本发明涉及一种抑制坏死性凋亡(necroptosis)的新型杂环化合物及其使用方法。
背景技术：
在许多疾病中，细胞死亡由凋亡和/或坏死途径介导。虽然对于控制凋亡的作用机制了解甚多，但对坏死的控制还不太清楚。了解关于细胞中坏死和凋亡的机制，这对能够治疗病症(如神经变性疾病、中风冠心病、肾脏疾病、肝脏疾病、艾滋病和与艾滋病相关的病症等)至关重要。
传统上基于形态学特征将细胞死亡分类为凋亡或坏死(wyllie等，国际细胞学评论.68:251(1980))。这两种细胞死亡模式最初也被认为是分别通过调节(胱冬酶依赖性)和非调节过程发生的。然而，最近的研究表明，导致这两种表型的潜在细胞死亡机制更复杂，并且在某些情况下是相互关联的。此外，导致坏死的病症可以通过调节的胱冬酶非依赖性或非调节过程发生。
一种受调节的、具有类似坏死的形态特征(称为坏死性凋亡)的胱冬酶非依赖性细胞死亡途径已见诸描述(degterev等，自然化学生物学.1112,2005)。可以用各种刺激物(例如tnf-α和fas配体)，在大量细胞类型(例如单核细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、上皮细胞和神经细胞)中启动这种细胞死亡的方式。在高能量依赖性凋亡过程不起作用时，在涉及过度的细胞应激、快速能量损失和大量的氧化物质生成的病理状态下，坏死性凋亡可能是细胞死亡的重要因素和在某些情况下主要的模式。
在wo2015/172203(要求优先权au2014903569和au2014901804)中，我们报道发现在us2005/0085637中描述的特定化合物适用于抑制坏死性凋亡。
包括在本说明书中的任何关于文件、行为、材料、装置、物品等的讨论不应认为是承认这些事物的任何部分或其全部由于在本申请的每项权利要求的优先权日之前就存在，而构成现有技术基础的一部分或者是与本发明有关的领域中通用的一般常识。
发明概述
如上所述，已经发现us2005/0085637和wo2015/172203中描述的某些化合物适用于抑制坏死性凋亡。本发明的发明人意外地发现，这些化合物的结构的特定变化会导致意想不到的改善的生物活性。在某些情况下，这种改善在坏死性凋亡的抑制中具有更大的效力。在另一些情况下，这种改善是脱靶活性降低，表明毒性可能降低。对于一些化合物，观察到在坏死性凋亡抑制中效力的增加和脱靶活性的降低。
在一个方面，本发明提供式(i)化合物：
或其盐、溶剂化物、或前药，
其中，
j选自氢或甲基；和
y选自氢、甲基或卤素；和
w选自下组：氢、卤素、c1–c3烷基、c1–c3卤代烷基、-or1和(c0-c4烷基)c3-c7杂环基；和
x选自下组：氰基、-or1、-(c1-c4烷基)nr3r4、c3-c7环烷基、(c0-c4烷基)c3-c7杂环基、芳基、杂芳基、4至7元内酰胺；和由-(a1)m-(a2)-(a3)定义的基团，其中
a1为ch2且m为0、1、2、或3，或
a1为nr2且m为0或1，或
a1为氧且m为0或1，或
a1为ch2nr2且m为0或1；
a2为s(o)2、s(o)、或c(o)；和
a3为c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、c1-c4羟基烷氧基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、nr3r4、芳基、芳氨基、芳烷基、芳烷氧基或杂芳基；
r1选自下组：氢、c1-c4烷基、c3-c7杂环基、(c0-c4烷基)c3-c7杂环基和-nr3r4；
r2、r3和r4各自独立地选自下组：氢、羟基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、c1-c6烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、c1-c4烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、-s(o)2r5和-c(o)r5；和
r5选自c1-c4烷基或c3-c7环烷基。
v1、v2、v3、v4和v5各自独立地选自氢或由-(x4)z-(x5)定义的基团，其中
在z为0、1、2、或4时x4为ch2，和
x5选自下组：氢、c1-c6烷基、c1-c6卤代烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、芳基、杂芳基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷氧基、羟基、芳氧基、芳烷氧基、卤素、-cn、-nr’r’、n(h)c(o)r"、n(h)c(o)or"、n(h)c(o)nr’r’、n(h)s(o)2r"、or"、oc(o)rr"、c(o)r"、sr"、s(o)r”’、s(o)2r"、和s(o)2nr’r’，其中
r’选自下组：氢、c1-c6烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、-or1、–sr1、-s(o)2r1、-s(o)r1和c(o)r1；
r"选自下组：氢、c1-c6烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、-or1、-nr3r4、-s(o)2r1、-s(o)r1和c(o)r1；和
r”’选自下组：氢、c1-c6烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、-or1和-nr3r4；
只要满足以下一个或多个条件：
(i)y是卤素或甲基；和
(ii)x选自下组：-conr3r4、-(c1-c4烷基)-nr3r4、4至7元内酰胺、杂芳基、氰基、-or1和
(iii)v1、v3和v5是氢，且v2和v4各自独立地选自下组：卤素、c1-c6卤代烷基、c1-c6烷基和c1-c6卤代烷氧基。
另一方面，提供了新的式(i)化合物。
一方面，提供了一种组合物，包含如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药，以及药学上可接受的赋形剂。
另一方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制坏死性凋亡的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
另一方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制坏死性凋亡的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的含式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物。
另一方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制坏死性凋亡的方法，所述方法包括施用治疗有效量的与混合谱系激酶结构域样(mlkl)蛋白的假激酶结构域的atp结合位点结合的如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药。
另一方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制坏死性凋亡的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含与混合谱系激酶结构域样(mlkl)蛋白的假激酶结构域的atp结合位点结合的如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药。
另一方面，提供式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药在制备用于抑制受试者中坏死性凋亡的药物中的用途。
另一方面，提供含式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物在制备用于抑制受试者中坏死性凋亡的药物中的用途。
另一方面，提供了一种如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药的用途，用于抑制坏死性凋亡。
另一方面，提供了含如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物的用途，用于抑制坏死性凋亡。
又一方面，提供了如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药，用于抑制坏死性凋亡。
另一方面，提供了含如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物，用于抑制坏死性凋亡。
又一方面，提供了一种用于抑制坏死性凋亡时的如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药。
又一方面，提供了一种用于抑制坏死性凋亡时的含如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物。
除非另有具体说明，否则本文中的任何实施例在细节上作必要修改后应适用于任何其他实施例。
本发明不限于本文所述的具体实例的范围，这些实例仅用于为示例的目的。如本文所述，功能上等效的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
在整个说明书中，除非另有明确说明或上下文另有要求，涉及一个步骤、物质组合、一组步骤或一组物质组合，应被视为包括一个和多个(即一个或更多)这些步骤、物质组合、步骤组或物质组合组。
发明详述
在一个方面，本发明提供了式(i)化合物：
或其盐、溶剂化物、或前药，
其中，
j选自氢或甲基；和
y选自氢、甲基或卤素；和
w选自下组：氢、卤素、c1–c3烷基、c1–c3卤代烷基、-or1和(c0-c4烷基)c3-c7杂环基；和
x选自下组：氰基、-or1、-(c1-c4烷基)nr3r4、c3-c7环烷基、(c0-c4烷基)c3-c7杂环基、芳基、杂芳基、4至7元内酰胺；和由-(a1)m-(a2)-(a3)定义的基团，其中
a1为ch2且m为0、1、2、或3，或
a1为nr2且m为0或1，或
a1为氧且m为0或1，或
a1为ch2nr2且m为0或1；
a2为s(o)2、s(o)、或c(o)；和
a3为c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、c1-c4羟基烷氧基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、nr3r4、芳基、芳氨基、芳烷基、芳烷氧基或杂芳基；
r1选自下组：氢、c1-c4烷基、c3-c7杂环基、(c0-c4烷基)c3-c7杂环基和-nr3r4；
r2、r3和r4各自独立地选自下组：氢、羟基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、c1-c6烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、c1-c4烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、-s(o)2r5和-c(o)r5；和
r5选自c1-c4烷基或c3-c7环烷基。
v1、v2、v3、v4和v5各自独立地选自氢或由-(x4)z-(x5)定义的基团，其中
在z为0、1、2、或4时x4为ch2，和
x5选自下组：氢、c1-c6烷基、c1-c6卤代烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、芳基、杂芳基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷氧基、羟基、芳氧基、芳烷氧基、卤素、-cn、-nr’r’、n(h)c(o)r"、n(h)c(o)or"、n(h)c(o)nr’r’、n(h)s(o)2r"、or"、oc(o)rr"、c(o)r"、sr"、s(o)r"‘、s(o)2r’’’和s(o)2nr’r’，其中
r’选自下组：氢、c1-c6烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、-or1、–sr1、-s(o)2r1、-s(o)r1和c(o)r1；
r"选自下组：氢、c1-c6烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、-or1、-nr3r4、-s(o)2r1、-s(o)r1和c(o)r1；和
r’’’选自下组：氢、c1-c6烷基、c3-c7环烷基、c3-c7杂环基、-or1和-nr3r4；
只要满足以下一个或多个条件：
(i)y是卤素或甲基；和
(ii)x选自下组：-conr3r4、-(c1-c4烷基)-nr3r4、4至7元内酰胺、杂芳基、氰基、-or1和
(iii)v1、v3和v5是氢，且v2和v4各自独立地选自下组：卤素、c1-c6卤代烷基、c1-c6烷基和c1-c6卤代烷氧基。
在优选的实施方式中，j为甲基。
在另一优选的实施方式中，w为甲基。
在x取代
在一个实施方案中，提供了通过改变式(i)中x位的基团来提高所述化合物的生物活性。在现有技术中，虽然研究了包括酰胺在内的一些基团，但在这个位置上，磺酰胺基团是选择的官能团。发明人已经发现，在该位置上选择特定的酰胺官能团导致脱靶活性意外地降低。对于包括环酰胺(即内酰胺)的酰胺和其它特定基团(包括胺，取代和未取代的杂芳基如四唑、-cn、-or1、烷基吗啉基团和烷基哌嗪基团)，这是明显的。例如：
来自au2014903569的化合物1(8)
来自au2014903569的化合物21(3)
因此，在某些实施方式中，本发明提供了式(i)化合物，其中x为-conr3r4。在一个实施方式中，r3和r4均为氢或甲基。在另一实施方式中，r3为氢且r4为甲基。在又一实施方式中，r3为氢且r4为-ch2ch2och3。
在其他实施方式中，本发明提供式(i)化合物，其中x为-ch2n(ch3)2。
在其他实施方式中，本发明提供式(i)化合物，其中x是可以被取代的4至7元的内酰胺。优选为5-7元的内酰胺，更优选为5元的内酰胺。在另一优选的实施方式中，内酰胺是螺环化合物的一部分。
在另一个实施方式中，x是氧取代的杂环基。例如，在一实施方式中，x为
其中r7为h或c1-c4烷基。
在另一实施方式中，本发明提供式(i)化合物，其中x是杂芳基，优选甲基取代的四唑。
在另一实施方式中，本发明提供式(i)化合物，其中x为-ch2n(ch3)2。
在又一实施方式中，本发明提供式(i)化合物，其中x是任选被c1-c6烷基取代的-ch2-吗啉或-ch2-哌嗪。例如；
在y取代
另一方面，还发现在式(i)的y位的中心环上加入卤素或甲基可以改善这些化合物的生物学特性，通常是观察到的抑制坏死性凋亡的更大效力。与该位置上的其它取代基(如三氟甲基，意外地失去了对坏死性凋亡抑制的所有功效)相比，这更有利。证明这种比较的示例如下所示。
因此，在某些实施方式中，本发明提供了式(i)化合物，其中y为卤素或甲基。在另一优选例中，y为氯或氟。
在v取代
另一方面，上述式(i)所示的v位的苯环上选择某些取代基导致坏死性凋亡抑制增加和/或脱靶活性降低。如下所示，当在环上引入两个间位取代基时，这特别容易观察到。
来自au2014903569的化合物3(10)
因此，在一些实施方式中，本发明提供了式(i)化合物，其中v1、v3和v5是氢，且v2和v4各自独立地选自下组：卤素、c1-c6卤代烷基、c1-c6烷基和c1-c6卤代烷氧基。优选地，v2和v4各自独立地选自下组：-f、-cl、-ocf3和cf3。
具有几种不同取代的化合物：
在另一方面，本发明人研究了核心结构的变化，试图采用上述修饰的有利特性来制备展现出良好的坏死性凋亡抑制和低脱靶活性的化合物。
例如，通过在中心碳y位添加卤素基团以获得坏死性凋亡抑制的高效力，并在x处加入酰胺取代基且在w处加入甲基以达到低脱靶活性，获得优异的生物学特性，如下面(12)所示。
因此，在某些实施方式中，本发明提供式(i)的化合物，其中提供了本文所述的两种或更多种优选实施方式的组合。
本发明的另一方面，提供了新的式(i)化合物。
又一方面，提供了一种组合物，包含如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药，以及药学上可接受的赋形剂。
如本文所用，术语“烷基”是指具有1至12个碳原子(或之间的任何范围，即其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子)的直链或支链烃基。烷基任选被取代基取代，允许多个取代度。本文使用的“烷基”的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基等。
如本文所用，术语“c1-c3烷基”、“c1-c4烷基”和“c1-c6烷基”是指如上所定义的分别含有至少1个，至多3个、4个或6个碳原子或之间的任何范围的烷基(例如含有2-5个碳原子的烷基也在c1-c6的范围内)。在使用术语“c0-c2烷基”的情况下，可以不存在烷基或含有1或2个碳原子的烷基。
作为取代烷基的实例，术语–(c1-c4烷基)n(c1-c4烷基)2包括–ch2n(ch3)2、–(ch2)2n(ch3)2、-ch2n(ch2ch3)2、-ch2n(ipr)(ch3)等。
如本文所用，术语“卤素”指氟(f)、氯(cl)、溴(br)或碘(i)，术语“卤代(halo)”是指卤素基团氟(-f)、氯(-cl)、溴(-br)和碘(-i)。优选地，“卤代”是氟或氯。
如本文所用，术语“环烷基”是指非芳香族环状烃环。类似地，术语“c3-c7环烷基”是指具有3至7个碳原子(或之间的任何范围)的非芳香族环状烃环。例如，c3-c7环烷基也包括含有4-6个碳原子的环烷基。烷基如上所定义，并且可以被取代。可用于本发明的示例性“c3-c7环烷基”包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
如本文所用，术语“杂环”或“杂环基”是指饱和或具有一个或多个不饱和度的非芳族杂环，其含有一个或多个选自s、s(o)、s(o)2、o或n的杂原子取代基。杂环基可以通过其结构上的任何原子(包括杂原子)连接。术语“c3-c7杂环基”是指具有3至7个碳原子、含有如本文所述的一个或多个杂原子取代的非芳族环状烃环。杂环部分可以被取代，允许多个取代度。术语“c3-c7杂环基”还包括含有c4-c5,c5-c7,c6-c7,c4-c7,c4-c6和c5-c6碳原子的杂环基。优选地，杂环含有4-6个碳原子和一个或两个杂原子。更优选地，杂环含有五个碳原子和一个杂原子，或四个碳原子和两个杂原子取代，或五个碳原子和一个杂原子。这种环可以任选地与一个或多个其它“杂环的”环或环烷基环稠合。“杂环的”部分的实例包括但不限于：四氢呋喃、吡喃、氧杂环丁烷、1,4-二氧己环、1,3-二氧己环、哌啶、哌嗪、n-甲基哌嗪基、2,4-哌嗪二酮、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、吗啉、硫代吗啉、四氢噻喃和四氢噻吩等。
作为取代的杂环基的实例，术语“(c0-c4烷基)c3-c7杂环基”包括不含烷基作为化合物和杂环之间的接头，或含有1、2、3或4个碳原子的烷基作为化合物和杂环之间的接头的杂环基(例如杂环，-ch2-杂环或-ch2ch2-杂环)。烷基接头可以结合杂环基的任何原子，包括杂原子。这些杂环中的任何一个可以进一步被取代。
取代的杂环基的实例是
取代的环烷基和杂环基可以被如下所述的任何合适的取代基取代。它们可以在环上的任何碳上被另一个环烷基或杂环部分取代，形成螺环化合物。
如本文所用，术语“芳基”是指任选取代的苯环或稠合至一个或多个任选取代的苯环形成的任选取代的苯环体系，例如蒽，菲或萘环体系。“芳基”基团的实例包括但不限于苯基、2-萘基、1-萘基、联苯基，以及它们的取代的衍生物。优选的芳基包括芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基、杂芳基。
如本文所用，术语“杂芳基”是指单环五、六或七元芳环，或包含至少一个单环五、六或七元芳环的稠合双环或三环芳环体系。这些杂芳基环包含一个或多个氮，硫和/或氧杂原子，其中n-氧化物和硫氧化物和二氧化物是可允许的杂原子取代，并且可以任选地被至多三个成员取代。本文使用的“杂芳基”基团的实例包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噻唑基、恶唑基、异恶唑基、恶二唑基、氧代-吡啶基、噻二唑基、异噻唑基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基及其取代形式。
如本文所用，术语“4-7元内酰胺”是指由4至7个成员(包括氮原子)构成的内酰胺环。这可以包括取代的内酰胺。未取代的4-7元内酰胺的实例如下所示。优选地，4-7元内酰胺为5元内酰胺。
取代的内酰胺可以被如下所述的任何合适的取代基取代。它们也可以在内酰胺环中的任何碳上被环状或杂环部分取代，形成螺环取代基。形成螺取代基的取代的4-6元内酰胺的实例包括但不限于：
