基于硼替佐米的递送系统的制作方法

本发明的技术领域

本发明涉及用药物递送系统提供的基于微粒或纳米微粒(或载体)形式的硼替佐米的释放系统。载体中的硼替佐米可以是这样的形式或衍生物的形式，如下文所解释。

更具体地说，本发明涉及通过硼酸二酯类型的连接使分子单元(或连接基)与硼替佐米反应来获得的一类衍生物。

这些衍生物在中性环境中是稳定的，但能够在弱酸性环境(ph＝4.5-5.0)中降解，释放药物硼替佐米，并且它们也可以通过连接基与载体缀合。

根据本发明的衍生物代表一类与硼酸酯水解有关的硼替佐米前药，并且可以用于硼替佐米的转运，及其在经过具有中性ph的媒介、如血流(在其中药物保持稳定地以非生物活性硼酸酯形式缀合)后在弱酸性ph环境(如细胞内环境)中的释放。

在实践中，根据本发明的衍生物可用于硼替佐米的细胞内释放，因为它们允许药物以生物学无活性形式通过特征为近似中性ph(7.4)的血流转运，而一旦引入特征为酸性ph(约4.5-5.0)的细胞内环境，它们经历ph诱导的化学降解，引起治疗有效形式的硼替佐米的扩散。

在将这些衍生物用作药物递送释放系统的组分的情况下，它们将通过连接基单元锚定到其上，并且该具有递送功能的药物递送系统将能够到达ph4.5-5.0的细胞内环境，本发明涉及的前药的降解将在所述细胞内环境发生，引起硼替佐米的扩散。例如，根据本发明的衍生物可以用于在静脉内施用后(在中性ph环境中)实现硼替佐米的细胞内释放(在ph4.5-5.0)。

根据本发明的衍生物用于制备能够在细胞内环境中释放硼替佐米的治疗系统。

现有技术

式(i)表示硼替佐米[3-甲基-1-(3-苯基-2-(吡嗪-2-羧基酰氨基)-丙酰氨基)丁基硼酸]，其结构内具有硼酸官能团，因此具有与硼酸相似的反应性。

硼替佐米是属于一类新一代抗肿瘤药物的合成化合物，其通过抑制蛋白酶体26s的化学胰蛋白酶样活性并因此降解细胞蛋白而起作用[adamsj,palombellavj,sausvilleea,johnsonj,destreea,lazarusdd,maasj,piencs,prakashs,elliottpj.cancerres(1999),59:2615-2622；pickartcm,eddinsmj.biochimbiophysacta.2004年11月29日；1695(1-3):55-72.]

这在临床上用于治疗首次诊断或难治性多发性骨髓瘤(mm)和其他形式的肿瘤、如套细胞淋巴瘤的治疗[jagannaths,barlogieb,berensonj,siegeld,irwind,richardsonpg等人.britjhaematol(2004)127:165-172；orlowskirz.exprevanticancerther(2004)4:171-179]。还已测试了许多实体瘤的治疗，例如前列腺、乳腺、肺、肾和卵巢的肿瘤[cusackjc.cancertreatrev(2003)29:21-31]。硼替佐米抑制泛素-蛋白酶体途径。这种抑制对肿瘤细胞产生了许多影响，包括细胞增殖的变化[kingrw,deshaiesrj,petersjm,kirschnermw.science(1996)274:1652-1659]，细胞粘附[readma,neishas,luscinskasfw,palombellavj,maniatist,collinst.immunity(1995)2:493-506]和血管发生[dulicv,kaufmannwk,wilsonsj,tlstytd,leese,harperjw等人.cell(1994)76:1013-1023]，其导致细胞周期的停止和细胞凋亡。这些作用主要适用于肿瘤细胞，但也可能影响正常细胞[adamsj.seminoncol(2001),28:613-619]。

硼替佐米治疗引起的主要副作用是周围神经病变，通常代表其临床使用的剂量限制因素，还可能导致治疗中断。特别是硼替佐米诱导的周围神经病变为具有“手套-袜子”分布("gloveandstocking"distribution)的远端感觉异常和神经性疼痛形式[catajp,wenghr,burtonaw,villarealh,giralts,doughertypm.jpain(2007)8:296-306；cavalettig,pezzonig,pisanoc,oggionin,sala,f,zoiac,ferraresec,marmirolip,tredicig.neurosci.lett.(2002)322:103-106；richardsonpg,briembergh,jagannaths,wenpy,barlogieb,berensonj等人.jclinoncol(2006)24:3113-3120；meregallic,cantaa,carozziva,chiorazzia,oggionin,gilardinia,ceresac,avezzaf,crippal,marmirolip,cavalettig.eurjpain.(2010)14:343-350]。这些症状在使用硼替佐米治疗期间出现，而且在治疗中断后通常也会延长，导致严重影响患者生活质量的患者的可感觉残疾[jagannaths,barlogieb,berensonj,siegeld,irwind,richardsonpg等人.britjhaematol(2004)127:165-172]。然而，迄今为止尚不清楚周围神经纤维的什么特定形态学变化与硼替佐米诱导的神经病变的各种疼痛成分有关。

使用潜在可用于药物的释放/递送或基因的介孔二氧化硅颗粒构建的系统描述在下列文献中：wo2007108016、wo201209448、us20090311332。

文献wo2007108016描述了使用介孔二氧化硅颗粒构建的药物递送微米和纳米系统，其特征在于在颗粒的外表面上存在受体特异性配体，以及引入或主要结合在孔内的药物。受体特异性配体(其受体在肿瘤细胞中过表达)被肿瘤细胞识别并内化，且所有在细胞内环境中响应于特定刺激释放药物的纳米系统随其进入。受体特异性配体和药物可以是不同类型的。上述系统使得低药物剂量、低毒性和副作用的有效靶向治疗成为可能。

