多孔性纤维素介质的制造方法与流程

本发明涉及多孔性纤维素介质的制造方法。
背景技术：
：以纤维素为代表的多糖及其衍生物已被利用于各种用途。就它们的微多孔体而言，其自身可作为吸附剂，另外，可以通过向其表面进行某些化学修饰，而赋予吸附、分离的功能。以下举出其一个例子。由于酶利用的普及、生物医药的开发等，以蛋白质为首的生物高分子的分离纯化成为了重要的技术课题之一。用于解决该课题的重要方法为色谱。在色谱中，可使用将与目标物或者作为除去对象的杂质发生相互作用的某些原子团(常常将这些称为选择物)结合至称为基质的固体而成的分离剂。没有蛋白质的非特异性吸附这一点，是作为用于分离生物高分子的材料极其重要的特性，因此，多糖类作为基质而得到了重用。另外，由于多糖类在分子内具有较多的羟基，因此，可以以此为立足点而经由醚键、酯键容易地与选择物结合，这也成为多糖类得到重用的重要原因。另外，为了分离纯化生物高分子，通常采用以下方法：将与目标的分子具有一定亲和性的选择物结合至基质，在吸附目标分子后，用一定的方法使被吸附的目标分子游离而进行回收。为了获得大量的目标分子，可以结合大量的选择物，进而，为了使该选择物与分子量大的生物高分子有效地发生相互作用，要求基质具备使得目标分子能够自由出入的多孔性结构。换言之，将该基质填充于柱并进行空间排阻色谱时，需要显示出大于待纯化分子与配体合起来的尺寸的排阻界限。这样的基质多数情况下是以粒子的形式填充于被称为柱的管中来使用的。但是，近年来备受瞩目的新的形态是被称为整块(monolith)的一体的多孔体。其通过容纳于被称为毛细管的细管、柱等容器中而被用于相同的用途。比较薄的面积大的整块也可以作为过滤膜使用。作为这样的基质的易使用性的原因，除了对分离对象的选择性以外，还可列举其高度的物理强度。即，弹性模量低的基质在色谱、过滤中在液体、气体流过时，会受到压缩变形、断裂，结果会导致色谱柱内的液体的流动变得不均一，进而发生阻塞，由此会导致柱的分离效率显著降低。从这方面考虑，高度的物理强度为重要的特性，在这点上，纤维素即使在多糖类中也是优异的材料。此外，纤维素存在以下优点：作为多糖的一般的特征在其表面具有醇性羟基，因此可以通过化学反应结合多种原子团，及可以大量地、比较廉价地获取高纯度的原料等。从以上的原因考虑，开发了以生物高分子的分离纯化为主要目的的多孔性纤维素粒子。作为用于制造该多孔性纤维素粒子的方法，多为将纤维素以某些方法溶解之后进行再生的方法，但也发现了若干种将有机酸酯作为起始原料的方法。与将纤维素本身直接溶解时存在需要特殊溶剂、溶液的粘度非常高等困难相对地，这些方法利用了以下优点：有机酸酯能够溶解于众多溶剂，纤维素的有机酸酯可以利用与各种有机酸的各种结合率或聚合度，以稳定的品质供应于工业生产，还可以容易地分解酯键来对纤维素进行再生等。作为这样的纤维素粒子的制造方法，例如在专利文献1中记载了下述内容：将使纤维素有机酸酯溶解于诸如卤代烃那样的有机溶剂中而成的溶液分散于水性介质中，使其形成酯溶液的微小液滴，向其中添加铵盐等水解促进剂进行该酯的水解，从而形成纤维素微小粒子。另外，在专利文献2中记载了下述方法：将纤维素脂肪酸酯与纤维素脂肪酸酯的胶凝剂溶解于有机溶剂而制成溶液，将该溶液搅拌添加至水性介质中并使其形成液滴，进一步添加促凝剂，将液滴中的纤维素脂肪酸酯制成凝胶粒子，从生成的粒子中除去胶凝剂、促凝剂及溶剂，由此制造多孔球状粒子。在专利文献3中记载了下述方法：将纤维素溶解于多聚甲醛和二甲亚砜的混合液中，将该溶解液分散于分散介质后，作为凝固剂投入硅化合物使纤维素的分散液滴凝胶化而凝固，从而制作粒状纤维素凝胶。在非专利文献1中记载了下述内容：将乙酸纤维素溶解于水溶性的有机溶剂(丙酮与dmso的混合溶剂)并使其分散于水中，由此使包含乙酸纤维素的溶液与水接触而凝固，从而形成多孔性的粒子。在非专利文献2中记载了将二乙酸纤维素溶解于dmso，之后添加无水硫酸钠并搅拌，将混合物投入酸凝聚浴槽(盐酸)而获得纤维素粒子(珠)。另外，记载了为了提高珠的多孔性，将采集后的珠浸渍于大量温水中来除去硫酸钠的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开昭62-277401号公报专利文献2：日本特开昭63-95237号公报专利文献3：日本特开昭57-159801号公报非专利文献1：chen,l.f.；tsao,g.t.biotechnol.bioeng.1976,18,1507非专利文献2：bai,y.-x.；li,y.-f.carbohydr.polym.2006,64,402非专利文献3：a.j.reuvers等,j.polym.sci.,1986,24,793技术实现要素：发明要解决的问题在专利文献1和2的技术中，在所有方法中均使用了包含卤代烃的溶剂，且为了在制作粒子时利用汽化进行该溶剂的除去，均需要较大的能量和用于回收已汽化的溶剂的装置。另外，在使用了专利文献2、3中记载的那样的促凝剂、凝固剂的方法中，在形成的液滴中在与促凝剂等接触的部分会形成致密的纤维素脂肪酸酯的膜，由此有时会变为走形的粒子形状。因此，在如专利文献2、3中记载的那样在形成液滴后进行凝胶化的情况下，存在反应产生不平衡的可能性。另外，在非专利文献1中记载了使用甲醛和盐酸使已形成的珠发生交联反应从而使珠交联。另外，在非专利文献2中记载了为了在粒子中设置细孔而使用细孔形成剂。