如本文所用的“取代基”是指与感兴趣的分子内的原子共价键合的分子部分。例如，“环取代基”可以是这样的部分，例如本文所述的卤素，烷基或其它取代基，其共价键合到作为环成员的原子，优选碳或氮原子。如本文所用，术语“取代的”是指在指定原子上的任何一个或多个氢被来自所指示的取代基的选择取代，条件是不超过指定的原子的正常化合价，以及所述取代产生稳定的化合物(即，可被分离、表征和测试其生物活性的化合物)。
如整个说明书中所用，术语“任选取代的”或“可以被取代的”等，表示该基团可以被或不被一个或多个非氢取代基进一步取代或稠合(以形成多环体系)。对于本领域技术人员来说，特定官能团的合适的化学上可行的替代物是显而易见的。
取代基的实例包括但不限于：
c1-c6烷基、c1-c6卤代烷基、c1-c6卤代烷氧基、c1-c6羟基烷基、c1-c6羟基烷氧基、c3-c7杂环基、c3-c7环烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷基硫烷基(alkylsulfanyl)、c1-c6烷基亚磺酰基(alkylsulfenyl)、c1-c6烷基磺酰基、c1-c6烷基磺酰基氨基、芳基亚磺酰基氨基(arylsulfonoamino)、烷基羧基、烷基羧基酰胺、氧代(oxo)、羟基、巯基、氨基、酰基、羧基、氨基甲酰基、芳基、芳氧基、杂芳基、氨基磺酰基、芳酰基、芳酰氨基、杂芳酰基、酰氧基、芳酰氧基、杂芳酰氧基(heteroaroyloxy)、烷氧基羰基、硝基、氰基、卤素、脲基或c1-c6全氟烷基。在一个实施方式中，环状或杂环取代基可以在环或杂环基团被取代的部分中与碳形成螺环取代基。
任何这些基团可以在适当的情况下进一步被任何上述基团取代。例如，烷基氨基或二烷基氨基、c1-c6烷氧基等。
在本发明的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制坏死性凋亡的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
另一方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制坏死性凋亡的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的含式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物。
在本发明的另一方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制坏死性凋亡的方法，所述方法包括施用治疗有效量的与混合谱系激酶结构域样(mlkl)蛋白的假激酶结构域的atp结合位点结合的如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药。
在本发明的另一方面，提供了一种在有需要的受试者中抑制坏死性凋亡的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物，其与混合谱系激酶结构域样(mlkl)蛋白的假激酶结构域的atp结合位点结合。
如本文所用，术语“有效量”是指将引起例如由研究者或临床医生所希望的组织，系统，动物或人的生物学或医学反应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”是指任何这样的量，与没有接受此类量的相应受试者相比，导致疾病、病症或副作用的改善的治疗、愈合或减轻，或者疾病或病症的进展速率的降低。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
在本发明的一个实施中，施用如式(i)的化合物抑制mlkl的构象变化。在另一个实施方式中，mlkl的构象变化涉及mlkl的四螺旋束(4hb)结构域的解离。在另一个实施方式中，施用所述化合物抑制mlkl的低聚。在另一个实施方式中，施用所述化合物抑制mlkl迁移至细胞膜。在另一个实施方式中，施用所述化合物抑制mlkl的构象变化，抑制mlkl的低聚并抑制mlkl迁移至细胞膜。
可以设想，本发明的一些化合物可以结合各种物种的mlkl并抑制坏死性凋亡。
如本文所用，本领域技术人员所理解的术语“假激酶结构域”是指含有催化无活性或催化缺陷型激酶结构域的蛋白质。通常将“假激酶结构域”称为“蛋白激酶样结构域”，因为这些结构域缺乏已知催化磷酸转移的保守残基。本领域技术人员应当理解，尽管假激酶结构域预测主要作为催化独立蛋白相互作用模块起作用，但是几个假激酶结构域已被归因于意想不到的催化功能。因此，在本发明中，术语“假激酶结构域”包括缺乏激酶活性的“假激酶结构域”和具有弱激酶活性的“假激酶结构域”。
如本文所用，本领域技术人员所理解的术语“atp结合位点”是指促进atp附着于靶蛋白的蛋白亚基的特异性序列。atp结合位点是这样的蛋白质微环境，其中atp被捕获并水解成adp，从而释放能量,该能量被蛋白质利用通过改变该蛋白质形状和/或使酶具有催化活性而起作用。在假激酶结构域中，“atp结合位点”通常被称为“假活性位点”。术语“atp结合位点”也可以称为“核苷酸结合位点”，因为在该位点的结合包括atp以外的核苷酸的结合。本领域技术人员将理解，术语“核苷酸”包括任何核苷酸。示例性核苷酸包括但不限于amp、adp、atp、amppnp、gtp、ctp和utp。
如本文所描述的，抑制坏死性凋亡包括完全和部分抑制坏死性凋亡。在一实施方式中，抑制坏死性凋亡为完全抑制。在另一实施方式中，抑制坏死性凋亡为部分抑制。
化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合可以通过本领域技术人员认为适用于这种用途的任何方法来测定。在本发明的一个实施方式中，化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合通过选自以下的一种或多种检测来测定：包括但不限于热漂移检测，表面等离子体共振(spr)和饱和转移差谱nmr(std-nmr)。在另一个实施方式中，化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合通过热漂移检测来测定。在另一个实施方式中，化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合通过spr来测定。在另一个实施方式中，化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合通过std-nmr来测定。在另一个实施方式中，化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合通过热漂移检测和一个或多个另外的检测来测定。在另一个实施方式中，所述另外的检测选自下组包括但不限于：spr和std-nmr。
热漂移检测，也称差示扫描荧光法(dsf)，是一种热变性测定法，用于检测靶蛋白的热稳定性，并在配体与蛋白质结合后蛋白质熔解温度随后升高。低分子量配体的结合可以增加蛋白质的热稳定性，并且通过在荧光染料存在下进行热变性曲线来测量热稳定性变化。所使用的荧光染料通常是非特异性染料(例如syproorange)，并且非特异性地结合疏水表面，水强烈地猝灭荧光染料的荧光。当蛋白质解折叠时，暴露的疏水表面结合染料，导致荧光增加。通过逐渐增加温度来展开蛋白质并测量每个点的荧光，获得蛋白质解折叠转变(熔解温度，tm)的稳定性曲线及其中点值。测量仅蛋白质和蛋白质加配体的曲线，并计算δtm。正的δtm值表示配体使蛋白质从变性中稳定下来，并因此结合蛋白质。在组合样品温度控制和染料荧光检测的仪器上(如容易获得的实时聚合酶链反应(rt-pcr))进行基于荧光的热漂移检测。
表面等离子体共振(spr)技术是一种公认的方法，用于测量结合于表面的分子和量化表面固定的蛋白质和待测物(例如溶液中的其它蛋白质、肽、核酸、脂质或小分子)之间的结合常数，而不用标签。spr作用依赖于与固定化表面相邻的溶液的折射系数的改变，并且是非常灵敏的。结合响应以共振单位(ru)测量，并且与传感器芯片表面上的分子量成比例，因此与表面上的分子数成比例。相互作用的亲和力可以通过速率常数的比(kd＝kdiss/kass)或在不同浓度的待测物处于平衡状态时的响应的线性或非线性拟合来计算。
饱和转移差谱nmr(std-nmr)允许检测小分子配体与大分子受体如蛋白质的瞬时结合。在std-nmr中，通过直接观察配体本身的nmr信号来测量从受体转移到其结合配体的磁化。低功率辐射应用于含有蛋白信号但不含配体信号的(1)hnmr光谱区域。这种辐射通过自旋扩散过程迅速扩散遍及膜蛋白，使所有蛋白质(1)hnmr信号饱和。瞬时结合于膜蛋白的配体的(1)hnmr信号变成饱和，并且在解离时用于降低从游离配体池测量的(1)hnmr信号的强度。在不导致饱和转移到配体的条件下，用置于蛋白质和配体的光谱区域外的辐射脉冲重复实验。减去两个产生的光谱以产生差光谱。所得到的差光谱仅产生经历饱和的那些共振，即受体和与受体结合的化合物的那些共振。因此，std-nmr可用于测定化合物的结合表位。竞争性std-nmr方法将std-nmr与竞争结合实验相结合，以检测在nmr时间尺度上进行缓慢化学交换的高亲和力配体。通过该技术，可以通过低亲和性指示剂配体的std信号的消失或降低来检测所述化合物的混合物中竞争的高亲和力配体的存在。因此，该方法可以基于std指示剂的信号强度的降低，用于获得化合物的结合亲和力(kd)。
如本文所述，与mlkl蛋白的假激酶结构域的atp结合位点结合的化合物，可以是如式(i)的任何化合物或其盐、溶剂化物或前药，其发挥所述作用，从而影响坏死性凋亡的抑制。
所述化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合可能抑制效应激酶对mlkl的磷酸化，或者化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合可能不抑制效应激酶对mlkl的磷酸化。本发明表明，如本文所述的与mlkl蛋白的假激酶结构域的atp结合位点结合的化合物可以抑制坏死性凋亡而不抑制效应激酶对mlkl的磷酸化。在一个实施方案中，所述化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合不会抑制效应激酶对mlkl的磷酸化。在另一个实施方案中，所述化合物与mlkl的假激酶结构域的atp结合位点的结合抑制效应激酶对mlkl的磷酸化。
另一方面，提供式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药在制备用于抑制受试者中坏死性凋亡的药物中的用途。
另一方面，提供含式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物在制备用于抑制受试者中坏死性凋亡的药物中的用途。
另一方面，提供了式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药抑制坏死性凋亡的用途。
另一方面，提供了含式(i)化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物抑制坏死性凋亡的用途。
又一方面，提供了如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药，用于抑制坏死性凋亡。
又一方面，提供了含如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物，用于抑制坏死性凋亡。
又一方面，提供了一种用于抑制坏死性凋亡时的如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药。
又一方面，提供了一种用于抑制坏死性凋亡时的含如式(i)的化合物或其盐、溶剂化物或前药的组合物。
式(i)化合物的盐优选是药学上可接受的，但应当理解，非药学上可接受的盐也在本发明的范围内，因为它们可用作制备药学上可接受的盐的中间体。
术语“药学上可接受的”可用于描述任何药学上可接受的盐、水合物或前药或在给予受试者时能够(直接或间接)提供式(i)化合物或活性代谢物或其残基的任何其它化合物。
合适的药学上可接受的盐包括但不限于药学上可接受的无机酸的盐，例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸、和氢溴酸、或药学上可接受的有机酸的盐、例如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、软脂酸、油酸、月桂酸、泛酸、丹宁酸、抗坏血酸和戊酸。
碱性盐包括但不限于那些与药学上可接受的阳离子形成的盐，例如钠、钾、锂、钙、镁、锌、铵，烷基铵如由三乙胺形成的盐、烷氧基铵如与乙醇胺形成的那些，和由乙二胺、胆碱或氨基酸(如精氨酸、赖氨酸或组氨酸)形成的盐。关于药学上可接受的盐类型及其形成的通用信息对本领域技术人员是已知的，并且描述在常规教科书中，例如“药物盐手册(handbookofpharmaceuticalsalts)”p.h.stahl，c.g.wermuth，第一版，2002，wiley-vch。
在化合物是固体的情况下，本领域技术人员将理解，本发明化合物、试剂和盐可以存在不同的晶体或多晶型形式，所有这些都落在本发明和具体公式的范围内。
术语“多晶型物”包括式(i)化合物的任何结晶形式，例如无水形式、含水形式、溶剂化物形式和混合溶剂化物形式。
化合物(i)包括(如适用)所述化合物的溶剂化和非溶剂化形式。因此，式(i)包括具有指定结构的化合物，包括水合或溶剂化形式，以及非水合和非溶剂化形式。
如本文所用，术语“溶剂化物”是指由溶质(在本发明中，式(i)化合物或其盐或前药)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。出于本发明目的，这些溶剂可能不干扰溶质的生物活性。合适的溶剂的实例包括但不限于水、甲醇、乙醇和乙酸。优选使用的溶剂为药学上可接受的溶剂。合适的药学上可接受的溶剂的实例包括但不限于水，乙醇和乙酸。最优选使用的溶剂是水。
碱性含氮基团可以用这样的试剂季铵化，如低级烷基卤(如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯和二乙基酯；及其他。
“前药”是一种化合物，其可能不完全满足本文提供的化合物的结构要求，但在施用于受试者或患者之后在体内进行修饰以产生本文提供的式(i)化合物。例如，前药可以是本文提供的化合物的酰化衍生物。前药包括其中羟基、羧基、胺或巯基键合到当施用到哺乳动物受试者时断裂以分别形成游离羟基、羧基、氨基或巯基的任何基团的化合物。前药的实例包括，但不限于本文提供的化合物中的醇和胺官能团的乙酸酯、甲酸酯、磷酸酯和苯甲酸酯衍生物。可以通过修饰存在于所述化合物中的官能团以使所述修饰在体内断裂以产生母体化合物来制备本文提供的化合物的前药。
前药包括其中共价连接到游离氨基和式(i)化合物的酰胺基的氨基酸残基或两个或多个(如两个、三个或四个)氨基酸残基的多肽链的化合物。氨基酸残基包括通常由三个字母符号表示的20个天然存在的氨基酸，还包括4-羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、锁链素(demosine)、异锁链素(isodemosine)、3-甲基组氨酸、正缬氨酸(norvlin)、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸和甲硫氨酸砜。前药还包括其中碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯通过羰基碳前药侧链共价结合到上述式(i)的取代基上的化合物。
式(i)的化合物及其前药可以是蛋白质活性位点的共价不可逆或共价的可逆抑制剂。
药物组合物可以由如式(i)的化合物被配制成适合各种给药途径包括例如局部(如透皮或眼部)、口服、口腔、鼻腔、阴道、直肠或肠胃外给药。如本文所用，术语肠胃外包括皮下、皮内、血管内(例如静脉内)、肌肉内、脊髓、颅内、鞘内、眼内、眼周、眶内、滑膜内和腹膜内注射以及任何类似的注射或输液技术。在某些实施方案中，优选适合于口服或肠胃外使用的形式的组合物。合适的口服形式包括例如片剂、锭剂、糖锭剂、水性或油性悬浮液、分散粉末或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊、糖浆剂或酏剂对于静脉内、肌内、皮下或腹膜内给药，可以将一种或多种化合物与无菌水溶液组合，所述无水水溶液优选与受体血液等渗。通过将固体活性成分溶解在含有生理上相容的物质(如氯化钠或甘氨酸)并具有与生理条件相容的缓冲ph的水中以产生水溶液，并使得所述溶液无菌来制备此类制剂。制剂可以存在于单位或多剂量容器，例如密封的安瓿或小瓶中。组分的实例描述于martindale-药学大全(theextrapharmacopoeia)(pharmaceutical出版社，伦敦1993)和martin(编辑)，雷明顿制药科学(remington’spharmaceuticalsciences)。
在本说明书的上下文中，术语“给药”和该术语的变化包括“给予”和“施用”包括通过任何适当的方式将本发明的化合物或组合物接触、应用、递送或提供给生物体或表面。
为了抑制坏死性凋亡，如本发明的生物活性化合物的剂量可以在宽范围内变化，并且可以根据个体需求进行调整。通常本发明的活性化合物以治疗有效量施用。优选的剂量范围为每天每千克体重约0.1mg至约140mg(例如每天每个患者约0.5mg至约7g)。日剂量可以以单一剂量或以多个剂量施用。可以与载体物质结合以产生单一剂型的活性成分的量根据治疗的患者以及施用的特定模式而改变。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg的活性成分。
然而，应当理解，任何特定受试者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食习惯、施用时间、给药途径和排出速度，药物组合(即用于治疗受试者的其他药物)以及正在接受治疗的特定病症的严重程度。如果化合物在局部施用而不是全身施用，并且用于预防而不是治疗，则剂量通常较低。这样的治疗可以根据需要和治疗医师判断必要的时间段经常施用。本领域技术人员将理解，可能需针对每个个体优化待施用的式(i)化合物的给药方案或治疗有效量。药物组合物可以含有约0.1至2000mg范围内的活性成分，优选约0.5至500mg范围内，最优选约1至200mg之间。约0.01至100mg/kg体重，优选约0.1至约50mg/kg体重的日剂量可能是适当的。日剂量可以每天给药1-4次。
还应当理解，治疗不同疾病可能需要不同的剂量。药剂的有效量是导致坏死性凋亡统计学上显著降低的量。
对于体外分析，可以通过用于测量tsq诱导的坏死性凋亡的测定法来测定坏死性凋亡的抑制，如本文定义的生物测试中所述。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指导致改善或修复坏死性凋亡的症状和/或相关疾病或其症状的式(i)化合物的量。
术语“治疗的”，“治疗(treatment)”和“治疗法”在本文中用于指治疗疗法，预防性治疗和预防性治疗法。因此，在本发明的上下文中，术语“治疗”包括治愈，改善或调节坏死性凋亡和/或相关疾病或其症状的严重程度。
如果在施用本发明的化合物或药物组合物后发展，则“预防的”或“预防”是指防止坏死性凋亡的发生或缓和坏死性凋亡的严重程度。
“对象”包括任何人类或非人的动物。因此，除了可用于人类治疗之外，本发明的化合物还可用于兽医治疗哺乳动物，包括伴侣动物和农场动物，例如但不限于狗、猫、马、牛、绵羊和猪。
术语“抑制”用于描述任何形式的抑制作用，其导致预防、减少或以其他方式改善坏死性凋亡，包括完全和部分抑制。
本发明的化合物可以与如上所述的药物载体、稀释剂或赋形剂一起施用。
本发明的方法可用于预防或治疗受试者中的以下疾病和/或病症：
骨骼、关节、结缔组织和软骨疾病如骨质疏松症，骨髓炎，关节炎(包括例如骨关节炎，类风湿性关节炎和银屑病关节炎)，无血管性坏死，进行性骨化性纤维发育不良，佝偻病，库欣综合征；
肌肉疾病如肌营养不良症，例如杜氏肌营养不良症，肌强直性营养不良症，肌病和肌无力症；
皮肤疾病，如皮炎，湿疹，银屑病，老化甚至疤痕的改变；
心血管疾病，例如心脏和/或血管缺血，心肌梗塞，缺血性心脏病，慢性或急性充血性心力衰竭，心律失常，心房颤动，心室颤动，阵发性心动过速，充血性心力衰竭，肥厚性心脏病，缺氧，低氧，由于用抗癌剂进行治疗而引起的副作用；
循环系统疾病，例如动脉粥样硬化，动脉硬化，外周血管疾病，脑血管中风，动脉瘤；
血液学和血管疾病，例如贫血，血管淀粉样变性，出血，镰状细胞病，红细胞破裂综合征(redcellfragmentationsyndrome)，嗜中性白细胞减少症，白细胞减少症，髓发育不全，全血细胞减少症，血小板减少症，血友病；
肺部疾病包括肺炎、哮喘；阻塞性慢性肺疾病如慢性支气管炎和肺气肿；
胃肠道疾病，如溃疡；
肝脏疾病，例如肝炎特别是病毒起因的或具有作为致病因子的其他传染因子的肝炎、自身免疫性肝炎、暴发性肝炎，某些遗传代谢性病症，威尔逊氏病(wilson’sdisease)，肝硬化，非酒精性肝脂肪变性，由于毒素或药物而引起的肝脏疾病；
胰腺疾病例如急性或慢性胰腺炎；
代谢疾病如糖尿病和尿崩症(insipiddiabetes)，甲状腺炎；
肾疾病，例如急性肾病症或肾小球肾炎；
病毒和细菌感染，例如败血病；
由化学试剂、毒素或药物引起的严重中毒；
