使用含有以下物质的组合物的诊断测试中未进行反应，所述组合物含有10％尿素，其在ph6.8的去离子水中；1％的溴百里酚蓝和2％酚红。