文献wo201209448描述了基于多孔二氧化硅的亚微米结构，其表面涂覆有阳离子聚合物。这些可以包括寡核苷酸和治疗剂。在所要求的治疗剂中引用硼替佐米的用途，而且所提出的系统不提供用于释放ph敏感性药物的机制。

文献us200903110332描述了一种合成介孔二氧化硅纳米颗粒的方法及其相应应用。该方法包括基于其尺寸分离颗粒。

将待递送的材料引入生产的颗粒中，并通过降低介孔二氧化硅颗粒表面的ph来实现控制释放。硼替佐米或硼替佐米的前药未被提及。

本发明的目的是开发硼替佐米衍生物，与根据已知技术施用时的硼替佐米相比，所述替佐米衍生物可以在副作用减少的情况下允许更好的递送效果。特别地，本发明的目的是抑制作为与硼替佐米的施用有关的不利副作用的周围神经病变。

发明概述

因此，本发明的目的在于一个释放系统，其包含下文即将给出定义的载体/连接基/硼替佐米缔合物。

本发明的另一个目的是由于降解能够释放硼替佐米的一类硼替佐米衍生物，所述降解发生在4.0-5.5、优选ph4.5-5.0。

这些衍生物具有下文即将要描述的通式(ii)。它们本身可以像硼替佐米一样用于相同的治疗用途，并且可以被引入到已知的掺入了用于递送药物的配体的微粒和纳米颗粒系统(如在wo2007108016中描述)。

根据本发明的衍生物使得减少通常与常规治疗中必需的高剂量抗肿瘤药物相关的副作用成为可能，这是直接在细胞内环境直接仅施用于肿瘤细胞的结果。

本发明的另一个目的是包含上文定义的硼替佐米衍生物与微米和纳米多孔颗粒的缀合物。基于具有提供能够接受必须被递送的一种或多种治疗剂或者前药的空腔的形态的二氧化硅的亚微米颗粒是优选的。特别优选的是wo2007/108016中描述的微粒和纳米颗粒。

另一个目的是包含前药或递送系统的药物组合物，其用于一般肿瘤形式的治疗或减轻与施用硼替佐米有关的副作用。

从下面的详细描述中，本发明的其它目的将是显而易见的。

附图简述

图1.包含在外表面上与叶酸偶联并容纳化学锚定在孔中的硼替佐米衍生物(图示为椭圆形)的介孔二氧化硅的缀合物的图。

图2.使用扫描电子显微镜获得的msu型介孔二氧化硅的显微照片。

图3.硼酸酯的¹³c-nmr光谱。

图4.ph5的模拟体液中浓度70ppm的硼替佐米的色谱图。

图5.与ph5溶液色谱图中第二个峰相关的校准线。

图6.与ph5溶液色谱图第三个峰相关的校准线。

图7.在ph5的模拟体液中的释放试验期间sba-bort样品的色谱图。

图8.在ph7的模拟体液中浓度50ppm的硼替佐米的色谱图。

图9.与ph7溶液色谱图的峰1相关的校准线。

图10.从缓冲至ph7的溶液获得的色谱图，其中将二氧化硅(sba-15)/连接基/硼替佐米缀合物样品混悬0.5小时。

图11.从缓冲至ph7的溶液获得的色谱图，其中将二氧化硅(sba-15)/连接基/硼替佐米缀合物样品混悬9.0小时。

图12.作为时间函数的从ph5和ph7的模拟体液中硼替佐米的释放。

图13.tem图像，阐明在孵育1小时后，表达fr的hela细胞对msn-fol的吸收(参见材料和方法部分)。以x8000倍率的获得图像(a)，而以x25000的倍率获取由方框所限定的面积(b)

图14.msn-fol/gps-btz抑制fr阳性hela子宫颈肿瘤细胞的生长(图14a)，但不抑制mcf-7乳腺癌细胞中的生长(图14b)，也不抑制正常hek293细胞的生长(c)，这二者均是fr阴性。将细胞用msn-fol/gps-btz处理或未处理(对照c)。将msn-fol和msn-fol/gps用作进一步的阴性对照(参见材料和方法)。在治疗1、2或3天后评估细胞活力。报告的值代表了对于每个条件一式三份进行的四次独立实验的平均值±标准偏差。

发明详述

以下定义适用于本发明的上下文：

·药物递送系统是指载体/连接基/硼替佐米缀合物；

·硼替佐米衍生物的前药是指在硼酸官能团上通过连接基与硼替佐米反应获得的通式(ii)的化合物；

·连接基或分子单元或双齿配体是指通式(iii)的分子，其一端能够与硼替佐米的硼酸官能团反应且另一端能够与载体结合；

·具有递送功能的配体或物质是指负责递送和识别在肿瘤细胞的表面丰富表达的分子从而导致靶组织的选择性递送的化合物；

·载体是指具有微米到纳米尺寸的颗粒，例如多孔二氧化硅颗粒，其可以与其表面上的硼替佐米的硼衍生物(如上所定义的前药)结合，例如它可以是多孔二氧化硅的颗粒或基于具有受控孔隙率的无机氧化物的基质，其例如是通过“分子印迹”方法或通过使用表面活性剂而获得二氧化硅(katz,a.；davis,m.e.molecularimprintingofbulk,microporoussilica,nature,2000,403,286-289)；