与获得性免疫缺陷综合征(aids)相关的退行性疾病；
与老化相关的疾病如加速衰老综合征；
炎性疾病如克罗恩病(crohn’sdisease)，风湿性多发性关节炎(rheumatoidpolyarthritis)；
自身免疫性疾病如红斑狼疮；
牙科疾病，例如导致组织降解的那些牙疾病，例如牙周炎；
眼科疾病或病症，包括糖尿病性视网膜病变，青光眼，黄斑变性，视网膜变性，色素性视网膜炎，视网膜裂孔或撕裂，视网膜脱离，视网膜缺血，与创伤相关的急性视网膜病变，炎症性退化(inflammatorydegenerations)，手术后并发症，药物视网膜病变，白内障；
听觉通道(auditiontracts)病症，例如耳硬化和由抗生素引起的耳聋；
与线粒体相关的纤维化疾病(线粒体病变)，如弗里德里希共济失调(friedrich’sataxia)，伴随有结构性线粒体异常的先天性肌营养不良，某些肌病(melas综合征，merff综合征，皮尔森综合征)，midd(线粒体糖尿病和耳聋)，沃尔弗拉姆综合征(wolfram’ssyndrome)，肌张力障碍；和
癌症和转移包括但不限于肺和支气管癌，包括非小细胞肺癌(nsclc)，肺鳞癌，细支气管肺泡癌(bac)，肺腺癌和小细胞肺癌(sclc)；前列腺癌，包括雄激素依赖性和雄激素非依赖性前列腺癌；乳腺癌，包括转移性乳腺癌；胰腺癌；结肠癌和直肠癌；甲状腺癌；肝癌和肝内胆管癌；肝细胞癌；胃癌；子宫内膜癌；黑色素瘤；肾脏、肾盂、膀胱癌、子宫体和子宫颈癌；卵巢癌，包括进行性上皮或原发性腹膜癌；多发性骨髓瘤；食管癌，包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌；急性骨髓性白血病(aml)；)慢性粒细胞白血病(cml)，包括加速期cml和cml急变期(cml-bp)；淋巴细胞性白血病；骨髓性白血病；急性淋巴细胞白血病(all)；慢性淋巴细胞白血病(cll)；霍奇金病(hodgkin’sdisease)(hd)；非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’slymphoma)(nhl)，包括滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤；b细胞淋巴瘤，包括弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)；t细胞淋巴瘤；多发性骨髓瘤(mm)；淀粉样变性；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom’smacroglobulinemia)；骨髓增生异常综合征(mds)，包括难治性贫血(ra)，难治性贫血伴环状铁幼粒细胞增多(rars)，(难治性贫血伴原始细胞增多(raeb))和转化中的raeb(raeb-t)；和骨髓增殖性综合征；脑癌，包括胶质瘤/胶质母细胞瘤，间变性少突胶质细胞瘤和成人间变性星形细胞瘤；神经内分泌癌，包括转移性神经内分泌肿瘤；头颈部肿瘤，包括例如头颈鳞状细胞癌和鼻咽癌；口腔癌，咽癌和小肠癌；骨癌；软组织肉瘤和绒毛结肠腺瘤。
这些方法也可用于保护细胞、组织和/或移植的器官，无论是否在移植之前、之间(除去，运输和/或重新植入)或之后。
本文所述的方法和化合物通过以下说明性和非限制性实施例进行描述。
实施例
1.1材料和方法
化合物
所有的温度均为℃。
使用chemdrawultra12.0获得以下化合物的名称。
缩写
acoh乙酸
alcl3氯化铝
binap2,2’-双(二苯基膦)-1,1’-联萘基
(boc)2o二碳酸二叔丁酯
cdcl3氘代氯仿
cdi1,1’-羰基二咪唑
cs2co3碳酸铯
dmso-d6氘代二甲亚砜
dcc二环己基碳二亚胺
dcm二氯甲烷
dipea二异丙基乙胺
dmfn,n-二甲基甲酰胺
dmso二甲基亚砜
tea三乙胺
etoac乙酸乙酯
etoh乙醇
hr小时
hatu1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶嗡3-氧化物六氟磷酸盐
hcl盐酸/氯化氢
hplc高效液相色谱法
k2co3碳酸钾
lcms液相色谱-质谱
m摩尔(浓度)
meoh甲醇
min分钟
m/z质量/电荷比(质谱)
na2co3碳酸钠
nah氢化钠
nahco3碳酸氢钠
naoh氢氧化钠
na2so4硫酸钠
nh4cl氯化铵
nmpn-甲基-2-吡咯烷酮
nmr核磁共振
pd/c钯活性炭
pd2(dba)3三(二亚苄基丙酮)二钯(0)
rt保留时间
rt室温
sem-cl2-(三甲基硅烷基)乙氧甲基氯
socl2亚硫酰氯
tfa三氟乙酸
thf四氢呋喃
tsoh对甲苯磺酰氯
xantphos4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽
lcms方法
使用以下方法进行电喷雾质谱(ms)；
方法a(10分钟法)：finniganlcqadvantagemax采用反相高效液相色谱(hplc)分析(色谱柱：gemini3μc1820×4.0mm110a)溶剂a：水0.1％甲酸，溶剂b：乙腈0.1％甲酸，梯度：10-100％b，10分钟；检测：100-600nm，使用电喷雾电离(esi)正模式，源温度为300℃。
方法b(5分钟法)：lc型号：安捷伦1200(agilent1200)(泵类型：二元泵，检测器类型：dad)ms型号：安捷伦g6110a四极杆。色谱柱：xbridge-c18,2.5μm，2.1×30mm。柱温：30℃。吸收波长：214nm，254nm。流动相a:0.07％hcooh水溶液，b：甲醇。运行时间：5分钟。ms:离子源：es+(或es-)。ms范围：50～900m/z。破裂电压：60。干燥气体流速：10l/min。雾化器压力：35psi。干燥气体温度：350℃。vcap:3.5kv。
制备质谱lc
方法a：
仪器：
waterszq3100-质谱检测器，waters2545泵，waterssfo流动相管理系统，waters2996二极管阵列检测器，waters2767样品管理器
lc条件：
反相hplc分析
色谱柱：xbridgetmc185μm19x50mm。注射体积500μl
溶剂a：水0.1％甲酸。溶剂b：乙腈0.1％甲酸
梯度：5％b超过4分钟，然后5-100％b超过8分钟，然后100％b超过4分钟
流速：19l/min。检测：100-600nm
ms条件：
离子源：单四极杆。离子模式：es正离子。源温度：150℃
反溶剂温度：350℃。检测：离子计数。毛细管(kv)-3.00。锥(v)：30
提取器(v)：3射频镜头(v)：0.1扫描范围：100-1000amu扫描时间：0.5秒
吸收时间：10分钟
气体流速：
去溶剂l/小时-650
圆锥l/小时-100
制备型hplc
仪器类型：
varian940lc。泵类型：二元泵。检测器类型：pda
lc条件：
色谱柱：waterssunfireprepc18obd，5μm，19×100mm。吸收波长：214nm，254nm。流动相：a：0.07％tfa水溶液，b：meoh，0.07％tfa。
nmr
除非另有说明，核磁共振(1hnmr,600mhz或400mhz)光谱在300k下以cdcl3为溶剂得到。化学位移在δ数值范围上以ppm表示，并以适当的溶剂峰为参考。
中间体a的合成
步骤1：n-甲基-4-硝基苯胺
向1-氟-4-硝基苯(50.0g，354mmol)在dmso(200ml)中的溶液中加入甲胺盐酸盐(47.1g，709mmol)和碳酸钾(98.0g，709mmol)。将所得混合物在氮气氛下在70℃下搅拌过夜。tlc分析表明反应完成。将混合物倒入水中，得到沉淀，将其滤出，然后用另外的水洗涤并干燥，得到所需产物，为黄色固体(50g，93％)。lcms(方法b)：1.63min[mh]+＝153.1,[mna]+＝175.1.
步骤2：2-氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺
向n-甲基-4-硝基苯胺(30.0g，197mmol)在dmf(150ml)中的溶液中加入2,4-二氯嘧啶(29.4g，197mmol)和碳酸钾(40.88g，296mmol)。将所得混合物在80℃下搅拌过夜。将混合物用乙酸乙酯(300ml)和水(200ml)稀释，合并的有机相用水、盐水(brine)洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯，10:1至3:1)纯化，得到所需产物(20g，38％)，为黄色固体。lcms(方法b)：2.34min[mh]+＝265.0,267.0,[mna]+＝287.0,289.0.
步骤3：3-((4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺
向2-氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(1.0g，3.8mmol)在1,4-二氧己环(10ml)溶液中加入3-氨基苯磺酰胺(651mg，3.8mmol)和浓hcl(0.5ml)。将所得混合物在微波下在160℃搅拌2小时。lcms和tlc分析表明反应完成。减压下去除溶剂，得到残余物。将残余物溶于naoh水溶液(4m)和dcm中。有机层用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(dcm/meoh，30:1至10:1)纯化，得到所需产物(1g，67％)，为黄色固体。lcms(方法b)：0.96min[mh]+＝401.1.
步骤4：(中间体a)3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺
向3-((4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(800mg，2.0mmol)在etoh(20ml)的溶液中加入锌(1.3g，20mmol)和nh4cl(水溶液30ml)。将所得混合物在90℃下搅拌2小时。lcms和tlc分析表明反应完成。滤出混合物，真空浓缩液体以除去etoh，然后滤出混合物，得到所需产物(320mg，43％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.34(s,3h),5.22(s,2h),5.68(d,j＝6.0hz,1h),6.65(d,j＝8.4hz,2h),6.95(d,j＝8.4hz,2h),7.23(s,2h),7.41(m,2h),7.81(m,2h),8.57(s,1h),8.42(s,1h).lcms(方法b)：0.37min[mh]+＝370.1.
中间体b的合成
步骤1：(中间体b)3-(4-(甲基(4-(3-苯基脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基氨基)苯磺酰胺
在底烧瓶中，将3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(中间体a(1.5g，4.1mmol))溶于thf(20ml)。然后加入吡啶(320mg，12.2mmol)。将氯甲酸苯酯(698mg，4.5mmol)缓慢加入混合物中。反应混合物在室温下搅拌过夜。除去溶剂。将粗品用水(2×50ml)、乙醚(2×50ml)洗涤并干燥，得到苯基(4-(甲基(2-((3-氨磺酰基苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸酯(1.5g，76％)，为黄色固体。1hnmr(400mhz,meod-d4):δppm3.54(s,3h),5.87(d,j＝6.4hz,1h),7.28(m,5h),7.45(m,5h),7.68(m,4h),7.82(d,j＝6.4hz,1h),8.62(brs,1h).lcms(方法b)：2.17[m+h]+＝491.2.
中间体c的合成
步骤1：n1-(2-氯嘧啶-4-基)-n1-甲基苯-1,4-二胺
将2-氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(得自中间体a的制备步骤2，100mg，0.38mmol)溶于甲醇(10ml)和nh4cl水溶液(10ml)。加入锌(粉末，245mg，3.0mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物减压浓缩。残余物用etoac(3×20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥。减压除去溶剂，得到黄色固体状的n1-(2-氯嘧啶-4-基)-n1-甲基苯-1,4-二胺(80mg，90％)，直接用于下一步骤。lcms(方法b)：1.10[m+h]+＝235.1
步骤2：(中间体c)1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
在底烧瓶中，将n1-(2-氯嘧啶-4-基)-n1-甲基苯-1,4-二胺(776mg，3.31mmol)溶于dcm(4ml)中。向混合物中加入1-异氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(672mg，3.31mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。滤出白色固体，用dcm(20ml)洗涤，干燥，得到1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(1.06g，73％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.40(s,3h),6.27(d,j＝6.0hz,1h),7.31(m,4h),7.60(m,4h),7.98(d,j＝6.0hz,1h),8.90(s,1h),8.93(s,1h).lcms(方法b)：3.09[m+h]+＝438.2.
中间体d和e的合成
步骤1：
向保持在氮气氛下的2-甲基-5-硝基苯甲酸(3.0g，16.6mmol)在亚硫酰氯(15ml)中的溶液中加入n，n-二甲基甲酰胺(1滴)。将混合物加热回流4小时。将混合物用二氯甲烷(20ml)稀释并浓缩至干，得到白色固体(3.3g，定量)。
步骤2：
在0℃向2-甲基-5-硝基苯甲酰氯(1.1g，5.5mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中加入甲胺(411mg，6.08mmol)和三乙胺(1.67g，16.6mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后用水(30ml)和盐水(20ml)洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到白色固体(800mg，75％)。lcms(酸性，5分钟)：2.58min[mh]+＝195.0.
步骤3：5-氨基-n,2-二甲基苯甲酰胺
向n,2-二甲基-5-硝基苯甲酰胺(350mg，1.80mmol)在甲醇(20ml)中的溶液中加入锌粉(1.5g)和饱和氯化铵水溶液(20ml)。将混合物在室温下搅拌过夜。滤出固体，减压除去溶剂甲醇，得到残余物，在水和乙酸乙酯之间分配。分离有机相，用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩，得到5-氨基-n,2-二甲基苯甲酰胺(250mg，85％)，为浅黄色固体。lcms(方法b)：2.96min[mh]+＝165.2.
步骤4：n,2-二甲基-5-((4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺
向5-氨基-n,2-二甲基苯甲酰胺(250mg，1.52mmol)在1,4-二氧六环(10ml)中的溶液中加入2-氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(来自中间体a的制备步骤2，403mg，1.52mmol)和对甲苯磺酸一水合物(230mg，1.22mmol)。将混合物在120℃下搅拌3小时。在减压下除去溶剂，得到残余物，然后用饱和氨水溶液(30ml)处理，形成沉淀。将固体过滤并减压干燥，得到n,2-二甲基-5-((4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(500mg，87％)，为棕色固体。lcms(方法b)：2.55min[mh]+＝393.1.
步骤5：(中间体d)5-((4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺
向5-(4-(n-甲基-n-(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(200mg，0.51mmol)在甲醇(30ml)中的溶液中加入锌粉(1.0g)和饱和氯化铵水溶液(30ml)。将混合物在室温下搅拌过夜。滤出固体，减压除去溶剂甲醇，得到残余物，在水和乙酸乙酯之间分配。分离有机相，用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩，得到5-((4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(150mg，81％)，为浅黄色固体。lcms(方法b)：1.63min[mh]+＝363.1.
步骤6：(中间体e)苯基(4-((2-((3-(二甲基氨基甲酰基)-4-甲基苯基)氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)氨基甲酸酯
将5-((4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(1.78g，4.92mmol)和diea(1.2g，9.38mmmol)溶解在thf(60ml)中，然后缓慢加入氯甲酸苯酯(771mg，4.92mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。除去溶剂，粗产物通过柱色谱(dcm/甲醇，100:0至100:2)纯化，得到苯基(4-((2-((3-(二甲基氨基甲酰基)-4-甲基苯基)氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)氨基甲酸酯(1.1g，48.7％)，为黄色固体。lcms(方法b)：2.28min[mh]+＝483.2.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.28(s,3h)2.75(d,j＝4.4hz,3h)3.47(s,3h)5.77(brs,1h),7.19(d,j＝8.4hz,1h)7.24–7.30(m,3h)7.38(d,j＝8.8hz,2h)7.36-7.48(m,2h)7.56(d,j＝8.4hz,1h)7.65-7.67(m,3h)7.89(d,j＝6.8hz,1h)8.21(brs,1h)10.35(brs,1h)10.50(brs,1h).
中间体f和g的合成
步骤1：2-氯-5-氟-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺
向烧瓶中加入n-甲基-4-硝基苯胺(760mg，5.0mmol)、2,4-二氯-5-氟嘧啶(835mg，5.0mmol)、碳酸铯(2.44g，7.5mmol)和dmf(15ml)。将混合物在60℃下搅拌过夜。将混合物在乙酸乙酯和水之间分配。水层用乙酸乙酯萃取数次。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，得到残余物，将其通过柱色谱(石油醚/乙酸乙酯，15:1)纯化，得到2-氯-5-氟-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(530mg，38％)，为黄色固体。lcms(方法b)：2.07min[mh]+＝283.0.
步骤2：5-((5-氟-4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺
向2-氯-5-氟-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(1.3g，4.60mmol)、5-氨基-n,2-二甲基苯甲酰胺(来自中间体a的制备步骤2，775mg，4.60mmol)在异丙醇(30ml)中的溶液中加入浓hcl(0.2ml)。将所得混合物在氮气氛下在85℃下搅拌过夜，冷却至室温，用1mnaoh、水和乙酸乙酯稀释。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。残余物通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝100/1至60/1)纯化，得到5-((5-氟-4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(640mg，52％)，为黄色固体。lcms(方法b)：2.55min[mh]+＝411.2.