在非专利文献1及非专利文献2中均包括在形成粒子时对其表面进行处理的工序，而为了获得多孔性纤维素粒子，需要将用于表面处理的物质除去。本发明的主要课题在于提供对于溶解有成为原料的乙酸纤维素的溶液，不使用特别的胶凝剂而制作多孔性纤维素介质的技术。即，本发明以提供下述技术为课题：在可以应用于分离剂的多孔性纤维素介质的制造中，对于包含成为原料的乙酸纤维素、碱性物质及含有水的溶剂的均一组合物，通过使其发生乙酸纤维素的脱乙酰基反应，从而在不伴随物质向体系外的移动的情况下发生凝胶化，由此得到多孔性纤维素介质。解决问题的方法本发明是鉴于上述情况而完成的。在论文(非专利文献3)中已有如下报道：在包含含有水的溶剂、和乙酸纤维素的均一组合物达到某温度以下时，会发生相转变(液态-凝胶态)而凝胶化。而本发明人等发现，通过制成与其不同的均一组合物，使该均一组合物包含乙酸纤维素、碱性物质、及含有水的溶剂，并针对该乙酸纤维素使其发生脱乙酰化，可以不依赖于非溶剂(胶凝剂)的添加等而获得块状、粒子状等与目标相符的形状的凝胶，获得保持多孔性结构并具有优异的特性的纤维素介质。即，本发明的要点如下所述。[1]一种多孔性纤维素介质的制造方法，其包括：准备包含乙酸纤维素、碱性化合物、及含有水的溶剂的流动性的均一组合物，通过乙酸纤维素的脱乙酰基反应使该组合物发生凝胶化的工序。[2]一种球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其包括：将包含乙酸纤维素、碱性化合物、及含有水的溶剂的流动性的均一组合物分散于与该均一组合物不混合的分散介质而得到分散液，通过所得分散液中包含的乙酸纤维素的脱乙酰基反应而使上述组合物发生凝胶化，从而形成由上述组合物形成的凝胶化粒子的工序。[3]根据[2]所述的球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其包括：在上述工序后，将用于分离所得凝胶化粒子的分离溶剂添加至形成有凝胶化粒子的分散液中，将凝胶化粒子分离至分离溶剂中的工序。[4]根据[3]所述的制造方法，其中，上述分离溶剂为水、甲醇、乙醇、2-丙醇、乙酰胺、甲酰胺、或这些溶剂中至少两种的混合物。[5]一种多孔性纤维素整块的制造方法，其包括：将包含乙酸纤维素、碱性化合物、及含有水的溶剂的流动性的均一组合物加入成型容器中，通过乙酸纤维素的脱乙酰基反应，在该成型容器内使均一组合物发生凝胶化的工序。[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制造方法，其中，上述均一组合物中的含有水的溶剂包含有机溶剂，该有机溶剂是与水混合、与饱和烃不混合的溶剂。[7]根据[6]所述的制造方法，其中，上述有机溶剂为非质子性极性溶剂。[8]一种吸附体的制造方法，其包括：将亲和配体固定至使用[1]所述的制造方法得到的多孔性纤维素介质、使用[2]～[4]中任一项所述的制造方法得到的球状多孔性纤维素粒子、或使用[5]所述的制造方法得到的多孔性纤维素整块的工序。[9]根据[8]所述的吸附体的制造方法，其中，上述亲和配体为选自蛋白a、蛋白g、蛋白l及它们的功能性变异体中的一种以上。[10]一种目标物质的纯化法，其包括：使[8]或[9]所述的吸附体与包含目标物质的混合物接触，从而使目标物质与固定于吸附体的亲和配体结合的第一工序；和分离与吸附体的亲和配体结合的目标物质的第二工序。发明的效果根据本发明，在制造多孔性纤维素粒子这样的多孔性纤维素介质时，不需要为了使乙酸纤维素溶解而使用诸如卤代烃那样的有机氯类的溶剂，不仅如此，在对包含乙酸纤维素的组合物进行凝胶化时，由于在均一组合物中利用了伴随脱乙酰化反应的凝胶化，因此可以使获得的纤维素介质的细孔的大小均匀。附图说明[图1]利用本发明的制造方法得到的多孔性纤维素粒子(实施例1)的光学显微镜照片。[图2]利用本发明的制造方法得到的多孔性纤维素粒子(实施例2)的光学显微镜照片。[图3]利用本发明的制造方法得到的多孔性纤维素粒子(实施例2)的电子显微镜照片。[图4]利用本发明的制造方法得到的多孔性纤维素粒子(实施例3)的光学显微镜照片。[图5]利用本发明的制造方法得到的多孔性纤维素粒子(实施例3)的电子显微镜照片。[图6]利用本发明的制造方法得到的多孔性纤维素粒子(实施例4)的光学显微镜照片。[图7]示出了使用在实施例2、3中得到的多孔性纤维素粒子进行标准聚氧乙烯的分离而得到的校准曲线的图。具体实施方式本发明的多孔性纤维素介质的制造方法是利用包含乙酸纤维素、碱性物质、及含有水的溶剂的均一组合物会通过脱乙酰基反应而发生液体-凝胶的相转变的这一特性，形成由上述均一组合物形成的凝胶，以通过脱乙酰化而转变成纤维素的凝胶为多孔性介质的制造方法。在本发明中，由脱乙酰化引起的液体-凝胶的相转变是指：具有流动性的液态的组合物随着脱乙酰基反应的进行而丧失流动性的现象。例如，虽然可在众多的均一溶液组合物中确认到在温度下降时粘度升高的现象，但在由液体起始的凝胶化中，流动性完全丧失，多数情况下会发生白浊。在本发明中，为了使凝胶化发生，无需添加除了碱性物质以外的试剂等，利用脱乙酰基反应即可引发凝胶化。<乙酸纤维素>就本发明中使用的乙酸纤维素而言，只要包含碱性物质、含有水的溶剂及该乙酸纤维素的组合物通过脱乙酰化而发生相转变即可，可以是任意的乙酸纤维素。作为乙酸纤维素的代表性的物性，可列举聚合度和取代度。对于聚合度，为了提高获得的多孔性纤维素粒子的机械强度、防止使用时向溶剂等的溶出，优选以重量平均计为50以上。