·药物递送微或纳米系统是指如上所述的载体，其表面上具有设计用于识别在肿瘤细胞表面上丰富表达的分子(从而导致选择性递送至靶组织)的化合物，所述化合物选自例如：叶酸、生物素、肽、抗体、糖苷、碳水化合物或蛋白质，所有化合物本身都是已知的。

根据本发明的硼替佐米衍生物由通式(ii)表示，可以通过通式(i)的硼替佐米与可由通式(iii)表示的双齿配体的化学反应获得，其反应在带有r4的配体末端形成环状硼衍生物。

在式(ii)的化合物中，y和z彼此独立地表示-nh、-o-、-s-，a是在式(i)的化合物(硼替佐米)和式(iii)的化合物之间的反应后得到的取代基。

特别地a具有以下含义

根据本发明的双齿配体(或连接基)由通式(iii)表示：

其中：

r1、r2、r3彼此独立地选自ch3、c2h5、och3、oc2h5、oc3h7、oc4h9、oc5h11；

x是单键或s、o、nh；

r4选自nh2、sh、环氧化物、卤素、cn、硫氰酸酯、-ch＝ch2；

n和m是正整数，使得n＝0-5，且m＝0-3，n+m≥1。

硼替佐米衍生物允许其通过开放硼环而在4.5-5.0的ph释放，而另一个末端可以保持游离或更有利地连接到已知的微粒或纳米微粒系统。

根据本发明的硼替佐米衍生物可以通过提供以下基本步骤的方法获得。

根据本发明的硼替佐米衍生物可以如下制备：首先使硼替佐米与式(iii)的连接基反应，从而得到式(ii)的化合物，然后将其与载体结合。作为替代方案，将式(iii)的连接基通过r1、r2和r3取代基与载体反应，并且使得获得的物质与硼替佐米反应，得到根据本发明的载体/连接基/硼替佐米系统。所有的反应都是属于本领域技术人员知识范围的有机反应。典型的反应条件例如在实施例部分中阐述。

硼替佐米衍生物可用于硼替佐米的细胞内释放，因为它们允许药物以生物学无活性形式通过血流转运，而一旦达到细胞内环境，它们经历环境特征(ph)诱导的化学降解，释放出游离的硼替佐米。

当将衍生物用作药物递送系统的组成部分时，其将被锚定，并且由于整个系统具有递送功能，其将能够达到ph4.5-5.0的细胞内环境，在这里随着硼替佐米的释放将发生前药的降解。

该衍生物被降解，在4.5-5.0的ph(细胞内环境的典型ph)释放硼替佐米。关于本文所述的微-纳米系统的一般描述，其中这些用于转运硼替佐米前药，其为本发明目的，参见文献wo2007108016。

下图描述了本发明所述的潜在用途。具体而言，阐述了作为微或纳米系统的组分用于硼替佐米的细胞内释放的潜在用途。该系统包括基于具有规则和受控的孔隙率的无机氧化物的基质(在特定情况下阐述了介孔二氧化硅的颗粒)，其特征在于负责递送和分子识别的物质(图示为星号；例如在图1中选择了叶酸)选择性地偶合(优选在外表面上，且优先地在孔中)属于为本发明目的的分子类别的分子(硼替佐米的前药，其图示为椭圆形)，其化学锚定至系统。

在本发明的另一个实施方案中，除了或作为负责递送和分子识别的物质的替代物之外，无机基质还包含其他具有标记功能的分子，特别是荧光标记物。这些分子可以在无机基质的外表面上与递送物质组合。优选罗丹明和荧光素。一种制备方法在morelli,c.等人.l.peg-templatedmesoporoussilicananoparticlesexclusivelytargetcancercells.nanoscale.2011aug；3(8):3198-207中描述，其中描述了结合荧光素和叶酸的介孔二氧化硅的制备。

根据本发明的硼替佐米衍生物代表一类与硼酸酯水解有关的硼替佐米前药，并且还可以缀合在用于药物递送的微-纳米系统表面上，以该方式成为其组成部分。

它们在中性ph下是化学稳定的，而它们在弱酸性ph(4.5-5.0)时分解释放硼替佐米。在其已经通过了具有中性ph值的介质(其中药物以非生物学活性的硼衍生物的方式保持稳定缀合)后，在需要诱导其具有弱酸性ph的环境中扩散的情况时，它们可用于转运和释放硼替佐米。

在其已经通过了具有中性ph值的介质(其中药物以非生物学活性的硼衍生物的方式保持稳定缀合)后，在需要诱导其在具有弱酸性ph的环境中扩散的情况时，这些衍生物也可以结合于用于转运硼替佐米的微米和纳米颗粒系统，如果将上述用于药物递送的微米和纳米系统用于静脉内注射，则会发生这种情况。

根据本发明的硼替佐米衍生物在其结构中具有硼酸酯官能团，因此具有类似于硼酸酯的反应活性。

已经与硼替佐米反应产生具有上述性质的前药的分子(双齿配体)由通式(iii)表示。

特别优选的分子是式2.1的3-环氧丙氧基丙基-三甲氧基硅烷：

其他特别优选的分子是：

3-氨基丙基三乙氧基硅烷

3-氨基丙基三甲氧基硅烷

4-氨基丁基-二甲基甲氧基硅烷

3-(2-氨基乙基氨基)丙基-三甲氧基硅烷(n-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺)