步骤3：(中间体f)5-((4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺
向5-((5-氟-4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(540mg，1.31mmol)在dmf(20ml)中的溶液中加入锌粉(855mg，13.1mmol)和氯化铵水溶液(20ml)。将所得混合物在50℃下搅拌过夜，冷却至室温，用nahco3水溶液、水和乙酸乙酯稀释。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。残余物通过柱色谱法(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝60/1
步骤4：(中间体g)苯基(4-((5-氟-2-((4-甲基-3-甲基氨基甲酰基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)氨基甲酸酯
向5((4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(454mg，1.19mmol)在thf(12ml)中的溶液中加入吡啶(188mg，2.38mmol)，然后在室温下滴加氯甲酸苯酯(187mg，1.19mmol)。将所得混合物在室温下在氮气氛下搅拌2小时，用1mhcl水溶液、水和乙酸乙酯稀释。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩，得到标题化合物(600mg，100％)，为黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.24(s,3h),2.74(dj＝4.8hz,3h),3.44(s,3h),7.09(dj＝8.4hz,1h),7.29(m,5h),7.47(t,j＝8.0hz,2h),7.54(d,j＝8.4hz,2h),7.61(dd,j＝8.0,2.0hz,1h),7.81(d,j＝2.0hz,1h),7.97(d,j＝5.6hz,1h),8.08(m,1h),9.29(s,1h),10.33(s,1h).lcms(方法b):2.54min[mh]+＝501.2.
中间体h的合成
步骤1：4-氯-n-(2-甲基-5-硝基苯基)丁酰胺
在0℃，向2-甲基-5-硝基苯胺(5.0g，32.9mmol)在dcm(50ml)中的溶液中加入三乙胺(3.99g，39.4mmol)和4-氯丁酰氯(5.1g，36.1mmol)。将溶液在n2下在室温下搅拌4小时。将混合物用dcm(120ml)和水(50ml)稀释。分离有机层，水层用dcm萃取。合并的有机相用0.5mhcl、水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(dcm/meoh，300:1)纯化，得到4-氯-n-(2-甲基-5-硝基苯基)丁酰胺(6.9g，82％)，为浅灰色固体lcms(方法b)：2.20min[mh]+＝257.1/259.1,[mna]+＝279.1/281.1
步骤2：1-(2-甲基-5-硝基苯基)吡咯烷-2-酮
4-氯-n-(2-甲基-5-硝基苯基)丁酰胺(500mg，1.95mmol)在6％naoh/i-proh(1:1,20ml)水溶液中的溶液在n2下在室温下搅拌3小时。将混合物用乙酸乙酯(50ml)和水(20ml)稀释。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(dcm/meoh，250:1至200:1)纯化，得到1-(2-甲基-5-硝基苯基)吡咯烷-2-酮(214mg，52％)，为浅黄色固体。lcms(方法b)：1.23min[mh]+＝221.1,[mna]+＝243.1,[2mh]+＝441.2,[2mna]+＝463.1.
步骤3：1-(5-氨基-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮
向1-(2-甲基-5-硝基苯基)吡咯烷-2-酮(214mg，0.97mmol)在etoac(10ml)中的溶液中加入10％pd/c(30mg)。将反应混合物在氢气氛下在室温下搅拌过夜。通过过滤除去催化剂，并在减压下除去溶剂，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(dcm/meoh，50:1)纯化，得到1-(5-氨基-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮(142mg，77％)，为白色固体。lcms(方法b)：0.52min[mh]+＝191.1,[2mh]+＝381.2,[2mna]+＝403.2.
步骤4：1-(5-(5-氟-4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮
向2-氯-5-氟-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(1.0g，3.54mmol)在异丙醇(10ml)中的溶液中加入1-(5-氨基-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮(673mg，3.8mmol)和浓hcl(0.5ml)。将所得混合物在85℃下搅拌16小时。减压下去除溶剂，得到残余物。将残余物溶于naoh水溶液(4m)和dcm中。分离有机层，用水、盐水洗涤，干燥(用硫酸钠)并减压浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(洗脱剂dcm/meoh，99:1至96:4)纯化，得到1-(5-(5-氟-4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮(1.0g，65％)，为黄色固体。lcms(方法b)：2.70min[mh]+＝437.2.
步骤5：1-(5-(4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮
向1-(5-(5-氟-4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮(1g，2.29mmol)在甲醇(20ml)中的溶液中加入锌(1.5g，22.9mmol)和nh4cl水溶液(10ml)。反应混合物在室温下搅拌16小时。通过过滤除去固体，减压浓缩甲醇层，得到沉淀。通过过滤收集所得沉淀并用水洗涤，得到1-(5-(4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮(600mg，64.5％)，为白色固体。lcms(方法b)：1.85min[mh]+＝407.2
步骤6(中间体h)：4-((5-氟-2-(4-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基氨基甲酸苯酯
将1-(5-(4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)-5-氟嘧啶-2-基氨基)-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮(950mg，2.34mmol)溶于thf(50ml)中。缓慢加入吡啶(554mg，7.01mmol)，然后加入氯甲酸苯酯(403mg，2.574mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，减压浓缩。将粗品固体用水(2×50ml)、乙醚(2×50ml)洗涤，减压干燥，得到4-((5-氟-2-(4-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基氨基甲酸苯酯(860mg，70％)，为黄色固体。lcms(方法b)：2.66min[mh]+＝527.2
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.07(s,3h)2.14(m,2h)2.42(d,j＝8.0hz,2h)3.43(s,3h)3.65(d,j＝6.8hz,2h),7.13(d,j＝8.4hz,1h)7.23–7.29(m,5h)7.43–7.54(m,5h)7.67(d,j＝2.0hz,1h)7.97(d,j＝5.6hz,1h)9.30(s,1h)10.35(s,1h).
脲合成的一般步骤a：
在n2下，向中间体a(1mmol)在干燥dmf(0.2ml)中的溶液中滴加异氰酸酯(1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，减压浓缩，残余物通过制备型质谱引导的lc纯化，得到相应的化合物。
脲合成的一般步骤b：
在n2下，在中间体b(1mmol)在干燥thf中的溶液中加入芳基胺(2mmol)，然后加入diea(2mmol)。将反应混合物加热至60℃持续16小时，减压浓缩，残留物通过制备型hplc纯化，得到相应的化合物。
向2-氯嘧啶中加入苯胺的一般步骤c：
向苯胺(1mmol)和中间体c(1mmol)在2-丙醇(10ml)中的溶液中加入浓hcl溶液(2滴)。将反应混合物加热至80℃持续16小时。除去溶剂，粗产物通过柱色谱纯化，得到相应的化合物。
化合物1
步骤1：nn2-三甲基-5-硝基苯甲酰胺
将2-甲基-5-硝基苯甲酸(1g，5.5mmol)溶解在socl2(15ml)中，然后加入dmf(1滴)。将反应混合物加热回流4小时。在减压下除去过量的亚硫酰氯，加入dcm(3×10ml)并除去，得到白色固体。在另一底烧瓶中，将me2nh.hcl(490mg，6.08mmol)和tea(1.67g，16.6mmol)加入dcm(20ml)中，然后在0℃下缓慢加入2-甲基-5-硝基苯甲酰氯(5.5mmol)的dcm溶液(5ml)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。除去溶剂，粗产物用水(3×30ml)洗涤，干燥，得到所需产物(600mg，52％)，为白色固体。lcms(方法b):1.06min[mh]+＝209.4
步骤2：n,n-二甲基-1-(2-甲基-5-硝基苯基)甲胺
n,n,2-三甲基-5-硝基苯甲酰胺(475mg，2.28mmol)溶于thf(15ml)中，然后在氮气氛下，加入bh3在thf(1mol/l，25ml)中的溶液。将反应混合物加热至60℃持续8小时。tlc和lcms显示反应完成。加入hcl水溶液(2m，20ml)，有机层用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。将合并的有机层用水(30ml)、盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩，得到粗产物，将其通过柱色谱(洗脱液dcm：甲醇，100:0至100:2)纯化，得到所需产物(320mg，72％)，为黄色固体。lcms(方法b):2.31min[mh]+＝195.1
步骤3:3-((二甲基氨基)甲基)-4-甲基苯胺
将n,n-二甲基(2-甲基-5-硝基苯基)甲胺(320mg，1.65mmol)溶于甲醇(30ml)中，加入10％湿pd/c(35mg)。将反应混合物在h2气氛下搅拌过夜。过滤除去催化剂，减压除去溶剂，得到所需产物(200mg，74％)，为黄色固体，直接用于下一步。lcms(方法b):0.25min[mh]+＝165.1
步骤4:1-(4-((2-((3-((二甲基氨基)甲基)-4-甲基苯基)氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲
按照一般步骤c，利用中间体c(140mg,0.32mmol)和3-((二甲基氨基)甲基)-4-甲基苯胺(53mg,0.32mmol)，得到1-(4-((2-((3-((二甲基氨基)甲基)-4-甲基苯基)氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲，为白色固体(50mg,28％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ2.32(s,3h),2.62(s,6h),3.41(s,3h),4.00(brs,2h),5.08(d,j＝5.6hz,1h),7.12(d,j＝8.4hz,1h),7.31(m,4h),7.61(m,5h),7.79(s,1h),7.87(d,j＝7.0hz,1h),9.14(s,1h),9.44(s,1h),9.51(s,1h).lcms(方法b):2.24min[mh]+＝566.3.
化合物2
步骤1:2,5-二氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺
向烧瓶中加入n-甲基-4-硝基苯胺(700mg，4.6mmol)、2,4,5-三氯-嘧啶(1.70g，9.27mmol)、碳酸铯(2.26g，6.94mmol)和dmf(20ml)。将混合物在90℃下搅拌4小时。将混合物在乙酸乙酯和水之间分配。水层用乙酸乙酯萃取数次。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，得到残余物，将其通过柱色谱(石油醚/乙酸乙酯，20：1)纯化，得到2,5-二氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(510mg,40％)，为黄色固体。lcms(方法b):3.11min[mh]+＝299.0.
步骤2:n1-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺
向2,5-二氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(140mg，0.468mmol)在甲醇(10ml)中的混合物中加入锌粉(304mg，4.68mmol)和饱和氯化铵溶液(10ml)。将所得混合物在室温下搅拌16小时。tlc和lcms分析表明产物形成和大量原料残留。然后将混合物加热至60℃持续3小时。滤出锌粉，滤液在乙酸乙酯和1m氢氧化钠溶液之间分配。水层用乙酸乙酯萃取数次。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩得到n1-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺(120mg,95％)为黄色固体。lcms(方法b):2.11min[mh]+＝269.0.
步骤3:1-(4-((2,5-二氯吡啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟-甲氧基)苯基脲
将n1-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺(172mg，0.68mmol)在thf(3ml)中的溶液用1-异氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(95mg，0.468mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配。水层用乙酸乙酯萃取数次。将合并的有机层浓缩，得到残余物，将其通过柱色谱(石油醚/乙酸乙酯，5:1至3:1)纯化，得到1-(4-((2,5-二氯吡啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲(120mg,57％)为白色固体。lcms(方法b):3.33min[mh]+＝472.1.
步骤4:3-((5-氯-4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺
向密封管中加入1-(4-((2,5-二氯-吡啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲(50mg,0.106mmol)、3-氨基苯磺酰胺(18mg，0.106mmol)、浓hcl溶液(2滴)和异丙醇(2ml)。将所得混合物在90℃下搅拌16小时。除去溶剂，残余物通过制备型hplc纯化，得到3-((5-氯-4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(20mg,31％)为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.46(s,3h),7.16(d,j＝8.8hz,2h),7.31(m,4h),7.41(d,j＝8.0hz,1h),7.48(m,3h),7.58(d,j＝7.2hz,2h),7.79(d,j＝8.4hz,1h),8.06(s,1h),8.54(s,1h),8.91(s,1h),8.99(s,1h),9.87(s,1h).lcms(方法b):2.98min[mh]+＝608.1,[mna]+＝630.1.
化合物3
n-2-二甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺
向中间体d(150mg，0.41mmol)在thf(15ml)中的溶液中加入4-(三氟甲氧基)苯基异氰酸酯(91mg，0.45mmol)和n,n-二异丙基乙胺(106mg，0.82mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇，25:1)纯化，得到n-2-二甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(90mg,40％)为白色固体。nmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.23(s,3h),2.73(d,j＝4.4hz,3h),3.40(s,3h),5.75(d,j＝6.0hz,1h),7.06(d,j＝8.4hz,1h),7.26(d,j＝8.4hz,2h),7.30(d,j＝8.4hz,2h),7.57(m,4h),7.65(dd,j＝8.4和2.0hz,1h),7.90-7.81(m,2h),8.09(dd,j＝8.8和4.0hz,1h),8.90(s,1h),8.96(s,1h),9.19(s,1h).lcms(方法b):2.55min[mh]+＝566.2.
化合物4
步骤1:2-甲基-5-硝基苯甲酰氯
向2-甲基-5-硝基苯甲酸(3g，16.6mmol)在亚硫酰氯(15ml)中的溶液中加入dmf(1滴)，将所得混合物在70℃下搅拌4小时。在旋转蒸发器上除去过量的亚硫酰氯，得到2-甲基-5-硝基苯甲酰氯(3.3g，定量)，为白色固体。
步骤2:2-甲基-5-硝基苯甲酰胺
在室温下将2-甲基-5-硝基苯甲酰氯(1.1g，5.53mmol)的溶液加入到饱和氨水溶液(20ml)中，将反应混合物在室温下搅拌5小时。通过过滤收集固体，得到2-甲基-5-硝基苯甲酰胺(800mg，80％产率)，为白色固体。lcms(方法b):0.56min[mh]+＝180.5.
步骤3:5-氨基-2-甲基苯甲酰胺
向2-甲基-5-硝基苯甲酰胺(320mg，1.78mmol)在甲醇(30ml)中的溶液中加入锌粉(1.5g)和饱和氯化铵水溶液(30ml)，将所得混合物在室温下搅拌过夜。通过过滤除去固体，并在旋转蒸发器上除去滤液，得到残余物，将其在水和乙酸乙酯之间分配。有机相用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩，得到通过过滤除去固体，并在旋转蒸发器上除去滤液，得到残余物，将其分配在水和乙酸乙酯之间。有机相用水，盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩，得到5-氨基-2-甲基苯甲酰胺为浅黄色固体(250mg，产率94％)。lcms(方法b):0.27min[mh]+＝151.1.
步骤4:2-甲基-5-((4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺
向5-氨基-2-甲基苯甲酰胺(250mg，1.66mmol)在1,4-二氧六环(20ml)中的溶液中加入2-氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(439mg，1.66mmol)和对甲苯磺酸一水合物(253mg，1.33mmol)。将混合物在120℃下回流搅拌3小时。在旋转蒸发器上除去过量的二氧六环，得到残余物，用饱和氨水溶液(30ml)研磨。过滤收集固体，减压干燥，得到2-甲基-5-((4-(甲基(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺，为棕色固体(590mg，产率94％)。lcms(方法b):1.24min[mh]+＝379.1.
步骤5:5-((4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-甲基-苯甲酰胺
向5-(4-(n-甲基-n-(4-硝基苯基)氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-甲基苯甲酰胺(230mg,0.60mmol)在甲醇(20ml)中的溶液中加入锌粉(1.0g)和饱和氯化铵水溶液(20ml)，并将混合物在室温下搅拌过夜。通过过滤除去固体，将滤液浓缩，得到残余物，将其在水和乙酸乙酯之间分配。有机相用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩，得到5-((4-((4-氨基苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-甲基苯甲酰胺(180mg，产率86％)，为浅黄色固体。lcms(方法b):0.49min[mh]+＝349.1.
步骤6:2-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺.
向4-(n-(4-氨基苯基)-n-甲基氨基)-n-甲基嘧啶-2-甲酰胺(180mg,0.52mmol)在四氢呋喃(10ml)中的溶液中加入4-(三氟甲氧基)苯基异氰酸酯(106mg,0.52mmol)和n,n-二异丙基乙胺(134mg,1.04mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物在减压下浓缩至干，得到残余物，将其通过硅胶色谱(二氯甲烷/甲醇，25:1)纯化，得到2-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(110mg,38％)为浅棕色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.34(s,3h),3.48(s,3h),5.94(brs,1h),7.54-7.13(m,7h),7.88-7.54(m,7h),9.38(s,2h),10.47(s,1h).lcms(方法b):2.48min[mh]+＝552.2.
化合物5
步骤1:n1-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺
向2-氯-5-氟-n-甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(200mg，0.708mmol)在甲醇中的混合物中加入锌粉(460mg，7.08mmol)和氯化铵溶液(3ml)。将所得混合物在60℃下搅拌3小时。滤出锌粉，滤液在乙酸乙酯和1m氢氧化钠溶液之间分配。水层用乙酸乙酯萃取数次。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩，得到n1-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺(172mg,96％)为黄色固体。lcms(方法b):1.31min[mh]+＝253.1.
步骤2:1-(4-((2-氯-5-氟吡啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟-甲氧基)苯基脲
将n1-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺(172mg，0.68mmol)在二氯甲烷(3ml)中的溶液用1-异氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(138mg，0.68mmol)处理。将反应混合物在室温下搅拌4小时。通过过滤收集沉淀的固体，用二氯甲烷洗涤并减压干燥，得到1-(4-((2-氯-5-氟吡啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(255mg，82％)，为白色固体。lcms(方法b):3.11min[mh]+＝456.1
步骤3:3-((5-氟-4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺.
向烧瓶中加入1-(4-((2-氯-5-氟吡啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲(100mg,0.22mmol)、3-氨基苯磺酰胺(38mg，0.22mmol)、tsoh.h2o(85mg，0.44mmol)和dmf(1.5ml)。将所得混合物在60℃下搅拌16小时。将所得混合物在乙酸乙酯和碳酸钾溶液之间分配。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥。经制备型hplc纯化后，得到3-((5-氟-4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯磺酰胺(10mg,8％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,meod-d4):δppm3.64(s,3h),7.24(d,j＝8.8hz,2h),7.34(d,j＝8.4hz,2h),7.52(m,5h),7.64(m,1h),7.71(d,j＝7.6hz,1h),7.96(d,j＝6.8hz,1h),8.47(s,1h).lcms(方法b):2.83min[mh]+＝592.2,[mna]+＝614.1.
化合物6
步骤1:2-氯-n,5-二甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺
向n-甲基-4-硝基苯胺(3g,19.7mmol)在dmso(20ml)中的溶液中加入2,4-二氯-5-甲基嘧啶(6.4g,39.4mmol)和cs2co3(12.8g,39.4mmol)。将所得混合物在氮气下加热至100℃持续16小时。将有机层在水和etoa之间分配。将有机物分离，用硫酸钠干燥并减压浓缩，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(pe/etoac＝25/1)纯化，得到标题产物(1.0g，18％)，为黄色固体。lcms(acidic5min):3.03min[mh]+＝279.0
还分离2-加成产物4-氯-n,5-二甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-2-胺，为黄色固体。lcms(酸性5min):2.60min[mh]+＝279.0.