另一方面，对于上限，只要是能够取得的，也可以使用任意的。取代度对乙酸纤维素的溶解性带来较强的影响。取代度是表示在纤维素的1个葡萄糖残基所具有的3个羟基中有几个被取代的数值，对于乙酸酯的情况而言，有时也利用乙酸含量、乙酰基含量来表现，但这些可以相互换算。通常，将取代度在2.8～2.9附近的作为三乙酸酯，将取代度在2.5附近的作为二乙酸酯进行流通。在本发明中，只要是可以提供发生相转变的组合物的乙酸纤维素，则可以是任何取代度。对于乙酸纤维素而言，通常流通的有：被广泛用作纤维材料等的所谓二乙酸纤维素(其中，典型的产品为乙酰基取代度为2.5，以乙酸的含量表示时(乙酰化度)为55％左右)、和被用作照片、液晶显示用的膜材料的三乙酸酯(乙酰基取代度为2.8～2.9，以乙酸的含量表示时(乙酰化度)为60％左右)。取代度为1左右的乙酸纤维素(应称之为单乙酸酯，但由于通常不流通，因此未作为通称被确立)，有时也溶解于水，极性溶剂类的选择较广。像这样，对于通常不流通的等级，可以通过例如向比其取代度高的乙酸纤维素的溶液中添加计算量的碱进行溶剂分解，或利用硫酸等酸催化剂使其含水乙酸溶液发生水解、并在适当的时刻停止反应(中和硫酸)等而获得。例如，可以以二乙酸酯(二乙酸纤维素)作为起始物质，使其与每葡萄糖单元为1.5当量的碱发生作用而获得。作为碱，易于使用的是由于为中性分子因此容易混合到众多有机溶剂中、且反应迅速的肼、羟胺，但要点在于只要是与原料溶液混合的碱，则也可以利用氢氧化物、例如季铵氢氧化物等。在乙酰化程度方面的三乙酸酯、二乙酸酯、单乙酸酯的边界没有明确的区别，但在本发明中，为了方便，将2.7以上作为三乙酸酯、1.5以上且低于2.7作为二乙酸酯、0.5以上且低于1.5作为单乙酸酯。<本发明中的组合物>本发明的制造方法中使用的组合物为包含上述乙酸纤维素、碱性物质、有机溶剂及水的均一组合物。均一组合物是指，碱性物质、含有水的溶剂及乙酸纤维素发生了均一混合的状态的组合物。在本发明中，由脱乙酰化引起的液体-凝胶的相转变是指，在脱乙酰化前具有流动性的液态的组合物通过脱乙酰化而丧失流动性的现象。在本发明中，可以通过适宜调整该组合物的组成、所含有的乙酸纤维素的聚合度、取代度，来调整发生液体-凝胶的相转变的脱乙酰化的发生条件。上述组合物中的乙酸纤维素、碱性物质、含有水的溶剂的含量分别只要是引起乙酸纤维素的脱乙酰化的含量即可，可以是任意的。为了使获得的多孔性纤维素具有适于实用的细孔直径和适度的硬度，该组合物中的乙酸纤维素的含量优选为1～20重量％，进一步优选为4～15重量％。该组合物中含有的碱性化合物可列举：氨、肼及它们的烷基取代物，胍类、脒类及其取代物，二胺类，羟胺、乙醇胺等羟基烷基胺类，乙胺、丙胺等烷基胺这样的胺类，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等金属氢氧化物，氢氧化季铵、金属醇化物、羟肟酸盐等之类的无机碱。就该组合物中的碱性物质的含量而言，可列举相对于乙酸纤维素的乙酰基为0.5～10摩尔倍的实施方式，优选为1～5摩尔倍。如果以这样的比率含有碱性物质，则可以良好地引起脱乙酰化。在本发明的多孔性纤维素介质的制造方法中，准备包含乙酸纤维素、碱性化合物、及含有水的溶剂的流动性的均一组合物，通过乙酸纤维素的脱乙酰基反应而使该组合物发生凝胶化。即，随着均一组合物中的乙酸纤维素的脱乙酰化的进行，均一组合物发生凝胶化。在传统方法、例如专利文献1中，是在进行凝胶化之后进行脱乙酰化，但在本发明中，脱乙酰化和凝胶化同时发生。上述均一组合物也可以一次性将各成分混合，但由于在多数情况下纤维素衍生物的溶解通常需要花费时间，而不期望在其未完全溶解时部分地进行脱乙酰基反应，因此，优选如下地准备：预先准备将乙酸纤维素溶解于含有水的溶剂而成的溶液，并另外地准备将碱性化合物溶解于含有水的溶剂而成的溶液，将这些溶液混合均匀。需要说明的是，在使用单乙酸纤维素作为乙酸纤维素的情况下，可以单独地使用水作为溶剂(不包含有机溶剂)。均一组合物从该准备完毕时起开始发生脱乙酰基反应。脱乙酰基反应的速度可以通过调整均一组合物的温度、或调整碱性化合物的种类、其浓度来进行调节。对于上述组合物中含有的含有水的溶剂，例如可列举除了水以外包含有机溶剂的实施方式。对于水与有机溶剂的比率，只要是开始时乙酸纤维素溶解、从而可通过反应引发凝胶化的比例即可，可以采用任意比例。例如可列举以重量比计为5:95～90:10的实施方式。作为含有水的溶剂，也可以使用在上述非专利文献3中报道的相对于cda的丙酮-水混合体系、相同的二噁烷-水混合体系，但这些体系中包含的有机溶剂由于在液体石蜡中会有相当大的量溶入、蒸气压高，因此在分散处理的过程中会因温度以外的伴生物质移动的原因而导致容易发生未想到的凝胶化等，导致操作困难。因此，优选相对于液体石蜡等非极性液体的溶解性也低、且不易发生由蒸发引起的浓度变化的溶剂，作为具有这样的属性的溶剂，优选相对于己烷这样的饱和烃不会均一地混合的溶剂。作为对于乙酸纤维素全体溶解能力强、并且具备上述性质的有机溶剂，被称为非质子性极性溶剂的溶剂有很多符合，可例示选自dmso、环丁砜、二甲基砜、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基乙酰胺、n,n’-二甲基甲酰胺、n,n’-二甲基咪唑啉酮、六甲基磷酰三胺、四甲基脲等不含有卤素的溶剂中的一种以上。