3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]-丙基三甲氧基硅烷；(ch3o)3si(ch2)3nhch2ch2nhch2ch2nh2

3-(2-氨基乙基氨基)丙基-甲基二甲氧基硅烷

3-巯基丙基三甲氧基硅烷

3-环氧丙氧基丙基二甲氧基甲基硅烷

3-环氧丙氧基丙基二甲基乙氧基硅烷

3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷

烯丙基三乙氧基硅烷

烯丙基三甲氧基硅烷

3-氰基丙基三乙氧基硅烷

氯甲基(甲基)二甲氧基硅烷

氯甲基三甲氧基硅烷

氯甲基三乙氧基硅烷

(3-氯丙基)二甲氧基甲基硅烷

(3-氯丙基)三甲氧基硅烷

3-氰硫基丙基三乙氧基硅烷

3-氰硫基丙基三甲氧基硅烷

药物组合物的施用

本发明还包括药物组合物，其包含式(ii)的硼替佐米衍生物和基于硼替佐米的缀合物，以及药学上可接受的载体。

根据本发明的衍生物和根据本发明的缀合物可以配制用于单独施用或与其它活性成分或前药(例如抗肿瘤药物、遗传物质、放射性核素或荧光标记物)同时、依次或延迟施用，因此可以插入单一制剂中或分开的制剂中。

用于治疗领域，将药物组合物在本领域技术人员已知的适于所设想的施用类型的制剂和需要治疗的个体的载体中制备。

制剂可以例如通过使用本领域技术人员已知的并且是药学上可接受的盐和缓冲物质或其它赋形剂来实现。

根据本发明的衍生物和缀合物的施用可以例如鼻腔、颊、口服、皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、鞘内、颅内、肠胃外或腹膜内进行。

可用于注射剂的药物形式可以例如包括无菌水溶液或分散液、例如用于制备即用分散液的无菌粉末，和本领域技术人员已知的用于制备注射剂的所有赋形剂、载体和缓冲液。无菌粉末优选通过本领域技术人员已知的干燥技术来制备，例如通过真空干燥和冷冻干燥。

基于需要治疗的个体的病症的严重性和所选择的施用途径，负责治疗的本领域技术人员会确定治疗适合的剂量。

根据本发明的任何组合物可以包含在施用试剂盒中。作为非限制性实例，根据本发明的试剂盒可以包含硼替佐米衍生物或以用于特定施用的适当方式配制的载体/连接基/硼替佐米递送系统，以及药学上可接受的载体，例如注射用水制剂或药学上可接受的口服施用载体(适用时)。

根据本发明的试剂盒的组分可以是液体形式或冻干形式，并且优选单独地或已经混合地包装在合适的无菌容器中，例如瓶、试管或注射器。

根据本发明的试剂盒还可以包含用于通过各种可能的施用途径(例如肠胃外、肌肉内或静脉内施用)施用根据本发明的纳米载体的工具或装置。

根据本发明的试剂盒还包含对于各组分和试剂盒本身未包含的任何其它试剂用途的说明书。

基于本发明的硼替佐米的递送系统和前药有利地用于肿瘤的治疗，特别是它们可用于减轻副作用并改善受各种类型肿瘤侵袭的个体的临床病症，所述肿瘤特别是癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、如套细胞淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肾脏癌和卵巢癌、更特别是卵巢癌、肾癌、脑癌、肺癌和乳腺癌。

根据本发明的递送系统和前药可以有利地用于所有使用硼替佐米所治疗的那些疾病，以便减少其剂量并减轻副作用，例如外周神经纤维的形态学变化、周围神经病变、具有“手套-袜子”分布的远端感觉异常和神经性疼痛。

以下实施例与附图一起提供纯粹为了说明本发明，而不被视为限制其范围。

实施例

式(ⅲ)的连接基与纳米载体的结合和随后与硼替佐米的反应

用3-环氧丙氧基丙基官能化的二氧化硅的合成

方法

使干燥的二氧化硅(sba-150.55g)在惰性氮气氛下与3-环氧丙氧基丙基硅烷(0.74ml)在无水甲苯中反应。使该反应在磁力搅拌下在回流下继续进行8小时。滤去官能化的二氧化硅，并用四氢呋喃在聚酰胺过滤器上洗涤，随后干燥。以这种方式回收用环氧丙氧基丙基连接基官能化的二氧化硅(1.1g)。

[n-2(-氨基乙基)-3-氨基丙基硅烷)](aeaps)

(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺(sideta)

将介孔二氧化硅(sba-15或其他类型)在炉中约120℃下预活化过夜，随后冷却，并用氨基硅烷(aeaps或sideta)处理。

将该混合物与无水甲苯(30ml/g载体)一起在n2气氛中加热回流24小时。将该反应混合物冷却至环境温度，在真空下过滤除去甲苯和过量的二胺。

将回收的产物用二氯甲烷洗涤数次，并在40℃真空干燥。

备选项a

作为一个备选项，可以在干燥的二噁烷中进行与3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷的官能化反应。

在环境温度在干燥的二噁烷中接枝反应18小时

合成过程提供400mg的介孔^*材料的混悬液和0.80ml的3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷在12ml干燥二噁烷中的溶解。将该混合物在环境温度在磁力搅拌下持续18小时。随后将该混合物过滤，在二噁烷和干燥的thf中洗涤，并在45℃下干燥。