步骤2:n1-(2-氯-5-甲基嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺
向2-氯-n,5-二甲基-n-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(1g,3.6mmol)在meoh(10ml)中的溶液中加入锌(1.4g,22mmol)和nh4cl水溶液(10ml)。将反应混合物在氮气下在60℃搅拌16小时。然后将反应混合物减压浓缩，残余物用乙酸乙酯(10ml)稀释，并用h2o(10ml)洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到标题产物(600mg，67％)，为黄色固体。lcms(酸性5min):1.74min[mh]+＝249.1.
步骤3:1-(4-((2-氯-5-甲基嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲
向n1-(2-氯-5-甲基嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺(500mg,2mmol)在dcm(10ml)中的溶液中加入1-异氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(812mg,4mmol)。将所得混合物在氮气下在室温下搅拌16小时。通过过滤收集固体，用二乙醚洗涤并减压干燥，得到标题产物(500mg，55％)，为黄色固体。lcms(酸性5min):3.25min[mh]+＝452.1。
步骤4:n,2-二甲基-5-((5-甲基-4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺
向1-(4-((2-氯-5-甲基嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲(200mg,0.44mmol)在异丙醇(10ml)中的溶液中加入5-氨基-n,2-二甲基苯甲酰胺(73mg,0.44mmol)和hcl(2滴)。将所得混合物在氮气下加热至90℃持续16小时。通过过滤收集固体，用乙醚洗涤并干燥，得到所需产物(150mg，58％)，为黄色固体。
lcms(酸性5min):2.57min[mh]+＝580.3.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm1.39(s,3h),2.24(s,3h),2.73(d,j＝4.4hz,3h),3.37(s,3h),7.10-7.12(m,3h),7.14-7.27(m,2h),7.29(d,j＝8.8hz,2h),7.49(d,j＝8.8hz,2h),7.63(dd,j＝8.0,2.0hz,1h),7.79(s,1h),7.88(d,j＝1.6hz,1h),8.11(brs,1h),9.06(s,1h),9.14(s,1h),9.35(s,1h)。
化合物6a
步骤1:2-氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺
向烧瓶中加入n-甲基-4-硝基苯胺(175mg,1.15mmol)、2-氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(250mg,1.15mmol)、diea(31.8mg,2.3mmol)和干燥thf(10ml)。将所得混合物在90℃下搅拌20小时。除去溶剂，粗产物通过柱色谱(石油醚/乙酸乙酯，15:1)纯化，得到2-氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(300mg,78％)，为黄色固体。lcms(方法b):3.10min[mh]+＝333.0.
步骤2:n1-(2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺
向2-氯-n-甲基-n-(4-硝基苯基)-5-(三氟-甲基)嘧啶-4-胺(150mg,0.45mmol)在甲醇(6ml)中的混合物中，加入锌粉(294mg，4.5mmol)和饱和nh4cl溶液(3ml)。将所得混合物在60℃下搅拌3小时。滤出锌粉，滤液在乙酸乙酯和氢氧化钠溶液(1m)之间分配。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到n1-(2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺(128mg,94％)，为黄色固体。lcms(方法b):2.78min[mh]+＝303.1.
步骤3:1-(4-((2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲
向n1-(2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺(128mg,0.423mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中加入1-异氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(86mg,0.423mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。通过过滤收集形成的沉淀物，用二氯甲烷洗涤并干燥，得到1-(4-((2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲(150mg,70％)，为白色固体。lcms(方法b):3.51min[mh]+＝506.1.
步骤4:3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺.
向烧瓶中加入1-(4-((2-氯-5-三氟甲基吡啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲(70mg,0.138mmol)、3-氨基苯磺酰胺(24mg,0.138mmol)、tsoh.h2o(53mg,0.277mmol)和dmf(2ml)。将所得混合物在60℃下搅拌过夜。将所得混合物在乙酸乙酯和碳酸钾溶液之间分配。有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并通过制备型tlc纯化，得到3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)-5-(三氟-甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(42mg,49％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.38(s,3h),7.23(d,j＝8.8hz,2h),7.32(m,5h),7.49(m,3h),7.60(m,2h),7.76(d,j＝7.6hz,1h),8.09(s,1h),8.32(s,1h),8.83(d,j＝8.0hz,2h),8.93(s,1h).lcms(方法b):3.02min[mh]+＝642.2,[mna]+＝664.1.
化合物7
按照一般步骤c，利用中间体c(182mg，0.415mmol)和1-(5-氨基-2-甲基苯基)吡咯烷-2-酮(来自步骤3的中间体h，79mg，0.415mmol)，得到2-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(90mg,37％)，为白色固体。
1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.06(s,3h),2.14(m,2h),2.43(m,2h),3.40(s,3h),3.65(t,j＝6.8hz,2h),5.77(d,j＝6hz,1h),7.12(d,j＝8.4hz,1h),7.31(m,4h),7.59(m,5h),7.70(s,1h),7.86(d,j＝6hz,1h),8.89(s,1h),8.94(s,1h),9.15(s,1h).lcms(方法b):2.64min[mh]+＝592.3[mna]+＝614.2.
化合物8
1-(4-(甲基(2-((3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲.
按照一般步骤c，利用中间体c(100mg，0.23mmol)和1-(3-氨基苯基)吡咯烷-2-酮(40mg,0.23mmol)，得到1-(4-(甲基(2-((3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟-甲氧基)苯基脲(80mg,61％)为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.09(m,2h),2.48(t,j＝6.8hz,2h),3.42(s,3h),3.80(t,j＝7.2hz,2h),5.79(d,j＝6.0hz,1h),7.21(t,j＝8.4hz,1h),7.32(m,5h),7.59(m,5h),7.88(d,j＝6.0hz,1h),8.01(s,1h),8.87(s,1h),8.92(s,1h),9.16(s,1h).lcms(方法b):2.61min[mh]+＝578.2,[mna]+＝600.2.
化合物9
步骤1:n-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-5-硝基苯甲酰胺
向2-甲基-5-硝基苯甲酸(500mg,2.76mmol)在dmf(30ml)中的溶液中加入hatu(1.26g,3.31mmol)、tea(838mg,8.28mmol)和2-甲氧基乙胺(228mg,3.04mmol)。将溶液在n2下在室温下搅拌过夜。将混合物用乙酸乙酯(150ml)和水(70ml)稀释。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机相用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(dcm/meoh，150:1至100:1)纯化，得到n-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-5-硝基苯甲酰胺(560mg,85％)，为浅黄色固体。lcms(方法b):0.93min[mh]+＝239.1,[mna]+＝261.1,[2mna]+＝499.2.
步骤2:5-氨基-n-(2-甲氧基乙基)-2-甲基苯甲酰胺
向n-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-5-硝基苯甲酰胺(130mg,0.54mmol)在etoac(12ml)中的溶液中加入10％pd/c(30mg)。将反应混合物在氢气氛下在室温下搅拌过夜。过滤除去催化剂，减压除去溶剂，得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(dcm/meoh，50：1)纯化，得到5-氨基-n-(2-甲氧基乙基)-2-甲基苯甲酰胺(89mg,78％)为浅红色固体。lcms(方法b):0.29min[mh]+＝209.1,[2mna]+＝439.2.
步骤3:n-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺.
向中间体c(183mg,0.42mmol)、5-氨基-n-(2-甲氧基乙基)-2-甲基苯甲酰胺(87mg,0.42mmol)在异丙醇(5ml)的溶液中加入浓hcl(3滴)。将所得混合物在n2下在85℃下搅拌过夜。将混合物冷却至室温。加入饱和碳酸钠溶液以中和该混合物，然后加入水和乙酸乙酯。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取数次。合并的有机层用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩得到残余物，将其通过柱色谱(dcm/meoh，80:1至20:1)纯化，得到n-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(108mg,42％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.24(s,3h),3.27(s,3h),3.45(m,7h),5.76(d,j＝6hz,1h),7.08(d,j＝8.4hz,1h),7.31(m,4h),7.65(m,5h),7.86(d,j＝6hz,2h),8.18(t,j＝5.6hz,1h),8.89(s,1h),8.95(s,1h),9.18(s,1h).lcms(方法b):2.61min[mh]+＝610.3.
化合物10
3-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺
按照一般步骤b，利用中间体b(100mg,0.2mmol)和3-氟-5-(三氟甲基)苯胺(37mg,0.2mmol)，得到3-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(12mg,10％)，为白色固体。
1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.47(s,3h),5.86(d,j＝6.4hz,1h),7.32(m,5h),7.47(m,2h),7.66(m,3h),7.72(s,1h),7.80(m,1h),7.90(d,j＝6.4hz,1h),8.49(s,1h),9.29(m,1h),9.55(m,1h),9.85(m,1h).lcms(方法b):2.60min[mh]+＝576.2,[mna]+＝598.2.
化合物11
步骤1:5-(3-硝基苯基)-2h-四唑
向无水alcl3(0.27g,2.03mmol)在无水nmp(5ml)中的溶液中加入nan3(2.63g,40mmol)和3-硝基苯甲腈(2g,13.5mmol)。将混合物搅拌1分钟，随后在微波仪器中在200℃下照射5分钟。将反应混合物倒入冰水中。用浓hcl将溶液的ph调至1。通过过滤收集形成的固体，用冷的1nhcl充分洗涤，得到5-(3-硝基苯基)-2h-四唑(3.30g,100％)，为黄色固体。lcms(方法b):1.07min[mh]+＝192.1,[mna]+＝214.0.
步骤2:3-(2-甲基-2h-四唑-5-基)苯胺
在0℃向5-(3-硝基苯基)-1h-四唑(1.0g，5.23mmol)在thf(30ml)中的溶液中加入nah(251mg，10.5mmol)。将混合物搅拌15分钟，然后加入ch3i(817.5mg，5.76mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到残余物。粗产物通过硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯，10:1)纯化，得到3-(2-甲基-2h-四唑-5-基)苯胺(160mg,15％)，为黄色固体。lcms(方法b):2.20min[mh]+＝206.1,[mna]+＝228.0.
步骤3:3-(2-甲基-2h-四唑-5-基)苯胺
向3-(2-甲基-2h-四唑-5-基)苯胺(105mg，0.51mmol)在乙酸乙酯(2ml)中的溶液中加入pd/c(10％，20mg)。将混合物在氢气氛下在室温下搅拌过夜。过滤除去pd/c，浓缩滤液得到3-(2-甲基-2h-四唑-5-基)苯胺(73mg,81％)，为黄色油状物。lcms(方法b):0.40min[mh]+＝176.1.
步骤4:1-(4-(甲基(2-((3-(2-甲基-2h-四唑-5-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲.
向3-(2-甲基-2h-四唑-5-基)苯胺(50mg，0.29mmol)在异丙醇(5ml)中的溶液中加入中间体c(125mg，0.29mmol)和浓hcl(2滴)。将混合物在85℃下搅拌过夜，倒入1mnaoh溶液中。所得混合物用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到残余物。粗产物通过硅胶柱色谱(dcm/meoh，40:1)纯化，得到1-(4-(甲基(2-((3-(2-甲基-2h-四唑-5-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲(41.4mg,25％)，为黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.49(s,3h),4.42(s,3h),5.81(d,j＝6.0hz,1h),7.32(m,4h),7.41(t,j＝8.0hz,1h),7.60(m,5h),7.81(d,j＝8.4hz,1h),7.91(d,j＝5.6hz,1h),8.81(s,1h),8.88(s,1h),8.93(s,1h),9.44(s,1h).lcms(方法b):2.72min[mh]+＝577.2,[mna]+＝599.2.
化合物12
5-((5-氟-4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺.
向1-(4-((2-氯-5-氟嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲(来自(5)的制备步骤3，120mg，0.26mmol)在i-proh(5ml)中的溶液中加入5-氨基-n,2-二甲基苯甲酰胺(来自制备中间体d的步骤3，43mg，0.26mmol)和浓hcl(2滴)。将反应混合物在n2下在85℃下搅拌过夜。将混合物用乙酸乙酯(40ml)、naoh(1m，15ml)和水(15ml)稀释。水层再次用乙酸乙酯萃取。合并的有机相用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(dcm/meoh＝100:1至40:1)纯化，得到5-((5-氟-4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(75mg,49％)，为浅黄色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.23(s,3h),2.74(d,j＝4.8hz,3h),3.43(s,3h)7.09(dj＝8.8hz,1h),7.24(dj＝8.8hz,2h),7.31(d,j＝8.4hz,2h),7.49(d,j＝8.8hz,2h)7.61(m,3h),7.81(d,j＝2.4hz,1h),7.96(d,j＝5.6hz,1h).8.09(m,1h),8.81(s,1h),8.91(s,1h),9.27(s,1h).lcms(方法b):2.85min[mh]+＝584.3,[mna]+＝606.2.
化合物13
n,n,2-三甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺
将中间体e(200mg，0.41mmol)在thf(5ml)中的溶液用3-(三氟甲基)苯胺(64mg，0.41mmol)和diea(159mg，1.23mmol)处理。反应混合物加热至85℃过夜。除去溶剂，粗产物通过柱色谱(dcm/甲醇，100:0至100:2)纯化，得到n,n,2-三甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺(55.3mg,30％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.23(s,3h),2.74(d,j＝4.4hz,3h),3.41(s,3h),5.77(d,j＝6.0hz,1h),7.08(d,j＝8.4hz,1h),7.28(d,j＝8.8hz,2h),7.34(d,j＝7.6hz,1h),7.66(m,5h),7.87(m,2h),8.05(s,1h),8.15(m,1h),8.96(s,1h),9.12(s,1h),9.18(s,1h).lcms(方法b):2.48min[mh]+＝550.2.
化合物14
5-((4-((4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺.
向中间体d(200mg，0.55mmol)在thf(20ml)中的溶液中加入1-氯-2-(三氟甲基)-4-异氰酸基苯(128mg，0.58mmol)和diea(142mg，1.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，减压浓缩，粗品固体通过柱色谱(dcm/甲醇，100:0至100:2)纯化，得到5-((4-((4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(86mg,27％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.23(s,3h),2.74(d,j＝4.4hz,3h),3.41(s,3h),5.77(d,j＝6.0hz,1h),7.08(d,j＝8.4hz,1h),7.28(d,j＝8.8hz,2h),7.66(m,5h),7.87(m,2h),8.10(m,1h),8.15(d,j＝2.0hz,1h),9.01(s,1h),9.18(s,1h),9.23(s,1h).lcms(方法b):2.65min[mh]+＝584.2.
化合物15
5-(5-氟-4-((4-(3-(2-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺
向中间体g(200mg，0.40mmol)在thf(15ml)中的溶液中加入2-氟-5-(三氟甲基)苯胺(72mg，0.40mmol)和diea(155mg，1.20mmol)。将反应混合物加热至85℃过夜。除去溶剂，粗产物通过柱色谱(dcm：甲醇，100-0至100:3)纯化，得到白色固体，将其通过制备型hplc进一步纯化，得到5-(5-氟-4-((4-(3-(2-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(20mg,9％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.23(s,3h),2.74(d,j＝4.4hz,3h),3.44(s,3h),7.10(d,j＝8.4hz,1h),7.27(d,j＝8.8hz,2h),7.41(m,1h),7.48(m,3h),7.58(m,1h),7.80(d,j＝2.4hz,1h),7.98(d,j＝5.6hz,1h),8.11(m,1h),8.64(m,1h),8.93(d,j＝2.8hz,1h),9.27(s,1h),9.32(s,1h).lcms(方法b):2.88min[mh]+＝586.3.
化合物16
5-(4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)-嘧啶-2-基氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺
向中间体d(200mg，0.41mmol)在thf(15ml)中的溶液中加入3-氟-5-(三氟甲基)苯胺(74mg，0.41mmol)和diea(159mg，1.23mmol)。将反应混合物加热至85℃过夜。除去溶剂，粗产物通过柱色谱(dcm：甲醇，100-0至100:2)纯化，得到白色固体，将其通过制备型hplc进一步纯化，得到5-(4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺，为白色固体(12mg,5％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.30(s,3h),2.76(d,j＝4.4hz,3h),3.48(s,3h),5.97(brs,1h),7.26(m,2h),7.35(d,j＝8.8hz,2h),7.60(m,5h),7.76(s,1h),7.85(d,j＝6.8hz,1h),9.47(s,1h),9.70(s,1h),10.33(s,1h).lcms(方法b):2.62min[mh]+＝568.3.
化合物17
步骤1:2-氟-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺
向2-氟-5-硝基苯甲酸(1.0g，5.40mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中加入hatu(2.05g，5.40mmol)、甲胺盐酸盐(400mg，5.94mmol)和三乙胺(1.63g,16.2mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。混合物用二氯甲烷(20ml)稀释，用水和盐水洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩至干，得到2-氟-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺(1.0g,93％)，为黄色固体。lcms(方法b):2.07min[mh]+＝199.0.
步骤2:n-甲基-2-吗啉基-5-硝基苯甲酰胺
向2-氟-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺(1.0g，5.05mmol)在dmso(10ml)中的溶液中加入吗啉(530mg，6.06mmol)和碳酸铯(3.2g,10.1mmol)。将混合物在80℃下搅拌过夜。将反应混合物倒入水(30ml)中，所得混合物用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩至干，得到n-甲基-2-吗啉基-5-硝基苯甲酰胺(950mg,71％)，为黄色固体。lcms(方法b):1.76min[mh]+＝266.1.
步骤3:5-氨基-n-甲基-2-吗啉基苯甲酰胺
向n-甲基-2-吗啉基-5-硝基苯甲酰胺(950mg，3.58mmol)在甲醇(20ml)中的溶液中加入钯碳(10％，60mg)，并且将混合物在氢气氛下在室温下搅拌过夜。滤出pd/c，将滤液减压浓缩至干，得到残余物，将其通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，50:1)纯化，得到5-氨基-n-甲基-2-吗啉基苯甲酰胺(750mg,产率89％)，为浅绿色固体。lcms(方法b):1.23min[mh]+＝236.1.