其中，可优选列举使用选自dmso、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基乙酰胺中的一种以上的实施方式。从多孔性纤维素介质的制造中的操作容易程度方面出发，优选的引起脱乙酰基反应的温度为-10～100℃，进一步优选为0～70℃。需要说明的是，在使用无机碱作为碱性物质的情况下，为了使反应不会进行得比所必要的更快，可列举反应温度在-10～50℃的范围内进行的实施方式。关于反应条件，由于上述化合物具有的相对于溶剂的溶解性、反应速度不同，因此不能一概地确定，只要是可以使用公知的方法、乙酰基的除去达到与利用目的相符的程度即可。作为脱乙酰化所需要的时间、即直到均一组合物发生凝胶化为止的时间，可列举1分钟～48小时，优选为5分钟～24小时左右。从在分散于分散液得到粒子的情况下的分散稳定性的观点出发，优选脱乙酰化所需要的时间尽可能短者。反应结束后，利用不会对获得的多孔性纤维素造成不良影响的溶剂进行洗涤，并根据需要添加防腐剂。<多孔性纤维素介质的形状>利用本发明的制造方法制造的多孔性纤维素介质，既可以以球状粒子形式也可以以整块形式利用。在制作球状粒子或整块的情况下，在使上述特定的组合物的乙酸纤维素发生脱乙酰化而发生凝胶化之前，用于控制形状的工艺不同。为了制造整块，在具有任意形状的容器中使上述均一组合物发生相转变，而为了制造微粒，通常使溶液状的均一组合物以分散于与其不混合的分散介质中的状态进行温度变化，从而使其发生相转变。以下，对这些具体的方法进行简单说明。<球状粒子>作为本发明的球状多孔性纤维素粒子的制造方法，可列举包括下述工序的实施方式：将包含乙酸纤维素、碱性化合物、及含有水的溶剂的流动性的均一组合物分散于与该均一组合物不混合的分散介质中而得到分散液，通过所得分散液中包含的乙酸纤维素的脱乙酰基反应而使上述组合物发生凝胶化，从而形成由上述组合物形成的凝胶化粒子。另外，也可以包括在上述工序后，将用于分离所得凝胶化粒子的分离溶剂添加至形成有凝胶化粒子的分散液中，将凝胶化粒子分离至分离溶剂中的工序。在本发明的球状多孔性纤维素粒子的制造方法中，使用了用于分散上述组合物的分散介质。作为本发明中可以使用的分散介质，只要不是会因与上述组合物中的水、有机溶剂混合而引起上述组合物的不期望的凝胶化、相转变温度的极端变化，对目标的球状多孔性纤维素粒子的孔径造成不良影响的分散介质，则可以为任意的。为了防止在分散上述组合物时上述组合物发生凝聚，优选分散介质在分散组合物时具有一定程度的粘度。作为分散介质的粘度，可列举25℃时为0.2～20pa·s。就分散介质而言，为了不与上述组合物中包含的水、有机溶剂混合，优选为非极性的分散介质，可列举例如：液体石蜡、凡士林那样的碳原子数20以上的烃、硅油、氟化烃。凡士林在达到特定的软化温度以下时会迅速地丧失流动性。因此，在分散的凝胶化液的粒子容易发生再凝聚而形成团块的情况下，首先在软化温度以上制备分散液，将其先降低至软化温度以下，使凝胶化液滴彼此不能移动、接触，对于提高粒子的收率的目的而言，使用凡士林是有效的。凡士林的软化温度根据其种类而不同，可以适当选择。组合物含有的碱性化合物可以使用上述说明的碱性化合物。对于其含量，也可以采用作为乙酸纤维素的相对于乙酰基的含量而在上述中示出的范围。另外，对于均一组合物中其它成分的含量也可以使用在<本发明中的组合物>中示出的上述范围。本发明中的包含乙酸纤维素的组合物，需要在分散于分散介质之后、直到进行脱乙酰化而发生凝胶化为止的期间保持分散状态。为此，优选向分散介质添加适当的分散稳定剂。就分散稳定剂而言，只要是具有提高上述组合物的分散状态的稳定性、减慢由组合物形成的粒子发生凝聚的速度的效果的分散稳定剂，可以是任意的。作为这样的分散稳定剂，可列举：甘油、山梨糖醇酐、聚甘油、蔗糖等多元醇与高级羧酸的酯、包含少量极性基团的改性硅油等，也可以使用除此以外的市售的分散稳定剂。作为将包含乙酸纤维素的上述组合物分散至上述分散介质中的方法，已可列举形形色色的方法，从提供宽范围的粒径分布的方法到提供单分散的粒径的方法等，包括各种各样的方法。例如，在使用通常被称为微反应器的容器并使液态的分散介质以适当的速度在其中流动的过程中，从较细的喷嘴向其中注入发生了凝胶化的均一组合物的方法，适于制备粒径均一的材料的情况。另外，可以采用如下所述的各种方法：将本发明的流动性的均一组合物从孔径一定的膜向分散介质中挤出的方法；将本发明的流动性的均一组合物加入到开有一定大小的孔的内筒中，使其在分散介质中旋转，利用离心力将发生了凝胶化的均一组合物挤出的方法；根据需要将包含分散稳定剂的分散介质与流动性的均一组合物送液至填充有一定大小的珠的柱中的方法；通过振动喷嘴将流动性的均一组合物注入分散介质中的方法；使用(超)声波的方法；等等。在实施例中提供了各种粒径的混合物，但例示的是最简单的基于搅拌的方法。该方法为将上述均一组合物添加到上述分散介质中之后，在使由上述组合物形成的大致球状的粒子生成的同时，使成为分散液滴的均一组合物发生脱乙酰化而进行凝胶化。搅拌混合的条件可以根据目标的平均粒径而适当进行选择。可列举将在分散介质中分散的组合物放置1～48小时、优选10～30小时左右，使由均一组合物形成的粒子中发生脱乙酰基反应的实施方式。需要说明的是，对于将包含乙酸纤维素的上述组合物添加至上述分散介质时的上述分散介质的温度，可列举使上述组合物为保持液态的温度的实施方式。