备选项b

作为一个备选项，这种类型的反应可以在环境温度使用更长的反应时间在乙醇中进行。

在典型的制备中，将8.11g3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes，c9h23no3si)溶于17.13ml乙醇中获得溶液，将该溶液引入通过将4gmsu^*型介孔二氧化硅(适当地干燥)混悬于14.3ml的乙醇中而获得的混悬液中。将获得的混悬液在环境温度搅拌18小时，随后洗涤，过滤并干燥。

回收了3.50g的产物(应该记住，以下步骤可以涉及孔隙由合成表面活性剂浸渍的材料和不含表面活性剂的材料。在上述情况下，使用孔隙用合成表面活性剂浸渍的材料，并且其如果混悬在乙醇中释放表面活性剂或其部分，则使得涉及在收率计算结束时回收的产物的量的数据不是非常显著)。

^*任何官能化方法都适用于所有类型的介孔二氧化硅，但是所提出的备选方案(尤其是使用为非质子溶剂的二噁烷的备选方案a)适用于微-纳米系统的官能化，在所述系统上受体特异性配体如叶酸或其它已经预先结合，条件是其在环境温度和在保持其生物活性的反应条件下进行。

上述官能化反应可用于通式(iii)的所有连接基，相对于所需的官能化反应时间。

用3-丙氧基丙基-1,2-二醇官能化的二氧化硅的合成

方法

-将环氧丙氧基丙基官能化的二氧化硅与0.001n的hcl溶液反应。使该反应在环境温度在磁力搅拌下进行7小时。

-在聚酰胺过滤器上进行过滤和用蒸馏水和分析纯丙酮进行洗涤。回收用二醇官能团官能化的二氧化硅。

将硼替佐米锚定在官能化的二氧化硅上

-在惰性氮气氛中，使硼替佐米与用二醇官能团官能化的二氧化硅在无水二氯甲烷中反应。使该反应在磁力搅拌下进行90分钟。

-使用无水二氯甲烷在聚酰胺过滤器上进行过滤和几次洗涤。回收结合为环状硼酸酯的带有硼替佐米的二氧化硅。

以下制备作为备选项

在分子筛存在下，将等摩尔量的硼替佐米和用aeaps和sideta配体官能化的介孔二氧化硅(sba-15或其它类型)上的官能团在无水甲苯中加热至40℃达7小时。将回收的产物(二氮杂硼戊环(diazaborolidine))用二氯甲烷洗涤数次，并在真空下干燥。

二氮杂硼戊环在稀酸溶液中迅速水解，但在中性溶液中，水解非常缓慢(j.am.chem.soc.,1958,80(20),第5411-5413页)

式(ii)的硼替佐米衍生物的制备和随后与纳米载体的结合

·使3-环氧丙氧基丙基硅烷与0.001nhcl在thf(四氢呋喃)中的溶液反应。

·将该反应混合物在磁力搅拌下持续3小时。

·通过在减压条件下除去溶剂来回收不纯的产物，然后用水处理，随后用二氯甲烷萃取。以这种方式回收3-(甲硅烷基丙氧基)丙烷-1,2-二醇，然后将其在二氯甲烷中与硼替佐米反应约2小时。将所得硼酸酯在环境温度用二氧化硅(sba-15或其它类型)在乙醇中处理48小时。

·在聚酰胺过滤器上将其过滤并使用乙醇和无水二氯甲烷洗涤数次。回收结合为环状硼酸酯的带有硼替佐米的二氧化硅。

使用aeaps和sideta配体，可以使用与用于将硼替佐米与用aeaps和sideta官能化的二氧化硅结合的相同的条件来进行与硼替佐米的连接。然后作为用环氧丙氧基获得的式(ii)的衍生物，可以将获得的式(ii)的衍生物连接于二氧化硅。

1-氨基-3-(3-甲硅烷基)丙氧基)丙-2-醇

将气态氨在环境温度鼓泡通过3-环氧丙氧基丙基硅烷在乙醇中的溶液达10小时。在减压条件下除去溶剂，并回收1-氨基-3-[(3-甲硅烷基)丙氧基]-丙-2-醇(c)，然后在甲苯中在40℃在分子筛的存在下用等摩尔量的硼替佐米处理。

将得到的氧杂氮杂硼戊环(oxaazaborolidine)在环境温度用二氧化硅(sba-15或其它类型)在乙醇中处理48小时。

在聚酰胺过滤器上将其过滤并使用乙醇和无水二氯甲烷洗涤数次。在回收的产物中，硼替佐米通过氧杂氮杂硼戊环结构与二氧化硅结合。

对于其中r4为双键的通式(iii)的配体(烯丙基三乙氧基硅烷、烯丙基三甲氧基硅烷等)，所述双键可以通过与过酸的环氧化反应或者通过形成卤代醇、随后分子内亲核取代而转化成环氧化物。然后以与环氧丙氧基丙基相同的方式处理得到的环氧化物。

在r4是卤素((3-氯-丙基)三甲氧基硅烷)的情况中，可以通过脱卤化氢(β消除)反应将配体转化成相应的烯烃，然后以与其中r4是双键的衍生物相同的方式处理。

硼酸酯的合成

硼替佐米可以与通过打开分子中存在的环氧基而获得的二醇进行反应，形成环状硼酸酯。

使用硼酸模型进行初步实验，以研究和开发从3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷开始形成硼酸酯的最佳反应条件。为此，使用3-甲基丁基硼酸和苯基硼酸作为模型底物。

三甲氧基甲硅烷基的存在使得与介孔二氧化硅的表面结合成为可能。形成的酯键可以在弱酸性环境(ph4.5-5.0)中水解，并允许药物在内体释放，因此在靶位点限制释放离开细胞环境。