步骤4:n-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-吗啉基苯甲酰胺
向5-氨基-n-甲基-2-吗啉基苯甲酰胺(54mg，0.23mmol)在异丙醇(8ml)中的溶液中加入中间体c(100mg，0.23mmol)和在二氧六环中的hcl(4m，2滴)。将所得混合物在85℃下搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干，得到残余物，将其通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇，30:1)纯化，得到n-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-吗啉基苯甲酰胺(120mg,83％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.84(brs,4h),2.85(s,3h),3.42(s,3h),3.75-3.69(m,4h),5.79(d,j＝5.9hz,1h),7.11(d,j＝8.8hz,1h),7.25(d,j＝8.8hz,2h),7.30(d,j＝8.8hz,2h),7.58(m,4h),7.78(dd,j＝8.8和2.7hz,1h),7.86(d,j＝6.0hz,1h),8.20(s,1h),8.87(s,1h),8.93(s,1h),9.17(s,1h),9.32(d,j＝4.6hz,1h).lcms(方法b):2.59min[mh]+＝637.3.
化合物18
步骤1:(2-甲基-5-硝基苯基)(吗啉基)甲酮
将2-甲基-5-硝基苯甲酸(1g，5.5mmol)溶于socl2(15ml)中，然后加入dmf(1滴)。将反应混合物回流4小时，然后减压除去溶剂。加入dcm(10ml)并浓缩以除去过量的socl2，然后溶于dcm(5ml)中并冷却至0℃，然后加入吗啉(529mg，6.08mmol)和tea(1.12g，11.16mmol)在dcm(30ml)中的混合物。将反应混合物在室温下搅拌过夜。lcms分析显示反应完成。将混合物用dcm稀释并用水(3×30ml)洗涤，干燥并浓缩，得到(2-甲基-5-硝基苯基)(吗啉基)甲酮，为黄色固体(1g,72％)。lcms(方法b):1.10min[mh]+＝251.1
步骤2:4-(2-甲基-5-硝基苄基)吗啉
向(2-甲基-5-硝基苯基)(吗啉基)甲酮(0.40g，1.63mmol)在thf(20ml)中的溶液中加入在thf中的bh3(1m，8.2ml，8.15mmol)。将混合物在n2下在60℃下搅拌过夜。加入h2o(50ml)，然后加入乙酸乙酯。分离有机层，干燥(na2so4)。将有机层浓缩得到残余物，将其通过硅胶柱色谱(dcm:meoh，250:1至200:1)纯化，得到4-(2-甲基-5-硝基苄基)吗啉，为黄色固体(360mg,68％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.41(m,4h),2.44(s,3h),3.55(s,2h),3.58(m,4h),7.46(d,j＝8.4hz,1h),8.03(dd,j＝8.0和2.4hz,1h),8.13(d,j＝2.4hz,1h).lcms(方法b):2.43min[mh]+＝237.1.
步骤3:4-甲基-3-(吗啉基甲基)苯胺
在室温下向4-(2-甲基-5-硝基苄基)吗啉(0.1g，0.42mmol)在乙酸乙酯(15ml)中的溶液中加入pd/c(10％，20mg)。然后将反应混合物在室温下在氢气氛下搅拌过夜。滤出pd/c并浓缩滤液，得到4-甲基-3-(吗啉基甲基)苯胺，为黄色固体(70mg,79％)。粗产物直接用于下一步骤。lcms(方法b):0.26min[mh]+＝207.1.
步骤4:1-(4-(甲基(2-((4-甲基-3-(吗啉基甲基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
向中间体c(149mg，0.34mmol)在异丙醇(5ml)中的溶液中加入4-甲基-3-(吗啉基甲基)苯胺(70mg，0.34mmol)和浓hcl(0.5ml)。将混合物在n2下在82℃下搅拌过夜。反应混合物用水(10ml)稀释，用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。合并有机层，干燥(na2so4)并减压浓缩。将粗品油状物通过硅胶柱色谱(dcm:meoh，30:1)纯化，得到1-(4-(甲基(2-((4-甲基-3-(吗啉基甲基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基脲，为白色固体(84mg,41％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.27(s,3h),2.51(m,4h),3.39(s,2h),3.42(s,3h),3.61(brs,4h),5.77(d,j＝6hz,1h),7.04(d,j＝8.4hz,1h),7.28(m,4h),7.50(d,j＝8.0hz,1h),7.58(m,4h),7.72(s,1h),7.83(d,j＝6.0hz,1h),9.10(m,3h).lcms(方法b):2.36min[mh]+＝608.3.
化合物19
1-(4-((2-(3-羟基苯基氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
按照一般步骤c，利用中间体c(120mg，0.274mmol)和3-氨基苯酚(30.5mg，0.28mmol)，得到1-(4-((2-(3-羟基苯基氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟-甲氧基)苯基)脲(8.6mg,6％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.43(s,3h),5.79(d,j＝6.0hz,1h),6.38(dd,j＝8.0hz和2.0hz,1h),7.02(t,j＝8.0hz,1h),7.14(d,j＝8.0hz,1h),7.28(m,5h),7.59(d,j＝8.80hz,4h),7.84(d,j＝6.0hz,1h),9.16(s,1h),9.20(s,1h),9.28(s,2h).lcms(方法b):2.54min[m+h]+＝511.2
化合物20
1-(4-((2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
按照一般步骤c，利用中间体c(120mg,0.274mmol)和3-甲氧基苯胺(38mg,0.28mmol)，得到1-(4-((2-(3-甲氧基苯基氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(66mg,46％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.43(s,3h),3.72(s,3h),5.78(d,j＝6.0hz,1h),6.48(dd,j＝8.0hz和1.6hz,1h),7.12(t,j＝8.0hz,1h),7.32(m,5h),7.59(m,5h),7.87(d,j＝6.0hz,1h),8.83(s,1h),8.93(s,1h),9.13(s,1h).lcms(方法b):2.72min[m+h]+＝525.2
化合物21
按照一般步骤c，利用中间体c(120mg,0.274mmol)和3-氨基苯甲腈(33mg,0.28mmol)，得到1-(4-((2-(3-氰基苯基氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(79mg,56％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.42(s,3h),5.89(d,j＝6.0hz,1h),7.32(m,5h),7.42(t,j＝8.0hz,1h),7.59(m,4h),7.94(d,j＝6.0hz,1h),7.98(d,j＝8.40hz,1h),8.28(s,1h),8.87(s,1h),8.94(s,1h),9.56(s,1h).lcms(方法b):2.68min[m+h]+＝520.2.
化合物22
按照一般步骤c，利用中间体c(120mg,0.274mmol)和苯-1,3-二胺(58mg,0.274mmol)，得到1-(4-((2-(3-氨基苯基氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(33mg,21％)，为棕色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm3.41(s,3h),4.83(s,2h),5.74(d,j＝6.0hz,1h),6.15(d,j＝7.6hz,1h),6.88(m,2h),7.05(s,1h),7.32(m,4h),7.59(m,4h),7.84(d,j＝6.0hz,1h),8.80(s,1h),8.88(s,1h),8.93(s,1h).lcms(方法b):2.50min[m+h]+＝510.2.
化合物23
步骤1:(2-甲基-5-硝基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮
向1-甲基哌嗪(608mg，6.07mmol)和tea(1.12g，11mmol)在dcm(15ml)中的溶液中加入2-甲基-5-硝基苯甲酰氯(1.1g，5.52mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时，然后用水稀释。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩，得到(2-甲基-5-硝基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(1g,69％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.30min[mh]+＝264.1.
步骤2:1-甲基-4-(2-甲基-5-硝基苄基)哌嗪
在0℃向(2-甲基-5-硝基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(544mg，2.07mmol)在thf(10ml)中的溶液中加入bh3.thf复合物(1m，10.33ml，10.33mmol)。将混合物在氮气氛下在60℃下搅拌过夜，冷却至室温，并在0℃小心加入甲醇(10ml)。将反应混合物在室温下搅拌4小时，减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯，4:1)纯化，得到1-甲基-4-(2-甲基-5-硝基苄基)哌嗪(329mg,64％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.67min[mh]+＝250.1.
步骤3:4-甲基-3-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯胺
向1-(2-甲基-5-硝基苄基)-4-甲基哌嗪(329mg，1.32mmol)在乙酸乙酯(10ml)中的溶液中加入pd/c(40mg)。将混合物在氢气氛下在室温下搅拌16小时。通过过滤除去pd/c，将滤液减压浓缩，并通过硅胶柱色谱(洗脱液：dcm/meoh＝80：1至20：1)纯化，得到4-甲基-3-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯胺(143mg,49.4％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.26min[mh]+＝220.2.
步骤4:1-(4-(甲基(2-((4-甲基-3-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
向4-甲基-3-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯胺(133mg，0.61mmol)在异丙醇(5ml)中的溶液中加入中间体c(265.5mg，0.61mmol)和浓hcl(3滴)。将混合物在85℃下搅拌过夜。将反应混合物倒入1mnaoh中，用乙酸乙酯萃取。有机相用水、盐水洗涤，干燥并浓缩。粗化合物通过硅胶柱色谱(dcm/meoh，40:1至10:1)纯化，得到1-(4-(甲基(2-((4-甲基-3-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(21.6mg,5.7％)，为白色固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.35(m,5h),2.79(s,3h),2.96(m,4h),3.51(m,5h),3.84(m,2h),5.94(m,1h),7.60(m,12h),9.46(s,2h),10.61(m,1h).lcms(方法b):2.35min[mh]+＝621.3.
化合物24
将中间体h(150mg,0.285mmol),3-氟-5-(三氟甲基)苯胺(51mg,0.285mmol)和dmap(21mg,0.171mmol)溶解于thf(15ml)，将反应混合物加热至85℃，16小时。减压除去溶剂，粗产物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂dcm/甲醇100:0至98:2)得到1-(4-((5-氟-2-((4-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲(29mg,17％)，为白色固体。lcms(方法b):3.11min[mh]+＝612.3.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.06(s,3h)2.11(m,2h)2.42(t,j＝8.0hz2h)3.43(s,3h)3.63(t,j＝7.2hz2h)7.13(d,j＝8.8hz1h)7.25(m,3h)7.50(m,3h)7.65(m,2h)7.70(s,1h)7.96(d,j＝5.6hz1h)9.16(s,1h)9.29(s,1h)9.50(s,1h).
化合物25
步骤1:(5-氨基-2-甲基苯基)(吗啉基)甲酮
在n2气氛下向(2-甲基-5-硝基苯基)(吗啉基)甲酮((18)的步骤1)(1.4g，5.52mmol)在甲醇(40ml)中的溶液中加入pd/c(10％,0.14g)。将混合物在h2气氛下在室温下搅拌过夜。tlc和lcms分析显示反应已完成。将反应混合物过滤，减压浓缩，得到(5-氨基-2-甲基苯基)(吗啉基)甲酮(1.2g,100％)，为黑色固体。lcms(方法b):0.31min[mh]+＝221.1
步骤2:1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲
向3-氟-5-(三氟甲基)苯胺(458mg，2,56mmol)在dcm(20ml)中的溶液中滴加三乙胺(0.78ml，5.63mmol)和三光气(249mg，0.84mmol)在dcm(4ml)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌20分钟，然后加入n1-(2-氯嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺(来自中间体c的合成步骤1，600mg，2.56mmol)在dcm(30ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌16小时，减压浓缩。残余物通过柱色谱(洗脱液pe/etoac＝80:20)纯化，得到1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲(305mg,27.2％)，为黄色固体。lcms(方法b):3.18min[mh]+＝440.1.
步骤3:1-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(甲基(2-((4-甲基-3-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)脲
向(5-氨基-2-甲基苯基)(吗啉基)甲酮(57mg，0.23mmol)在异丙醇(15ml)中的溶液中加入1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲(100mg，0.23mmol)和hcl(0.1ml)。将反应混合物在室温下搅拌16小时并减压浓缩。所得混合物通过柱色谱(洗脱液：dcm/meoh：99-1至96-4)纯化，得到1-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(甲基(2-((4-甲基-3-(吗啉-4-羰基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-脲(69mg,48.6％)，为黄色固体。lcms(方法b):2.70min[mh]+＝624.3.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.13(s,3h)3.16(brs,2h),3.39(s,3h)3.50(brs,2h)3.63(brs,4h)5.77(d,j＝6.0hz,1h)7.11(d,j＝8.4hz,1h)7.20–7.32(m,3h)7.57(d,j＝8.8hz,2h)7.63(m,3h)7.73(s,1h)7.87(d,j＝6.0hz,1h)9.07(s,1h)9.18(s,1h)9.32(s,1h).
化合物26
3-((4-((4-(3-(3-氯-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺
将中间体b(200mg，0.41mmol)、3-氯-5-(三氟甲基)苯胺(80mg，0.41mmol)和diea(106mg，2mmol)溶于thf(20ml)中。将反应混合物加热至85℃持续18小时。减压除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(洗脱液dcm：甲醇100:0至98:2)纯化，然后通过制备型hplc纯化得到标题化合物(14mg,5.8％)，为白色固体。
lcms(方法b):2.66min[mh]+＝592.2.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm3.45(s,3h)5.81(d,j＝6.4hz,1h)7.30(m,4h)7.43(m,3h)7.61(d,j＝8.8,2h)7.90(m,4h)8.55(s,1h)9.18(s,1h)9.39(s,1h)9.57(s,1h).
化合物27
5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-甲基-2-吗啉基苯甲酰胺
向1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲(100mg,0.22mmol)在i-proh(15ml)中的溶液中加入5-氨基-n-甲基-2-吗啉基苯甲酰胺(来自化合物17步骤3，59mg，0.26mmol)和浓hcl(2滴)。将反应混合物在氮气下在85℃下搅拌过夜。减压除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(dcm:meoh，100:1至40:1)纯化，得到黄色固体，将其通过制备型hplc进一步纯化，得到标题化合物，为tfa盐(31mg，21％)，白色固体。
lcms(方法b):2.69min[mh]+＝639.3.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.85(dj＝4.8hz,3h)2.87(brs2h)2.49(brs2h)3.50(s,3h)3.71(brs4h)6.03(brs,1h)7.27(m,2h)7.38(m2h)7.64(m7h)9.13(s,1h)9.60(m3h)10.35(s1h).
化合物28
步骤1:n-(2-甲基-5-硝基苯基)乙酰胺
向2-甲基-5-硝基苯胺(5.0g，0.033mol)在dcm(80ml)中的溶液中加入三乙胺(6.7g，0.066mol)和乙酰氯(2.9g，0.036mol)。将混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物用dcm(100ml)稀释，有机物用水(200ml)洗涤，干燥(na2so4)，减压浓缩，并通过硅胶柱色谱(dcm：meoh＝160:1)纯化，得到n-(2-甲基-5-硝基苯基)乙酰胺(2.2g,34％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.85min[mh]+＝195.1.
步骤2:n-(5-氨基-2-甲基苯基)乙酰胺
向n-(2-甲基-5-硝基苯基)乙酰胺(1.0g，5.15mmol)在meoh(30ml)中的溶液中加入锌粉(3.3g，51.5mmol)和nh4cl(20ml)饱和水溶液。混合物在60℃下搅拌4小时。将反应混合物过滤以除去残留的锌粉末，滤液用水(100ml)稀释，用乙酸乙酯(200ml)萃取，干燥(na2so4)，减压浓缩，并通过硅胶柱色谱(dcm:meoh＝80:1)纯化，得到n-(5-氨基-2-甲基苯基)乙酰胺(390mg,46％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.21min[mh]+＝165.1.
步骤3:n-(2-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰胺
向1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(200mg，0.46mmol)在异丙醇(40ml)中的溶液中加入n-(5-氨基-2-甲基苯基)乙酰胺(75mg，0.46mmol)和浓hcl(0.1ml)。将混合物在80℃下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯(60ml)稀释，用水(50ml)洗涤，干燥(na2so4)，减压浓缩，并通过硅胶柱色谱(dcm:meoh＝40:1)纯化，得到n-(2-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰胺(180mg,69％)，为白色固体。
lcms(方法b):2.69min[mh]+＝566.2.1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.03(s,3h),2.10(s,3h),3.39(s,3h),5.72(d,j＝6.0hz，1h),7.02(d,j＝8.4hz,1h),7.03-7.31(m,4h),7.46-7.48(m,1h),7.54-7.59(m,4h),7.78(s,1h),7.83(d,j＝5.6hz,1h),8.88(s,1h),8.94(s,1h),9.07(s,1h),9.25(s,1h).
化合物29
5-((4-((4-(3-(3-氯-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺
将中间体e(120mg，0.25mmol)、3-氯-5-(三氟甲基)苯胺(49mg，0.27mmol)和dmap(16mg，0.125mmol)溶于thf(15ml)中。将反应混合物加热至85℃持续16小时。除去溶剂，粗产物通过柱色谱(dcm：甲醇100/0至98/2)纯化，得到5-((4-((4-(3-(3-氯-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺(38mg,26％)，为白色固体。
lcms(方法b):2.74min[mh]+＝584.1.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.23(s,3h)2.74(d,j＝4.8hz,3h)3.41(s,3h)5.77(d,j＝7.0hz,1h)7.07(d,j＝8.4hz,1h)7.28(d,j＝8.8hz,2h)7.43(s,1h)7.59(d,j＝8.8hz,2h)7.67(dd,j＝8.42.0hz,1h)7.87(m,4h)8.11(m,1h)9.15(s,1h)9.19(s,1h)9.37(s,1h).