具体可列举将分散介质的温度设定为50～80℃左右的实施方式。通过将分散介质设定为这样的温度，上述组合物的搅拌混合变得容易。优选在上述均一组合物保持流动性的状态下将上述均一组合物添加至分散介质来进行分散。<分离溶剂>对这之后的工艺没有特别限定，但在本发明的实施例中，可列举为了从分散介质中提取出发生了凝胶化的纤维素粒子而使用分离溶剂的实施方式。例如，为了从发生了凝胶化的由上述组合物形成的粒子之中，仅将纤维素粒子以凝胶状粒子的形式从分散介质中分离，可列举向分散有上述组合物的分散介质中添加分离溶剂的实施方式。作为分离溶剂，使用与分散介质不混合、在发生了凝胶化的上述组合物中纤维素不溶解但与水及该组合物中任选包含的有机溶剂混合的溶剂。由此，可以防止在发生了凝胶化的上述组合物中纤维素再次溶解。作为这样的分离溶剂，可列举：水、甲醇、乙醇、2-丙醇、乙酰胺、甲酰胺、或它们的混合物。这些中，从操作的容易度，可列举使用水的实施方式。虽然也可以将分散于分散介质中的状态的纤维素凝胶粒子直接进行过滤，但由于分散介质的粘度通常较高，因此，过滤中会产生压力，变形或者破坏凝胶粒子的危险性升高。也可以通过向分散介质中添加与其混合的低粘度的液体而降低过滤时的压力。对于获得的多孔性纤维素粒子，利用使用水、乙醇等的适当方法进行洗涤，通常以水湿的状态保存。在使其干燥的情况下，适量添加糖类、甘油等。在利用水湿进行长期保存的情况下，为了防止腐败，可添加醇、叠氮钠等防腐剂。另外，也可以在添加了甘油、糖类、尿素等的状态下进行干燥。在使用时，通过常规方法填充至柱而进行使用。可以通过公知的适当的分级，从利用本发明的制造方法得到的多孔性纤维素粒子中筛选出粒径(最大直径)为30～300μm的具有大致球状～球状的形状的粒子，将其用作色谱用的填充剂。作为色谱，可列举空间排阻色谱。可以利用于空间排阻色谱，也就是说，表示也可以通过结合适当的配体而利用于基于除空间排阻以外的各种模式的色谱分离。其中，包括离子交换、疏水性、亲和(affinity)等模式。一般而言，为了分离纯化诸如利用生物技术制造的这样的高分子，例如激素、酶、抗体药物等，优选具有使得这些物质可充分进入的大小的细孔的基质。即，可以期待在使用填充了该粒子的柱、以水为流动相进行凝胶过滤色谱时，在换算为聚乙二醇的分子量为大致103～107的范围的一定的分子量区域内发生分级。在实施例1的gpc中，分子量104～106的标准物质(聚乙二醇)在不同的时间洗脱，这表示，可通过本法制造的基质的细孔直径适于进行这些物质的分离纯化。对于细孔的大小，可以通过改变待凝胶化的包含含有水的溶剂、乙酸纤维素的组合物中的乙酸纤维素的浓度，或根据凝胶化的条件(例如，调整均一组合物的冷却速度等)而进行精细调整。以下，针对在亲和色谱的模式下使用的吸附体的制造方法进行说明。可以使用蛋白质作为亲和配体。作为本发明中可以使用的蛋白质，可列举分子量为3～300kda、优选为30～150kda，且对于那些作为分离对象的例如抗体那样的相对于蛋白质具有亲和性的物质。其中，作为亲和配体，蛋白a、蛋白g、蛋白l及它们的功能性变异体在抗体的蛋白质的分离中使用时的选择率较高，故优选。在以分离抗体作为主要目的的情况下，作为配体，优选能够与免疫球蛋白的一部分进行特异性结合的那些。上述功能性变异体，指天然氨基酸序列中具有至少1个变性，仍保持了天然序列所伴有的至少1个功能的蛋白质。天然序列包括原本自然产生的氨基酸序列。作为氨基酸的变化，可列举将1个以上的氨基酸置换为另外的氨基酸、1个以上的氨基酸的删除和/或1个以上的氨基酸的追加或这些的任意组合。也可以举出诸如相对于天然序列进行的追加、删除及置换的组合那样的实施方式。功能性变异体也可以包含蛋白质的片段或结构域。就功能性变异体的氨基酸序列而言，可以与天然氨基酸序列至少有70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少98％相同，且仍保持了天然序列所伴有的至少1个功能。就相对于上述多孔性纤维素粒子的蛋白质的负载量而言，相对于多孔性纤维素粒子100重量份，优选为1.0～25重量份。另外，可列举相对于多孔性纤维素粒子的体积每1ml为1～50mg的实施方式。通过在利用本发明的制造方法制作的多孔性纤维素介质的制造方法中进一步包括固定上述亲和配体的工序，可以制作结合有亲和配体的吸附体。该吸附体也可以用作亲和色谱法用的分离剂。作为其制造工序，可列举如下的实施方式。首先，可以包括对于利用上述制造方法制造的多孔性纤维素粒子，使用交联剂使其发生交联反应的工序。对于交联方法没有特别的限制，可以使用例如环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、二氯丙醇等卤代丙二醇、双环氧乙烷、聚环氧乙烷这样的交联剂。接着，对于发生了交联的纤维素粒子，可以包括使其活化的工序。例如，可以通过导入公知的反应性官能团使发生了交联的纤维素粒子活化。通过利用例如溴化氰(cnbr)、n,n’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(dsc)、环氧化物及活化羧酸(nhs酯)等进行活化，可以变为比多孔性纤维素粒子原本具有的官能团更容易与作为配体的固定化的化合物发生反应的官能团。进而，可以列举在随后经过使其与作为配体的固定化的化合物发生反应、将配体与多孔性纤维素粒子固定的工序，从而制造吸附体的方法。