使用前面的实施例中的硼衍生物官能化的纳米颗粒

官能化

硼替佐米前药可用作微或纳米系统的组分用于药物递送。

随后的实验方法提供了介孔二氧化硅纳米微粒的官能化，和随后与通过硼酸引入的官能团的共轭。使用3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷官能化介孔材料；随后水解环氧官能团以使硼替佐米能够被锚定。

3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷分子能够结合硼替佐米，同时可以锚定到介孔二氧化硅的表面。

通过修改文献报道的制备来合成sba-15型的介孔材料(colloidsandsurfacesa:physicochem.engaspects229(2003)1-8)。所用的制备是原始方法的扩大，并且对于etoh/h2o摩尔比进行修改。sba15样品的制备：将4.2gpluronicp-123(sigmaaldrich)和随后的0.7gctab(alfaaesar)溶于包含56.6ml超纯h2o、35ml99+％etoh(sigmaaldrich)和84ml2mhcl的溶液中。当溶解完成时，加入14mlteos(sigmaaldrich)，将得到的混合物在环境温度在搅拌下持续30分钟，随后转移到特氟隆高压釜中，在这里将其在80℃陈化5小时，随后在120℃陈化12小时。通过使用孔隙率为0.2μm的聚酰胺过滤器过滤来回收得到的白色沉淀。

或者可以使用通过以下合成方案或类似方法(源自wo2007108016中所要求保护的方法)获得的msu类型的介孔二氧化硅：在500ml塑料烧杯中制备包含150g蒸馏水和13.80gtritonx-100(sigma-aldrich)的溶液。一旦表面活性剂完全溶解，制备包含10g正癸烷(99+％c10h22,carloerba)和14.50gteos(si(oc2h5)4,sigma-aldrich)的溶液。将该溶液沿烧杯壁缓慢倾倒，在烧杯中非常轻柔地搅拌将表面活性剂-模板溶解。将所获得的两相乳液在轻柔搅拌下在环境温度陈化8天。一旦去除了上层的有机相，使用孔隙率为0.2μm的聚酰胺过滤器过滤乳液。

可以使用其它类型的介孔二氧化硅作为替代。

将sba-15介孔材料用3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(5)在无水甲苯中在回流下处理8小时(图1.1)。ⁱ

用四氢呋喃过滤和洗涤后，回收官能化的介孔二氧化硅，并通过红外(ir)光谱、热重分析(tga)和差示量热法(dsc)表征。

ir光谱中获得了与二氧化硅的硅烷醇基中的o-h键的拉伸相关的3450cm^-1处的吸收的强烈降低，和对应于环氧丙氧基丙基的碳原子链的2951和2853cm^-1处的c-h键的拉伸带的存在，而其在非官能化的材料的ir光谱中是不存在的。

有机配体的特征也是涉及环氧环的不对称拉伸的在910和816cm^-1处的带。

在煅烧后的sba-15介孔材料和用3-环氧丙氧基丙基官能化的材料(8)上进行dsc和tga分析。

从涉及两个样品的dsc和tga分析的曲线图(未示出)中发现了相当大的差异。在官能化的材料的情况下，tga曲线显示出约11.3％的重量损失(表示为0.113的有机质量/(sio2+有机质)质量比)。在dsc曲线中，在248℃的放热峰是环氧丙氧基丙基的燃烧反应的证据。

为了从官能化的介孔二氧化硅(8)合成硼酸酯，通过在酸性环境中的水解将环氧环转化为相应的二醇。

水解反应通过用0.001n盐酸水溶液在环境温度处理介孔二氧化硅8进行7小时(图2.1)。

将通过过滤回收的水解产物9干燥，并通过ir光谱和dsc和tga分析来表征。在产物9的红外光谱中看到，涉及由于二醇官能团的存在导致的在约3443cm^-1处的o-h键的拉伸的带的强度增加，且对应于环氧环的不对称拉伸的910cm^-1处的带消失。

使用3-甲基丁基硼酸(6)作为模型底物，进行从官能化的介孔二氧化硅9开始的形成硼酸酯的实验。将化合物9用硼酸6(硼替佐米类似物，使用类似于硼替佐米的分子更直接地将分子的反应性与官能团的结构相关联，以支持研究以使其更严格，条件类似于硼替佐米反应发生的那些条件)在无水甲苯中在回流下处理24小时(图3.1)。

将通过过滤反应混合物而回收的产物(10)用thf洗涤(其中溶剂3-甲基丁基硼酸是可溶的)，干燥并通过ir光谱和dsc和tga分析来表征。

硼酸二酯的形成

使用另一种模型系统形成硼酸二酯：苯基硼酸(硼替佐米的类似物)。9与苯基硼酸的反应在不同条件下进行：反应使用二氯甲烷作为溶剂在环境温度进行较短时间。将介孔材料9用苯基硼酸(11)在无水二氯甲烷中在环境温度处理90分钟(图4.1)。

使用ir光谱和dsc和tga分析对经过滤和用二氯甲烷洗涤后回收的产物12的表征，证实了硼酸酯的形成。作为12结构的表征的ir光谱显示出了对应于硼酸苯酯的3015cm^-1处的芳族c-h键的拉伸带，由于硼酸酯的b-o键的非对称振动引起的1368cm^-1处的吸收带，和涉及垂直于ar-h键的平面的折叠效应的804和707cm^-1处的两个带。