化合物30
步骤1:2-羟基-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺
向2-羟基-5-硝基苯甲酸(700mg，3.76mmol)在dcm(40ml)中的溶液中加入三乙胺(2.1ml，15.04mmol)和hatu(1.56g，4.13mmol)。将所得混合物在室温下搅拌20分钟，然后加入menh2.hcl(304mg，4.52mmol)。将所得混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物减压浓缩，并通过柱色谱(pe/etoac＝5/1至4/1)，得到标题化合物(130mg，17.3％)，为黄色固体。lcms(方法b):1.59min[mh]+＝197.1
步骤2:2-甲氧基-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺
向2-羟基-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺(130mg，0.66mmol)在dmf(8ml)中的溶液中加入k2co3(230mg，1.66mmol)，然后加入甲基碘(0.1ml,1.66mmol)。将所得混合物在40℃下搅拌16小时。加入水(10ml)，有机相用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到2-甲氧基-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺(113mg,81％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.73min[mh]+＝211.1
步骤3:5-氨基-2-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺
向2-甲氧基-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺(113mg，0.53mmol)在甲醇(10ml)中的溶液中加入锌(344mg，52.90mmol)和饱和氯化铵水溶液(5ml)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，将所得混合物过滤，减压浓缩滤液。将粗品油状物在饱和碳酸钠水溶液(5ml)和乙酸乙酯(5ml)之间分配。有机物用etoac(2×25ml)萃取，合并的有机物用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到5-氨基-2-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺(97mg,100％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.72min[mh]+＝181.1.
步骤4:5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺
向1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲(步骤2化合物25，80mg，0.18mmol)在异丙醇(15ml)中的溶液中加入5-氨基-2-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺(32mg，0.18mmol)和hcl(0.1ml)。将混合物在85℃下搅拌16小时。然后加入5-氨基-2-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺(16mg,0.09mmol)，将混合物在85℃下搅拌24小时。将混合物减压浓缩，残余物通过制备型tlc(dcm:meoh＝10:1)纯化，得到5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-甲氧基-n-甲基苯甲酰胺(41mg,40％)，为黄色固体。
lcms(方法b):2.63min[mh]+＝584.31hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.78(d,j＝4.4hz,3h),3.41(s,3h),3.82(s,3h),5.75(d,j＝5.6hz,1h),6.99(d,j＝8.8hz,1h),7.28–7.20(m,3h),7.57(d,j＝8.4hz,2h),7.70–7.62(m,2h),7.85–7.77(m,2h),8.19–8.09(m,2h),9.10(s,1h),9.52(s,1h),9.94(s,1h).
化合物31
步骤1:2-氟-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺
向2-氟-5-硝基苯甲酸(3g，16.2mmol)在dcm(100ml)中的溶液中加入tea(8.9ml，64.8mmol)和hatu(6.8g，17.8mmol)。将所得混合物在室温下搅拌20分钟，然后加入menh2.hcl(1.3g，19.4mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用h2o(3×30ml)、盐水(30ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到标题化合物(3.2g，被一些溶剂污染)，为黄色固体。lcms(方法b):0.55min[mh]+＝199.0
步骤2:n-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯甲酰胺
向2-氟-n-甲基-5-硝基苯甲酰胺在dmso(20ml)中的溶液中加入cs2co3(3.3g，10.10mmol)和1-甲基哌嗪(0.73ml，6.57mmol)。将所得混合物在85℃下搅拌过夜。将反应混合物过滤，滤液倒入水(30ml)中，所得混合物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。将有机层用盐水(30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品n-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯甲酰胺(1.4g,50％)，为黄色固体，直接用于下一步骤。
步骤3:5-氨基-n-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺
向得自步骤2的粗产物(1.4g，5.05mmol)在甲醇(100ml)中的溶液中加入zn(3.4g，52.90mmol)和饱和nh4cl水溶液(25ml)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。tlc和lcms分析显示反应已完成。将所得混合物过滤，浓缩得到残余物。向粗产物中加入饱和的na2co3水溶液(20ml)，所得混合物用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤。将滤液浓缩并通过柱色谱(dcm:meoh＝40:1至20:1)纯化，得到5-氨基-n-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(260mg,20.8％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.28min[mh]+＝249.2.
步骤4:5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺
向(5-氨基-2-甲基苯基)(吗啉基)甲酮(57mg，0.23mmol)在异丙醇(15ml)中的溶液中加入5-氨基-n-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(100mg，0.23mmol)和hcl(0.1ml)。tlc和lcms分析显示反应已完成。所得混合物通过柱色谱(dcm：meoh＝60:1-40:1)，得到标题化合物(100mg，61.6％)，为黄色固体。
lcms(方法b):2.34min[mh]+＝652.31hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.19(s,3h)2.43(brs,4h)2.82(brs,4h)2.83(s,3h)3.41(s,3h)5.80(d,j＝6.0hz,1h)7.09(d,j＝8.8hz,1h)7.27(m,3h)7.58(d,j＝8.8hz,2h)7.66(d,j＝11.2hz,1h)7.75(m,2h)7.86(d,j＝6.0hz,1h)8.20(s,1h)9.07(s,1h)9.17(s,1h)9.32(s,1h)9.52(d,j＝4.4hz,1h).
化合物32
步骤1:2-羟基-5-硝基苯甲酸甲酯
向2-羟基-5-硝基苯甲酸(2g，10.9mmol)在甲醇(40ml)中的溶液中加入硫酸(0.193ml)。将所得混合物在65℃下搅拌96小时。加入更多的硫酸(0.193ml)，将混合物在80℃下搅拌40小时。冷却至室温，将反应混合物减压浓缩，加入二氯甲烷(30ml)。将有机层用饱和nahco3水溶液(3×10ml)、盐水(10ml)洗涤，用无水na2so4干燥并减压浓缩，得到标题化合物(1.61g,75％)，为白色固体。lcms(方法b):2.33min[mh]+＝197.9
步骤2:5-硝基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酸甲酯
向2-羟基-5-硝基苯甲酸甲酯(700mg，3.55mmol)在dmf(3ml)中的溶液中加入1-(2-氯乙基)吡咯烷(522mg，3.91mmol)、k2co3(981mg，7.10mmol)和ki(589mg，3.55mmol)。将所得混合物在120℃下搅拌16小时。将反应混合物在水和dcm(1/1,20ml)之间分配，有机物用二氯甲烷(3×10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水na2so4干燥并减压浓缩。残余物通过柱色谱(dcm:meoh＝30:1至20:1)纯化，得到5-硝基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酸甲酯(180mg,17％)，为棕色固体。lcms(方法b):0.47min[mh]+＝295.1.
步骤3:5-硝基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酸
向5-硝基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酸甲酯(180mg，0.61mmol)在甲醇(10ml)中的溶液中加入氢氧化钠(98mg，2.44mmol)和水(10ml)。将混合物在室温下搅拌1小时，然后用1mhcl水溶液酸化至ph＝3。将所得混合物减压浓缩，过滤，得到5-硝基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酸(171mg,100％)，为棕色固体。lcms(方法b):0.34min[mh]+＝281.1
步骤4:n-甲基-5-硝基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酰胺
向5-硝基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酸(171mg，0.61mmol)在二氯甲烷(15ml)中的溶液中加入三乙胺(0.34ml，2.44mmol)和hatu(277mg，0.73mmol)。将所得混合物在室温下搅拌30分钟，然后加入menh2.hcl(49mg，0.73mmol)。将混合物在室温下搅拌16小时。加入dmf(6ml)，并将混合物在室温下搅拌24小时。将反应混合物用水(3×10ml)、1mhcl(3ml)、盐水(10ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，得到n-甲基-5-硝基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酰胺(220mg，含有一些溶剂)，为黄色固体。lcms(方法b):0.30min[mh]+＝294.1
步骤5:5-氨基-n-甲基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酰胺
向n-甲基-5-硝基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酰胺(220mg，0.75mmol)在甲醇/thf(20ml/6ml)中的溶液中加入pd/c(22mg)。将所得混合物在室温下在h2下搅拌16小时。将反应混合物过滤并减压浓缩，得到5-氨基-n-甲基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酰胺(200mg，含有一些溶剂)，为黄色油状物。lcms(方法b):0.25min[mh]+＝264.1
步骤6:5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-甲基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酰胺
向5-氨基-n-甲基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酰胺(50mg，0.19mmol)在异丙醇(6ml)中的溶液中加入1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲(84mg，0.19mmol)和hcl(0.1ml)。将混合物在85℃下搅拌16小时。将反应混合物冷却至室温，过滤并通过制备型tlc纯化，得到5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-甲基-2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯甲酰胺(20mg,16％)，为白色固体。
lcms(方法b):2.34min[mh]+＝667.3.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm1.89(brs,2h),2.04(brs,2h),2.79(d,j＝4.4hz,3h),3.10(brs,2h),3.47(s,3h),3.62(brs,4h),4.39(brs,2h),5.92(brs,1h),7.21(m,2h),7.33(d,j＝8.4hz,2h),7.64(m,3h),7.74(s,1h),7.89(m,2h),8.20(m,1h),9.64(s,1h),9.86(s,1h),10.02(brs,1h),10.40(brs,1h).
化合物33
5-((4-((4-(3-(3-氰基苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺
将中间体e(120mg，0.25mmol)、3-氨基苯甲腈(31mg，0.27mmol)和dmap(16mg，0.125mmol)溶于thf(15ml)中。将反应混合物加热至85℃过夜。除去溶剂，粗产物通过柱色谱(用洗脱液(dcm：甲醇100-100：2，v/v))纯化，得到标题化合物(20mg,16％)，为白色固体。
lcms(方法b):2.29min[mh]+＝507.2.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.22(s,3h)2.73(d,j＝4.4hz,3h)3.40(s,3h)5.76(d,j＝6.0hz,1h)7.07(d,j＝8.4hz,1h)7.28(d,j＝8.8hz,2h)7.44(d,j＝7.6hz,1h)7.53(t,j＝7.6hz,1h)7.58(d,j＝8.8hz,2h)7.70(m,2h)7.87(m,2h)8.00(s,1h)8.08(m,1h)9.03(s,1h)9.13(s,1h)9.17(s,1h).
化合物34
步骤1:1-(2-氯乙基)-3-(2-甲基-5-硝基苯基)脲
向2-甲基-5-硝基苯胺(2g，13.1mmol)在thf(50ml)中的溶液中滴加1-氯-2-异氰酸基乙烷(2.08g，19.7mmol)。将混合物在70℃下搅拌16小时。将反应混合物过滤，固体用水洗涤，得到所需产物(1.24g,37％)，为黄色固体。lcms(方法b):2.23min[mh]+＝258.1,min[mna]+＝280.1.
步骤2:1-(2-甲基-5-硝基苯基)咪唑烷-2-酮
在0℃向1-(2-氯乙基)-3-(2-甲基-5-硝基苯基)脲(300mg，1.16mmol)在thf(20ml)中的溶液中加入氢氧化钠(93mg，2.33mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，干燥并减压浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱(dcm:meoh＝80:1)纯化，得到标题化合物(183mg，53％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.27min[mh]+＝222.2,min[mna]+＝244.2.
步骤3:1-(5-氨基-2-甲基苯基)咪唑烷-2-酮
向1-(2-甲基-5-硝基苯基)咪唑烷-2-酮(120mg，0.54mmol)在甲醇(5ml)和氯化铵溶液(5ml)中的溶液中加入锌(350mg,5.4mmol)。将混合物在60℃下搅拌2小时，加入水。有机物用乙酸乙酯(2×10ml)萃取。有机相用盐水洗涤，干燥(na2so4)并减压浓缩，得到标题化合物(44mg，42％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.27min[mh]+＝192.2.
步骤4:1-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(甲基(2-((4-甲基-3-(2-氧代咪唑烷-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)脲
向1-(5-氨基-2-甲基苯基)咪唑烷-2-酮(44mg，0.23mmol)和1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲(101.2mg，0.23mmol)在异丙醇(10ml)中的溶液中加入浓hcl(1滴)。将混合物在85℃下搅拌16小时。将反应混合物减压浓缩，粗产物通过硅胶柱色谱(dcm:meoh:氨＝40:1:0.1)纯化，得到40mg黄色固体。用二乙醚进一步洗涤固体，得到标题化合物(9mg，7％)，为黄色固体。
lcms(方法b):1.99min[mh]+＝595.2.1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm2.13(s,3h),3.40(m,5h),3.67(t,j＝4.0hz,2h),5.76(d,j＝6.0hz,1h),6.56(s,1h),7.08(d,j＝8.8hz,1h),7.26(m,4h),7.5(m,1h),7.57(m,2h),7.65(m,1h),7.69(s,1h),7.86(d,j＝5.6hz,1h),9.07(s,1h),9.09(s,1h),9.30(s,1h).
化合物35
步骤1:2-(溴甲基)-5-硝基苯甲酸甲酯
向2-甲基-5-硝基苯甲酸甲酯(6.4g，32.76mmol)在ccl4(80ml)中的溶液中加入nbs(6.4g，36.1mmol)和bpo(794mg，3.28mol)。将所得混合物在83℃下搅拌5小时。将反应混合物减压浓缩，残余物用etoac(150ml)稀释，用h2o(120ml×3)洗涤。将有机相干燥并浓缩，得到2-(溴甲基)-5-硝基苯甲酸甲酯(8.5g，95.5％)，为棕色油状物，其直接用于下一步骤而不进一步纯化。lcms(方法b):2.59min[m+na]+＝295.9,297.9
步骤2:2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-5-硝基苯甲酸甲酯
向2-(溴甲基)-5-硝基苯甲酸甲酯(1.39g，5.07mmol)在ch3cn(30ml)中的溶液中加入1-甲基哌嗪(660mg，6.59mmol)和k2co3(1.4g，10.14mmol)。将所得混合物在n2下在85℃下搅拌5小时。冷却至室温后，将混合物用h2o和etoac稀释，并通过加入1mhcl将水层调至ph6。混合物用etoac(3×)萃取，合并的有机层用盐水洗涤，用na2so4干燥，减压浓缩。残余物通过柱色谱(ch2cl2/meoh＝100/0至90/10)纯化，得到2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-5-硝基苯甲酸甲酯(830mg,56％)，为棕色油状物。lcms(方法b):0.52min[mh]+＝294.1
步骤3:5-氨基-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酸甲酯
向2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-5-硝基苯甲酸(417mg，1.42mmol)在meoh(9ml)中的溶液中加入锌(560mg，8.53mmol)和nh4cl(饱和水溶液，3ml)。将所得混合物在n2下在60℃下搅拌3小时。冷却至室温后，过滤混合物，滤液用h2o和ch2cl2稀释，然后用ch2cl2萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用na2so4干燥，浓缩得到5-氨基-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酸甲酯(260mg,69％)，为黄色油状物，直接用于下一步骤而不进一步纯化。lcms(方法b):0.86min[mh]+＝264.2.mr-574-100.
步骤4:5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-苯甲酸甲酯
将5-氨基-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酸(30mg,0.11mmol)和1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟-甲基)苯基)脲(50mg,0.11mmol)悬浮在t-buoh(5ml)中，并加入浓hcl(3滴)。将所得混合物在55℃下在n2下搅拌过夜。冷却后，将混合物浓缩，得到残余物，将其通过制备型tlc(ch2cl2/meoh＝15/1,v/v)纯化，得到标题化合物(35mg,47％)，为灰白色固体。lcms(方法b):2.46min[mh]+＝667.3
步骤5:5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n-甲基-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺
在密封管中将5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯甲酸(35mg,0.05mmol)溶于在etoh(3ml)中的ch3nh2中。将所得混合物在35℃下搅拌28小时。将反应混合物减压浓缩，残余物通过制备型tlc(ch2cl2/meoh＝13/1,v/v)纯化，得到标题化合物(12mg，34％)，为白色固体。
lcms(方法b):2.32min[mh]+＝666.3.1hnmr(400mhz,dmso)δ11.47(s,1h),11.02(s,1h),9.50(d,j＝4.6hz,1h),9.26(s,1h),8.04(s,1h),7.85(d,j＝6.0hz,1h),7.82–7.68(m,3h),7.64(d,j＝8.7hz,2h),7.22(d,j＝8.8hz,2h),7.13(t,j＝9.2hz,2h),5.78(d,j＝5.9hz,1h),3.41(m,5h),2.78(d,j＝4.5hz,3h),2.35(m,8h),2.13(s,3h).
化合物36
步骤1:2-甲基-5-硝基苯甲酸2-羟基乙酯
向2-甲基-5-硝基苯甲酸(1g，5.52mmol)在dcm(20ml)中的溶液中加入三乙胺(1.69ml，12.14mmol)和hatu(2.31g，6.07mmol)。将所得混合物在室温下搅拌30分钟，然后加入乙二醇(343mg，5.52mmol)。将所得混合物在室温下搅拌16小时。反应混合物用水(3×10ml)洗涤，水相用dcm(3×10ml)反萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过柱色谱(pe:etoac＝7:1至6:1)纯化，得到粗产物(500mg，40％)，为黄色油状物。lcms(方法b):2.05min[mna]+＝248.0.
步骤2:5-氨基-2-甲基苯甲酸2-羟基乙酯
向2-甲基-5-硝基苯甲酸2-羟基乙酯(500mg，2.22mmol)在甲醇(15ml)中的溶液中加入锌(1.43g，22.2mmol)和饱和氯化铵水溶液(12ml)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。过滤所得混合物，减压浓缩滤液。将反应混合物在饱和na2co3水溶液(12ml)和二氯甲烷之间分配，水层用dcm(3×10ml)萃取。合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到粗制标题产物(438mg，100％)，为黄色油状物。lcms(方法b):0.37min[mh]+＝196.1.
步骤3:5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-甲基苯甲酸2-羟基乙酯
向5-氨基-2-甲基苯甲酸2-羟基乙酯(45mg，0.23mmol)在异丙醇(10ml)中的溶液中加入1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲(100mg，0.23mmol)和浓hcl(0.1ml)。将所得混合物在85℃下搅拌16小时。将混合物减压浓缩并通过柱色谱(dcm:meoh:nh3.h2o＝20:1:0.2)纯化，得到5-((4-((4-(3-(3-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-甲基苯甲酸2-羟基乙酯(80mg,58％)，为黄色固体。
lcms(方法b):3.37min[mh]+＝599.3.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.45(s,3h)3.45(s,3h)3.69(brs,2h)4.26(t,j＝5.2hz2h)4.86(brs,1h)5.79(d,j＝6hz,1h)7.18(d,j＝8.4hz1h)7.24(d,j＝8.4hz1h)7.29(d,j＝8.4hz,2h)7.61(m,3h)7.71(m,2h),7.86(d,j＝6.0hz,1h)8.44(s,1h)9.16(s,1h)9.38(s,1h)9.42(s,1h).