作为与上述不同的吸附体的制造方法，可列举通过向存在多孔性纤维素粒子与作为配体的固定化的化合物的体系中，添加碳二亚胺那样的缩合试剂、或戊二醛那样的分子中具有多个官能团的试剂，并进行缩合、交联，从而将多孔性纤维素粒子与配体固定来获得吸附体的方法。作为使多孔性纤维素粒子与亲和配体结合的另外的实施方式，可列举向纤维素、纤维素粒子导入甲酰基，使该甲酰基与蛋白质的氨基发生反应的实施方式。关于导入甲酰基的反应，可列举例如：通过高碘酸氧化法使具有邻位羟基的多糖类氧化，使糖链上生成甲酰基的方法。另外，可列举经由通过使由环氧基经开环得到的甘油基与高碘酸盐发生作用的方法等获得的各种间隔基团(spacer)而导入甲酰基的方法。例如：作为间隔基团，可以使用葡糖胺等那样的氨基糖。进而，作为使多孔性纤维素粒子的甲酰基与诸如蛋白a那样的蛋白质结合的方法，可以使用公知的方法，可列举例如：使作为间隔基团而导入了葡糖胺等那样的氨基糖的多孔性纤维素粒子、与含有蛋白a的溶液发生反应的实施方式。作为这样的方法，可列举例如日本特开2008-279366号公报中记载的方法。<整块>整块是将多孔性原料制成一体的团块而成的。在使用了上述粒子状填充剂的色谱中，虽然展开液也会通过粒子的微小孔，但更多地是通过粒子间间隙。与此相对，在整块中，通过的是一体的多孔体的微小孔。因此，一般而言，与粒子状填充剂的情况相比，整块在大多情况下可减低固体成分含量、从而使相对于展开液的流动的阻力减少，但除了用作过滤材料的情况以外，其本质上的分离机理与填充剂的情况完全没有改变。本发明的多孔性纤维素整块的制造方法包括下述工序：将包含乙酸纤维素、碱性化合物、及含有水的溶剂的流动性的均一组合物加入成型容器，通过脱乙酰基反应使均一组合物在该成型容器内发生凝胶化。该方法中使用的乙酸纤维素、碱性化合物、及含有水的溶剂可以使用与球状粒子的制作中使用的相同的那些。另外，对于均一组合物中的各成分的含量，也可以采用与球状粒子的制作中使用的条件相同的条件。在液相色谱中，展开液在分离剂中的任意部分均以相同的速度移动、形成所谓的活塞式流动(pistonflow)是极其重要的。在填充剂中，各个粒子的特性的偏差由于混合而变得平均化，因此允许粒子间的性质存在一定的差异，但是承担液体流动的大部分的粒子间空隙的均一性变得重要。因此，将填充剂填充到被称为柱的容器时的技术变得重要。与此相对，在整块中极其重要的是：生成的多孔性结构在相对于展开液的流动成直角的方向上是均一的、及整块与容器之间不能存在液体容易流动的间隙。对于在此叙述的在直角方向上均一的多孔体的制备，不能通过与胶凝剂(沉淀剂)的接触、或作为公知技术的溶剂的蒸发来进行。对于本发明的基于乙酸纤维素的脱乙酰基反应的凝胶化的方法而言，由于如果原料组合物的温度的均一化快于凝胶化速度则可提供均一的凝胶，因此优选用于制备整块。在制作整块时，通过将上述包含碱性化合物、含有水的溶剂以及乙酸纤维素的均一组合物投入任意形状的成型容器，随后在温度0～100℃左右放置10分钟～48小时、优选1～24小时左右，从而可引起乙酸纤维素的脱乙酰基反应而形成由该组合物形成的凝胶，可以将其直接、或者从模具取出后利用合适的溶剂洗涤而用作分离剂。一般而言，干燥有时会引起整块的形状的变化、或导致微细孔结构丧失，如果与合适的不挥发性添加剂共存，则这样的情况能够得以避免。作为该不挥发性添加剂，甘油、蔗糖、海藻糖、糖浆等糖、糖醇，各种酰胺、dmso等极性化合物是适宜的。为了评价制备成的整块，需要如已经叙述的那样，以没有间隙、没有局部压紧的方式容纳于适当的容器中。为了达到该目的的方法可以是公知的任意方法。通常，利用凝胶化而生成整块时，很多情况会产生一定的收缩，与容器之间产生出间隙。这样的情况下，可以通过将容器壁面修饰为与纤维素类物质的亲和性强的化学结构(例如在表面结合纤维素)而使得间隙无法产生，或者利用凝胶的环境变化引起的收缩、溶胀、或使得容器的尺寸为能够适合(可调整)等，从而实现无间隙地容纳。另外，制备的整块也可以与上述球状粒子的情况同样地，通过结合亲和配体而作为亲和色谱法用的分离剂、吸附体来利用。可与整块结合的亲和配体与球状粒子的情况相同，对于亲和配体的结合方法，也可以采用与球状粒子的情况相同的方法。<在亲和色谱中使用本发明的多孔性纤维素介质进行的纯化法>通过使用上述说明的、使亲和配体结合至利用本发明的制造方法制作的多孔性纤维素介质而获得的吸附体，可以提供生成各种目标分子的方法。作为目标分子，可列举例如免疫球蛋白这样的蛋白质。作为免疫球蛋白，可列举多克隆抗体、单克隆抗体及其功能性片段。本发明的纯化法包括如下所述的工序。包括：使将亲和配体结合至利用本发明的制造方法制作的多孔性纤维素介质而获得的吸附体、与包含目标物质的混合物接触，从而使亲和配体与目标物质结合的第一工序；和将与吸附体的亲和配体结合的目标物质分离的第二工序。作为将与吸附体的亲和配体结合的目标物质分离的方法，可列举在第一工序和第二工序之间，改变ph、或改变盐浓度的方法。具体可列举：将第一工序的ph设定为6～8那样的中性、将第二工序的ph设定为低于6那样的酸性的方法。另外，关于盐浓度，可列举：使在第一工序中低于0.1m而在第二工序中为0.1m以上，或使在第一工序中为0.1m以上而在第二工序中低于0.1m。实施例以下举出实施例，对本发明进一步加以详细的说明，但不言而喻的是，本发明的范围不仅限于相关实施例。<实验例>基于脱乙酰基反应的凝胶化的确认将vtr二乙酸纤维素(乙酰化度54.75％，6％丙酮溶液粘度0.117pa·s(25)℃)15.5g溶解于dmso174.4g。