然后使用与使用苯基硼酸的实验相似的条件将硼替佐米锚定在sba-15介孔二氧化硅上(图5.1)。

通过ir光谱分析回收的产物(14)显示存在对应于硼替佐米分子中存在的酰胺键的1680cm^-1处的拉伸带，和1533cm^-1处的带，这可归属于nh基团的折叠。硼替佐米分子的典型代表还在于涉及c-n键的拉伸的1446cm^-1处的带，和对应于在芳环的平面外的弯曲的744和701cm^-1处的带。起始二醇(9)的ir光谱中不存在这些谱带。

通过固态化合物14的nmr分析也证实了硼替佐米与官能化的介孔材料9的锚定。

在14的¹³c-nmr光谱中观察到归属于有机配体和硼替佐米分子二者的所有信号(图3)。

7.52ppm的信号是由于与二氧化硅结合的亚甲基(si-ch2)的阳碳，而21.49和23.50处的两个信号分别对应于亮氨酸的氨基酸残基的侧链中的甲基和与硅结合的丙基链的中心亚甲基碳。

70.50和71.56ppm还存在涉及与有机连接基的醚氧原子结合的两个ch2基团(ch2-o-ch2)的碳原子的信号。在122.56-154.76ppm的范围内，光谱显示涉及硼替佐米分子的芳族碳的信号，以及可归属于该分子的酰胺carbonils的在162.76和171.45ppm之间的信号。

在固态²⁹si-nmr光谱(未示出)中，在-110.6和-105.5ppm观察到两个非常强的峰，分别对应于结构q⁴[si(osi)4]和q³[si(osi)3oh]。较低的场中也存在-66.2和-56.1ppm的两个峰，这可归属于t³[rsi(osi)3]和t²[rsi(osi)2oh]结构的硅。光谱中存在的t形状(tspecies)证实有机配体已连接到二氧化硅的无机结构上。14的¹¹b-nmr分析还显示可归属于三配位和四配位硼的信号。

作为药物递送微或纳米系统的组分的硼替佐米前药：前药在不同ph的稳定性评估

如上所示，用于将药物锚定到基质的连接剂是3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷，其能够同时与药物的硼酸官能团和介孔材料反应。

根据这种方法，药物在介孔材料的二氧化硅表面共价结合。该键在中性ph下稳定，并且在通常在内体和溶酶体内的细胞中发现的弱酸性ph(4.5-5.0)下变得不稳定。

这些特征(以及将受体特异性配体与系统共轭的可能性)使系统整体潜在地能够在循环流中扩散(无硼替佐米的显著损失)，被过表达受体特异性配体受体的肿瘤细胞识别和内化，在共价键的酸水解后释放药物。

通过hplc(高效液相色谱)在ph5.0和ph7.0(分别模拟细胞内和血液流动环境)的缓冲溶液中分别评价上述系统的性能。

通过包含硼替佐米前药(二氧化硅(sba-15)/连接基/硼替佐米缀合物)的药物递送系统释放硼替佐米。

通过再现其“在体外”将接触的生理环境来研究来自整个系统的药物的释放特征。因此，在中性ph(sbf)的溶液中模拟释放，以模拟基质药物系统在循环流中直到其进入靶细胞、以及在ph＝5的酸溶液(模拟内体中存在的环境)中的路径，所述内体为在药物-基质体系已通过内吞作用内化后形成的细胞内囊泡。

c-sbf(模拟体液)的制备

c-sbf是缓冲至不同ph值的溶液，其模拟体液环境。

特别地使用在：

1)由磷酸二氢钾(kh2po4)和氢氧化钠(naoh)替代形成的ph7的缓冲溶液，再现血浆的中性环境。

2)基于乙酸钠和乙酸的ph4.4的缓冲溶液，其再现了内吞后药物接触的溶酶体的酸性环境。

hplc(高效液相色谱)的分析条件。

使用乙腈/水(30/70v/v)与0.1％甲酸作为洗脱相，流速1.0ml/min，通过hplc评价药物释放特性。将uv检测器设定在270nm。

使用lichrosorbrp18teknokroma10μm25x0.46柱。

注射溶液的体积为1微升，并且历经12小时以30分钟的间隔获得来自生理条件下溶液的样品。

使用具有不同浓度的硼替佐米的三种缓冲溶液来绘制校准线。药物在hplc色谱图中在ph5显示三个不同的峰。

考虑将第二和第三峰用于评估药物释放的目的，因为它们所对的面积与标准溶液的浓度呈线性相关。

两个不同峰的存在是由于在所讨论的ph存在两种形式的硼替佐米，其具有不同的洗脱时间，如图4所示。

通过分析不同浓度的硼替佐米溶液得到的值分别列于表1.1和2.1中，分别对应于在ph5得到的色谱图中鉴定为数字2和3的峰，如图4所示。从峰2和3获得的校准线分别示于图5和图6中。

表1.1ph5的溶液的第二个峰所对的面积值

表2.1ph5的溶液的第三个峰所对的面积值

在酸性环境(ph＝5的缓冲液)中硼替佐米的释放

本发明涉及的前药(二氧化硅(sba-15)/连接基/硼替佐米缀合物)本身或作为药物递送微或纳米系统的组成部分(在这种情况中图1中的载体)是一种能够在弱酸性ph释放硼替佐米的活性形式的分子。弱酸性ph是细胞内环境的特征，所以如果这是前药或其中它作为组分的系统在穿过中性ph值的血液之后、通过内吞作用被内化后所接触的第一个弱酸性ph的隔室，则药物可在细胞环境中扩散。内体(胞内细胞器)实际上特征在于接近5的弱酸性ph值，所以在再现内体酸性环境的溶液中评价二氧化硅(sba-15)/连接基/硼替佐米偶联物样品的释放。为此目的，使用乙酸/乙酸钠缓冲液，其通过将从99％乙酸(carloerba)获得的51ml0.2m乙酸水溶液与49ml0.2m乙酸钠水溶液混合来制备。通过向49ml超纯水中加入0.803g乙酸钠[ch3coona](sigmaaldrich)获得49ml0.2m乙酸钠水溶液。