化合物37
5-((4-((4-(3-(3,5-双(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺
在0℃下向双(三氯甲基)碳酸酯(27mg，0.09mmol)在无水二氯甲烷(3ml)中的溶液中滴加在无水dcm(2ml)中的2-氯-5-(三氟甲基)苯胺(64mg，0.28mmol)和tea(0.087ml，0.62mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌1小时。然后在0℃下滴加中间体d(100mg，0.28mmol)在dmf(4ml)中的溶液。将所得混合物在0℃下搅拌16小时。将反应混合物用h2o稀释。水相用dcm(3×2ml)萃取。将合并的有机层用盐水(2ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过制备型tlc(dcm:meoh＝10:1)纯化，得到粗产物(30mg)，将其通过制备型hplc纯化，得到所需产物，为tfa盐(17mg，10％)，为白色固体。
lcms(方法b):2.83min[mh]+＝618.2.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δppm2.22(s,3h)2.72(d,j＝4.4hz3h)3.40(s,3h)5.76(d,j＝5.6hz1h)7.05(d,j＝8.4hz1h)7.26(d,j＝8.8hz2h)7.59(d,j＝8.8hz2h)7.65(m,2h)7.81(brs,1h)7.85(d,j＝6.0hz1h)8.06(m,1h)8.16(brs,2h)9.15(brs,1h)9.57(s,1h)10.00(brs,1h).
化合物38
步骤1:3-(2,2,2-三氟乙基)苯胺
将(3-氨基苯基)硼酸(200.0mg，1.5mmol)、cs2co3(1.9g，6.9mmol)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(xantphos)(143.0mg，0.24mmol)、pd2(dba)3(66.0mg，0.073mmol)在二氧六环(10ml)中的混合物在n2下搅拌10分钟。然后加入1,1,1-三氟-2-碘乙烷(6.1g，4.9mmol)和水(2ml)的溶液。将混合物在80℃下搅拌10h。冷却至室温，过滤反应混合物，减压浓缩滤液。将残余物在水(5ml)和乙酸乙酯(10ml)之间分配，分离有机层，用na2so4干燥并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(洗脱液：石油醚：乙酸乙酯＝10:1)纯化，得到所需产物(160.0mg，63％)，为黄色固体。lcms(方法b):3.26min[mh]+＝176.2.
步骤2:n,2-二甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(3-(2,2,2-三氟乙基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺
将3-(2,2,2-三氟乙基)苯胺(80.0mg，0.45mmol)、中间体e(180.0mg，0.38mmol)，dmap(3.0mg，0.02mmol)和diea(116.0mg，0.9mmol)在dmf(5ml)中的混合物在n2下在85℃下加热10h。加入水(10ml)，所得混合物用乙酸乙酯(2×10ml)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(洗脱液：石油醚：乙酸乙酯＝2:1)纯化，得到标题化合物(80.0mg，32％)，为黄色固体。
lcms(方法b):2.45min[mh]+＝564.3.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.35–10.22(brs,1h),9.04(s,1h),8.96(s,1h),8.15(d,j＝4.6hz,1h),7.83(d,j＝6.4hz,1h),7.63-7.61(m,3h),7.52(brs,2h),7.44(d,j＝8.1hz,1h),7.33-7.31(m,3h),7.26–7.19(m,1h),6.98(d,j＝7.6hz,1h),6.05–5.85(m,1h),3.47(s,3h,覆盖的),2.75(d,j＝4.6hz,3h),2.54(s,3h),2.29(s,2h).
化合物39
n,2-二甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(3-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯甲酰胺
将在dmf(5ml)中的3-(三氟甲氧基)苯胺(50.0mg，0.28mmol)、中间体e(80.0mg，0.24mmol)，dmap(1.5mg，0.01mmol)和diea(62.0mg，0.48mmol)在n2下在85℃下加热10小时。加入水(10ml)，混合物用乙酸乙酯(2×10ml)萃取。将合并的有机物用na2so4干燥，过滤并减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱(洗脱液：dcm:meoh＝15:1)纯化，得到标题化合物(40.0mg，30％)，为黄色固体。
lcms(方法b):2.66min[mh]+＝566.0.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.53(s,2h),9.44-9.41(m,2h),8.10–8.09(m,1h),7.80–7.78(m,2h),7.64(dd,j＝8.4,2.0hz,1h),7.32(brs,1h),7.20(brs,1h),7.12-7.07(m,2h),6.96(d,j＝8.4hz,2h),6.65(d,j＝8.4hz,2h),5.70(d,j＝6.0hz,1h),3.43(s,3h,覆盖的),2.74(d,j＝3.9hz,3h),2.25(s,3h).
化合物40
步骤1:2-(二氢-2h-吡喃-4(3h)-亚基)乙酸甲酯
向二氢-2h-吡喃-4(3h)-酮(10.0g，99.9mmol)在甲苯(300ml)中的溶液中加入2-(三苯基亚正膦基(phosphoranylidene))乙酸甲酯(36.8g，109.9mmol)。将所得混合物在110℃下搅拌18小时。将反应混合物倒入etoac(100ml)中，用水(3×100ml)、盐水(100ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过柱色谱(石油醚:etoac＝10:1)纯化，得到标题产物(11.5g，74％)，为黄色油状物。lcms(方法b):1.23min[mh]+＝157.1.
步骤2:甲基2-(四氢-4-(硝基甲基)-2h-吡喃-4-基)乙酸
向2-(二氢-2h-吡喃-4(3h)-亚基)乙酸甲酯(1.0g，6.40mmol)在无水thf(10ml)中的溶液中滴加在thf中的tbaf(1m，9.6ml，9.6mmol)和硝基甲烷(0.68ml，12.80mmol)。将所得混合物加热至70℃持续18小时。将反应混合物冷却至室温，用etoac(15ml)稀释，用hcl(1m，2×10ml)和盐水(10ml)洗涤。将有机层用无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(石油醚：etoac＝10:1)纯化，得到黄色固体(700mg,50％)。lcms(方法b):1.52min[mh]+＝218.11hnmr(400mhz,d6-dmso)δppm1.59(m,4h)2.61(s,2h)3.61(m.7h)4.78(s,2h)
步骤3:8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮
向2-(四氢-4-(硝基甲基)-2h-吡喃-4-基)乙酸甲酯(350mg，1.61mmol)在meoh(50ml)中的溶液中加入雷尼镍(raneyni)(35mg)，将混合物在45℃下在h2气氛下搅拌18小时。过滤反应混合物，减压浓缩滤液，得到粗产物(170mg，68％)，为灰白色固体。lcms(方法b):0.36min[mna]+＝178.11hnmr(400mhz,cdcl3-d)δppm1.67(s,4h)2.27(s,2h)3.23(s.2h)3.67(m,4h)6.17(s,1h).
步骤4:2-(3-硝基苯基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮
在n2气氛下向8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮(170mg，1.09mmol)在二氧六环(20ml)中的溶液中加入pd2(dba)3(101mg，0.11mmol)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(xantphos)(64mg，0.11mmol)和cs2co3(710mg，2.18mmol)。将所得混合物在100℃下搅拌16小时。将反应混合物减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱法(石油醚：etoac＝4:1-1:1)，得到标题化合物(100mg，33％)，为黄色固体。lcms(方法b):2.05min[mh]+＝277.1
步骤5:2-(3-氨基苯基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮
向2-(3-硝基苯基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮(100mg，0.36mmol)在甲醇(10ml)中的溶液中加入锌粉(234mg，3.60mmol)和饱和氯化铵水溶液(2ml)。将所得混合物在室温下搅拌0.5小时。将反应混合物过滤并将滤液减压浓缩。将残余物在碳酸氢钠水溶液(2ml)和etoac(2ml)之间分配，有机层用etoac(3×5ml)萃取。合并的有机层用盐水(5ml)洗涤，用无水naso4干燥，过滤并减压浓缩，得到标题化合物(80mg，90％)，为黄色固体。lcms(方法b):0.34min[mh]+＝247.1.
步骤6:1-(4-(甲基(2-((3-(3-氧代-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
向2-(3-氨基苯基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮(40mg，0.16mmol)在异丙醇(15ml)中的溶液中加入中间体c(66mg，0.15mmol)和浓hcl(0.1ml)。将所得混合物在80℃下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩，将残余物溶于nh3.h2o(3ml)中，并用dcm(3×10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水naso4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过制备型tlc(dcm:meoh:nh3.h2o＝30:1:0.3)纯化，得到标题化合物(58mg，59％)，为白色固体。lcms(方法b):2.67min[mh]+＝648.31hnmr(400mhz,cdcl3)δppm1.71(m,4h)2.59(s,2h)3.38(s,3h)3.69(m,6h)5.68(d,j＝6.4hz1h)7.18-7.30(m6h)7.42(d,j＝8.0hz1h)7.55-7.57(m,4h)7.85(d,j＝6.0hz1h)8.05(s,1h)9.12-9.16(m,3h).
化合物41
步骤1:2-(2-甲基-5-硝基苯基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮
在n2气氛下向2-溴-1-甲基-4-硝基苯(500mg，2.31mmol)在甲苯(20ml)中的溶液中加入8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮(717mg，4.63mmol)、k2co3(702mg，5.08mmol)，cui(88mg，0.46mmol)和n1,n1-二甲基乙烷-1,2-二胺(0.86ml，9.24mmol)。将所得混合物在110℃下搅拌过夜。将反应混合物倒入h2o(10ml)中，用etoac(3×10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过柱色谱(dcm:meoh＝80:1)纯化，得到粗产物(80mg)，将其通过制备型tlc(石油醚：etoac＝1：1)进一步纯化，得到黄色固体(34mg,5％)。lcms(方法b):1.91min[mh]+＝291.1
步骤2:2-(5-氨基-2-甲基苯基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮
向2-(2-甲基-5-硝基苯基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮(34mg，0.17mmol)在meoh(5ml)中的溶液中加入锌(76mg，1.17mmol)和饱和nh4cl水溶液(1ml)。将所得混合物在室温下搅拌1.5小时。过滤反应混合物，减压浓缩滤液。加入饱和na2co3水溶液(2ml)和h2o(3ml)，溶液用etoac(3×5ml)萃取。合并的有机层用盐水(5ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到黄色固体(30mg，100％)。lcms(方法b):0.38min[mh]+＝261.2
步骤3:1-(4-(甲基(2-((4-甲基-3-(3-氧代-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
向2-(5-氨基-2-甲基苯基)-8-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-3-酮(30mg，0.12mmol)在异丙醇(15ml)中的溶液中加入中间体c(53mg，0.12mmol)和浓hcl(0.05ml)。将所得混合物在85℃下搅拌过夜。加入饱和nahco3水溶液(5ml)，然后加入水(5ml)，混合物用dcm(3×10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过制备型tlc(dcm:meoh:nh3.h2o＝20:1:0.2)纯化，得到标题化合物(30mg，40％)，为白色固体。
lcms(方法b):2.67min[mh]+＝662.31hnmr(400mz,cdcl3)δppm1.78(brs,4h)2.21(s,3h)2.65(s,2h)3.34(s,3h)3.65(s,2h)3.75(brs,4h)5.59(d,j＝6.0hz1h)6.95(m,4h)7.14(m,4h)7.23(m,1h)7.45(d,j＝8.8hz2h)7.63(d,j＝5.6hz1h)8.03(s,1h)8.09(brs,1h)8.40(s,1h).
化合物42
步骤1:3-氨基-5-(三氟甲基)苯甲腈
向3-硝基-5-(三氟甲基)苯甲腈(432.0mg，2.0mmol)在乙醇(5ml)中的溶液中加入锌(1.3mg，20mmol)和氯化铵水溶液(5ml)。将所得混合物在60℃下搅拌14小时。将有机层过滤并将滤液减压浓缩。粗产物在h2o(5ml)和etoac(5ml)之间分配，混合物用乙酸乙酯(10ml)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥，浓缩得到残留物，将其通过柱色谱(洗脱液：石油醚：乙酸乙酯＝2:1)纯化，得到黄色固体(300.0mg，81％)lcms(方法b):2.33min[mh]+＝187.1.
步骤2:1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氰基-5-(三氟甲基)苯基)脲
在0℃下向3-氨基-5-(三氟甲基)苯甲腈(279.0mg，1.5mmol)在dcm(5ml)中的溶液中加入tea(202.0mg，2.0mmol)和btc(97.9mg，0.34mmol)，15分钟后加入n1-(2-氯嘧啶-4-基)-n1-甲苯-1,4-二胺(得自中间体c步骤1，234.0mg，1.0mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。用饱和nahco3水溶液(5ml)淬灭反应，然后将混合物用dcm(10ml)萃取，用na2so4干燥，并减压浓缩。残余物通过柱色谱(洗脱液：石油醚：乙酸乙酯＝1:1)纯化，得到黄色油状物(108.0mg25％)。lcms(方法b):2.93min[mh]+＝447.1
步骤3:5-(4-((4-(3-(2-氰基-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)氨基)嘧啶-2-基氨基)-n,2-二甲基苯甲酰胺
向5-氨基-n,2-二甲基苯甲酰胺(28.0mg，0.17mmol)、1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)氨基)苯基)-3-(3-氰基-5-(三氟甲基)苯基)脲(50.0mg，0.11mmol)在异丙醇(10ml)中的溶液中滴加浓hcl(3滴)。将所得混合物在85℃反应过夜。将反应混合物减压浓缩，残余物用乙酸乙酯(10ml)稀释，混合物用水(8ml)洗涤。分离有机层，用na2so4干燥并减压浓缩。残余物通过柱色谱(洗脱液：dcm:meoh＝15:1)纯化，得到标题化合物(10.0mg，16％)，为黄色固体。
lcms(方法b):2.56min[mh]+＝575.3.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.37(s,1h),9.95(s,1h),9.67(s,1h),8.23(s,1h),8.17(d,j＝4.5hz,1h),8.12(s,1h),7.90(s,1h),7.86(d,j＝6.6hz,,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.60(s,1h),7.52(s,1h),7.35(d,j＝8.7hz,2h),7.23(s,1h),5.90(brs,1h),3.48(s,3h),2.75(d,j＝4.6hz,3h),2.29(s,3h).
表达构建物
合成编码小鼠(残基1-464)或人(残基1-471)mlkl的cdna，通过沉默取代(dna2.0，ca)消除几个限制性位点。将编码mlkl的cdna连接到多西环素诱导型、嘌呤霉素筛选载体，pftre3gpgkpuro，如moujalleddm等人(2014)，细胞死亡疾病(celldeathdis)5：e1086；moujalleddm等人(2013)细胞死亡疾病4：e465；和murphyjm等人(2013)，免疫(immunity)39(3):443-453所述。通过sanger测序(micromondna测序设备，vic，澳大利亚，或通过dna2.0)验证序列。
通过用1.2μg载体dna和两种辅助质粒(0.8μgpvsvg和2μgpcmvδr8.2)转染接种在10cm皿中的hek293t细胞，制备慢病毒颗粒，如vinceje等人(2007)细胞(cell)131(4):682-693所述。使用病毒上清液感染靶细胞，转染的细胞在5μg/ml嘌呤霉素中筛选并维持。
试剂和抗体
内部制备重组htnf-fc，如bossenc等人(2006)，生物化学杂志(thejournalofbiologicalchemistry)281(20):13964-13971中所述。嘌呤霉素、多西环素和消毒抑制素-1购自sigma-aldrich。之前已经在vinceje等人(2007)，细胞131(4)：682-693中描述了smacmimetic，化合物a。q-vd-oph购自r&d系统。
1.2测定结果
如上所述测定本文所述的化合物。测定结果列于下表1和表2中。
实验1：筛选抑制tsq诱导的坏死性凋亡的化合物，96孔板式。
细胞系id：u937人组织细胞白血病细胞系。
细胞浓度(细胞/孔)：每孔120μl培养基中35,000个，计数并铺板，然后立即加入抑制剂和死亡刺激物。添加化合物和死亡刺激物后，最终孔体积为150μl。
细胞生长培养基：添加有7.4％v/vfcs(gibco，precisionplus.批号1221437)的htrpmi(wehimediakitchen，含有l-谷氨酰胺、青霉素和链霉素)
孵育时间(小时)：加入化合物和死亡刺激物后48小时
化合物浓度-log滴定:
10000nm、5000nm、1000nm、500nm、100nm、50nm、10nm、5nm、1nm、0.5nm、0.1nm
dmso终浓度(％v/v):在10μm孔1.2％至在对照孔中0.2％。
在死亡刺激混合物中的化合物及其终浓度：
htnf-fc(100ng/ml)由bossen等人，生物化学杂志，2006,281(20),13964-13971中所示的标准方法制备。
化合物a(500nm)-smacmimetic,tetralogic
q-vd-oph(10μm)-mpbiomedicals
分析:
用pi染色(1μg/ml)处理细胞，并通过流式细胞术分析
上述化合物的筛选结果如下表1所示。
表1:显示在实验1下进行的基于细胞的测定结果和上述化合物的结合数据的表。
nt-未测试
实验2:筛选抑制tsq诱导的坏死性凋亡的化合物，96孔板式。
细胞系id：u937人组织细胞白血病细胞系。
细胞浓度(细胞/孔)：最终细胞密度为5000个细胞/孔。
细胞生长培养基：ht-rpmi+7.4％fbs。细胞在带有透气盖的康宁(corning)150cm2组织培养瓶中，在37℃/5％co2下培养。
孵育时间(小时)：加入化合物和死亡刺激物后48小时
化合物浓度:100nm
dmso终浓度(％v/v):0.3％.
在死亡刺激混合物中的化合物及其终浓度：
htnf-fc(100ng/ml)由bossen等人，生物化学杂志，2006,281(20),13964-13971中所示的标准方法制备。
化合物a(500nm)-smacmimetic,tetralogic
q-vd-oph(10μm)–mpbiomedicals
分析:
数据加载到abase并作标准化。10点滴定曲线用4参数对数非线性回归模型拟合，记录的ic50反映了曲线拟合的曲线的拐点。
上述化合物的筛选结果如下表2所示。
表2：显示在实验2下进行的基于细胞的测定结果和上述化合物的结合数据的表。
在整个本说明书中，术语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包含(comprising)”的变化将被理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。
本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的广泛的一般范围的情况下，可以对上述实施例进行许多变化和/或修改。因此，本实施例被认为在所有方面是说明性的而不是限制性的。