将上述二乙酸纤维素的dmso溶液30.0g保持于60℃的同时，加入肼一水合物2.0g和水2.1g、dmso6.4g的混合溶液并充分混合。对该部分于40℃加温12小时之后，确认到了凝胶化。<实施例1：多孔性纤维素粒子的制备>将白色凡士林(和光纯药(株)制，和光一级)360g，乳化剂tsg10(nihonemulsion制)0.63g加入可分离式烧瓶，在油浴中保持于70℃而进行熔化。将上述乙酸纤维素的dmso溶液30.0g保持于60℃的同时，加入肼一水合物2.0g和水2.1g、dmso6.4g的混合溶液并充分混合。将上述二乙酸纤维素溶液加入上述可分离式烧瓶，使用直径4cm的分散机(ディスパージャー)、以约600rpm搅拌5分钟。将获得的分散液用冰浴冷却至40℃而使分散液凝固，于40℃静置24小时进行脱乙酰化而使其凝胶化。向分散液加入水300ml，加温至70℃而使分散液溶解后，缓慢搅拌而将微粒提取分液。将水相分液之后，再次加入水300ml，缓慢搅拌进行提取分液。对提取的水相利用玻璃过滤器过滤，用乙醇以及水反复洗涤。将用显微镜确认的所得粒子的照片示于图1，可知为基本接近正球的形状。<实施例2：多孔性纤维素粒子的制备>将白色凡士林(和光纯药(株)制，和光一级)733g，乳化剂tsg10(nihonemulsion制)1.1g加入可分离式烧瓶，利用油浴保持于70℃而进行熔化。将实施例1中制备的二乙酸纤维素的dmso溶液60.1g保持于60℃的同时，加入肼一水合物3.8g和水8.8g、dmso26.9g的混合溶液并充分混合。将该混合溶液加入上述可分离式烧瓶，插入直径80mm的分散机(ディスパーサ)、以约400rpm搅拌5分钟。将获得的分散液在冰浴中冷却至40℃而使分散液凝固，于40℃静置24小时进行脱乙酰化而使其凝胶化。向分散液加入水300ml，加温至70℃而使分散液溶解后，缓慢搅拌而将微粒提取分液。分液水相之后，再次加入水200ml并缓慢搅拌而进行提取分液。对提取的水相利用玻璃过滤器过滤，用乙醇以及水反复洗涤。将获得的粒子的显微镜照片示于图2。将获得的粒子的一部分用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、乙醇置换，进一步用叔丁醇/乙醇为5/5、7/3、9/1、10/0的混合液置换之后，进行冷冻干燥处理。用电子显微镜照片对冷冻干燥的粒子进行确认时，确认到了多孔性的表面(图3)。<实施例3：多孔性纤维素粒子的制备>将vtr二乙酸纤维素(乙酰化度54.75％，6％丙酮溶液粘度0.117pa·s(25)℃)15.3g溶解于dmso172.4g。将白色凡士林(和光纯药(株)制，和光一级)733g，乳化剂tsg10(nihonemulsion制)1.4g加入可分离式烧瓶，利用油浴保持于70℃而进行熔化。将上述二乙酸纤维素的dmso溶液60.6g保持于60℃的同时，加入肼一水合物9.1g和水13.3g、dmso40.7g的混合溶液并充分混合。将该混合溶液加入上述可分离式烧瓶，插入直径80mm的分散机、以约325rpm搅拌5分钟。将获得的分散液在冰浴中冷却至40℃使分散液凝固，于40℃静置24小时进行脱乙酰化而使其凝胶化。向分散液加入水300ml，加温至70℃而使分散液溶解后，缓慢搅拌而将微粒提取分液。分液水相之后，再次加入水200ml并缓慢搅拌而进行提取分液。对提取的水相利用玻璃过滤器过滤，用乙醇以及水反复洗涤。将获得的纤维素粒子保持水分散的状态利用不锈钢制筛150μm、106μm、53μm进行分级。对53μm～106μm的部分的粒子用刚果红染色后的显微镜照片如图4所示。冷冻干燥后的粒子的电子显微镜照片如图5所示地确认到了多孔性的纤维素粒子。<实施例4：使用单乙酸纤维素的纤维素粒子的制作>(1)单乙酸纤维素的合成相对于乙酸纤维素(株式会社daicel制商品名“l-50”，乙酰基总取代度：2.43，6％粘度：110mpa·s)1重量份，加入5.1重量份的乙酸及2.0重量份的水，将混合物搅拌3小时进行溶解。向该溶液中加入0.13重量份的硫酸，将获得的溶液保持于70℃进行水解。1小时后花费5分钟加入0.67重量份的水，再经过2小时之后，花费10分中加入1.33重量份的水，再继续反应6小时。之后，将反应液冷却至25℃，加入15重量份的丙酮-甲醇等容混合液使其生成沉淀，使用滤布对其进行了离心脱液。向获得的固体成分约15重量％的含溶剂滤饼中加入相对于原料乙酸纤维素相当于14重量份的水，进行搅拌，将沉淀溶解。将相当于所得溶液的4倍重量的甲醇加入溶液时，再次产生沉淀，将其脱液回收。进一步重复2次加水进行溶解、加甲醇进行沉淀、并进行脱液回收的操作。重复2次将获得的含溶剂的沉淀物分散于含有相对于其8重量份为0.004％碳酸钾的甲醇中、并进行脱液回收的操作，然后，在50℃进行真空干燥，得到成为原料的单乙酸纤维素。(2)多孔性纤维素粒子的制备将上述获得的单乙酸纤维素2.0g溶解于水11.3g。将液体石蜡(关东化学株式会社制鹿1级)132g、乳化剂span80(东京化成制)0.67g加入可分离式烧瓶，一边用冰浴冷却一边混合。将用冰浴冷却至5～10℃的上述单乙酸纤维素水溶液11.7g以及4重量％氢氧化钠水溶液6.7g充分混合，迅速地将该混合溶液加入上述可分离式烧瓶，插入直径40mm的分散机，以约350rpm搅拌2分钟。将获得的分散液静置10分钟进行脱乙酰化而使其凝胶化。向分散液加入水100ml，加温至25℃，缓慢搅拌3小时而将微粒提取分液。将水相分液之后，再次加入水100ml并缓慢搅拌进行提取分液。向提取的水相中添加少量的氢氧化钾，缓慢搅拌后静置过夜。添加乙酸进行中和，使其通过25μm的筛后，用玻璃过滤器过滤，用乙醇以及水反复洗涤。将获得的纤维素粒子保持水分散的状态利用不锈钢制筛150μm、106μm、53μm进行分级。对53μm～106μm的部分的粒子用刚果红染色后的显微镜照片如图6所示。<实施例5>空间排阻色谱法将实施例2及3中制作的纤维素粒子保持水分散的状态利用不锈钢制筛150μm、106μm、53μm进行分级。将53μm～106μm的部分约7ml填充于内径10mm、高度100mm的柱，以下述要领，将超纯水作为流动相，注入表1所示的标准聚氧乙烯的样品，并利用差示折光检测器进行了检测。将按照常规方法描绘的校准曲线示于图7使用柱hr10/100(gehealthcare)tricorn10/100(gehealthcare)流量0.10ml/min洗脱液超纯水(排气)标准物质tskgel标准聚氧乙烯(从东曹(株)购入)将各试样用超纯水稀释为2mg/ml。[表1]样品dase-150940000se-70610000se-30240000se-15120000se-892000se-537000se-213000用下式算出各标准物质的分配系数(kav)。kav＝(ve-v0)/(vt-v0)ve为样品的保留体积(ml)，vt为空柱体积(ml)，v0为se-150的保留体积(ml)<实施例6>(1)交联多孔性纤维素粒子的制备向100ml三颈烧瓶中添加实施例3中获得的多孔性纤维素粒子10ml、将硫酸钠10.6g溶解于水28.8g而成的液体，于50℃进行搅拌。添加45重量％氢氧化钠水溶液0.37g和硼氢化钠60mg，进行了搅拌。将45重量％氢氧化钠水溶液5.42g和环氧氯丙烷5.55g分别以10等分的量每隔30分钟经5小时进行添加。添加结束后，于50℃反应19小时。冷却至40℃以下后，添加乙酸0.62g进行中和。过滤反应混合物并回收粒子，利用纯水过滤并洗涤，获得了目标的交联多孔性纤维素粒子。(2)相对于交联多孔性纤维素粒子的蛋白a固定化和柱制作将(1)中获得的交联多孔性纤维素粒子用玻璃过滤器过滤，用乙腈洗涤，得到载体3.3ml。将载体移液至烧瓶，加入含有乙腈2.5ml和碳酸二(n-琥珀酰亚胺)[n,n'-disuccinimidylcarbonate]55mg的乙腈溶液10ml，于4℃、以180rpm振荡。接着加入含有n,n-二甲基氨基吡啶40mg的乙腈溶液1ml，振荡18小时使其反应。利用玻璃过滤器进行过滤，按照乙腈30ml、包含5％乙酸的二噁烷30ml、甲醇30ml、2-丙醇30ml的顺序进行洗涤，获得了活化载体。取活化载体1ml至玻璃过滤器中，利用偶联缓冲液(0.1m磷酸钠，ph7.0)进行洗涤。将活化载体转移至烧瓶，添加蛋白a(rspa、repligen)为53.6mg/ml的含蛋白a溶液168μl、偶联缓冲液2ml，于5℃、以130rpm振荡22小时进行固定化。利用玻璃过滤器进行过滤，利用偶联缓冲液洗涤。利用bradford法测定了反应后的滤液，结果可知，每1ml载体固定了蛋白a9.0mg。然后将载体转移至烧瓶，添加1mtris盐酸(ph8)2ml，于25℃、以130rpm振荡2小时，封闭未反应活性基团。利用玻璃过滤器进行过滤，将洗涤液1(0.1mtris盐酸、0.5m氯化钠，ph8.0)、洗涤液2(0.1m乙酸铵缓冲液、0.5m氯化钠，ph4.0)交替洗涤3个循环。利用纯水洗涤固定化载体1ml，装入tricorn5/50column。另外，将sepharose4fastflow(gehealthcare)也以相同的操作制作成柱(蛋白a固定量10mg/ml-gel)。(3)蛋白a固定柱的抗体吸附容量将(2)中制作的蛋白a固定柱设置于液相色谱装置aktaexplore(gehealthcarebioscience)，使吸附缓冲液(20mm磷酸缓冲液、150mm氯化钠，ph7.2)以1ml/min.或者0.4ml/min.的条件进行流动，使其平衡化之后，注入制备成1mg/ml的源自人血清的γ-globulin(和光纯药)。持续注入，直至达到洗脱液的280nm下的吸光度的15％为止，之后利用吸附缓冲液进行洗涤，之后将吸附缓冲液置换为20mm柠檬酸(ph2.4)，洗脱吸附成分。动态吸附容量(dbc)根据洗脱液的280nm下除了非吸附成分以外的吸光度达到注入样品的吸光度的10％为止所注入的样品量进行计算。将各固定柱的dbc示于表2。[表2]工业实用性在本发明的制造方法中，利用包含乙酸纤维素的特定的组合物经脱乙酰基反应发生凝胶化的性质，进行多孔性乙酸纤维素介质的制造。由此，在乙酸纤维素的凝胶化的过程中，细孔的大小变得均一。这方面与传统的多孔性纤维素介质的制造方法中，在细孔的形成过程中发生溶剂的蒸发、产生物质的移动的方式是不同的。另外，根据本发明的制造方法得到的多孔性纤维素介质的细孔的大小为数千左右的较大的大小。根据本发明的制造方法得到的多孔性纤维素介质的硬度，与目前存在的市售品为同等程度。根据本发明的制造方法得到的多孔性介质，无论其形状为球状粒子还是为整块，也适宜用作吸附体、分离剂。尤其是，结合了亲和配体的吸附体可以用于各种目标物质的分离。当前第1页12