通过将4mgsba-bort材料溶于15mlph值接近5的缓冲溶液中来制备注入色谱柱的样品，并在37℃搅拌以提供细胞内环境的生理条件的最佳再现。

表3.1显示通过hplc得到的硼替佐米在ph5的缓冲溶液中的浓度，所考虑的峰的相对面积和不同时间间隔的表示的表示为克的量。

图7显示了在ph5的模拟体液中进行的释放试验期间的hplc色谱图。

通过将相应峰所对的各面积值除以校准线的梯度(y)的值，获得不同时间间隔的药物浓度。

特别是在前2.5小时内发现的浓度只来自第二个峰所对的面积，因为第三个峰只可从第三个小时后探测到。然而，在随后的时间考虑两个峰，以便从对应于所有单个面积的浓度的总和获得药物的最终量。

从表3.1所示的值可以看出，药物的浓度随着时间的推移逐渐有增加的趋势，直到大约第八个小时，然后达到近似恒定的值。

中性环境中(缓冲液ph＝7)硼替佐米的释放。

为了证明系统在中性ph环境(如血流)中的稳定性，在37℃在ph7缓冲的媒介(模拟血液流动)中对sba-bort样品上进行释放试验。

为了此目的，使用kh2po4/naoh(磷酸二氢钾/氢氧化钠)缓冲液，其通过将6.81g磷酸二氢钾溶解在291ml0.10m氢氧化钠中来制备。

表3.1作为时间的函数的涉及ph＝5时sba-bort的释放的数据

随后将4mgsba-bort样品分散在15ml缓冲溶液中。在37℃将该混合物在搅拌下持续释放试验的整个时间。

每30分钟取出上述混合物的样品用于hplc分析。图8显示在ph7的模拟体液中的50ppm浓度的硼替佐米的色谱图。

从不同浓度的硼替佐米溶液的分析中获得的值显示在表4.1中，涉及鉴定为编号1的峰。所获得的校准线如图9所示。

表4.1ph7的溶液的峰值所对的面积的值

从图10和图11所示的两个色谱图可以看出，即使在ph7的流体中混悬9小时后，也几乎不存在图8中鉴定为编号1的峰。

特别是在大约前4个小时内，没有观察到可以通过hplc检测到的来自二氧化硅(sba-15)/连接基/硼替佐米缀合物系统的药物损失。

表5.1显示了作为时间的函数的说明硼替佐米在ph7释放的数据。

二氧化硅(sba-15)/连接基/硼替佐米缀合物系统在ph5的缓冲溶液中保留9个小时后释放的硼替佐米的量比在相同时间在上述缓冲溶液中检测到的量约50倍还多。

图12显示了在两种不同ph值下硼替佐米释放的进程：在ph5和ph7的缓冲液中作为时间的函数。

从如图12.1所示的释放数据可以得出结论，系统在模拟血浆环境的溶液中非常稳定。当sba-bort系统保持在溶液中长达三个小时时，所使用的技术没有检测到药物的存在，之后它仍然大部分锚定在介孔二氧化硅基质上。

涉及硼替佐米在酸性环境中释放的实验证据表明，即使sba-bort系统在短时间内停留，溶液中也存在显著浓度的药物，证实了硼酸二酯类的键在弱酸性ph下的不稳定性。

表5.1作为时间的函数的涉及sba-bort在ph＝7时释放的数据

细胞活力实验

因此，对包含基于具有规则和控制的孔隙率的无机氧化物的基质的系统进行细胞活力的实验，其特征在于叶酸选择性地偶联到基质上(作为负责分子的靶向和识别的物质)，且硼替佐米前药被锚定在孔中。

为此目的，将介孔二氧化硅纳米微粒(msn，上文也称为sba)用叶酸(因此产生称为msn-fol的颗粒)或用叶酸和硼替佐米(后者称为：msn-fol/gps-btz)(代表根据本发明的更“完整的”产物，即药物递送微-纳米系统)官能化。在这种特定情况下，所测试的是连接基，是环氧丙氧基丙基(gps)官能团。

进行细胞更新和活力实验。通过细胞活力实验确定纳米颗粒的潜在毒性，其显示它们在至高为3μg/10⁵个细胞的浓度下是无毒的(未报道的结果)，因此我们在随后的实验中继续使用该msn/细胞数量比。

使用电子显微镜(tem)进行的观察显示，甚至在孵育1小时后，msn-fol成功地穿透表达高水平fr的hela细胞(主要位于细胞质内的内体结构内)(图13)。

为了确定纳米颗粒是否可以构成靶向治疗中的可靠工具，使用ph敏感系统将msn-fol与硼替佐米缀合(msn-fol/gps-btz)。然后将这些颗粒改造以试图获得一种抗肿瘤装置，该抗肿瘤装置将使用叶酸作为仅负责识别fr阳性细胞的受体特异性配体，一旦由msn介导的受体内吞发生，ph敏感系统只能在内溶酶体(endolysosomal)腔的酸性环境中释放药物。

通过使用台盼蓝不相容试验的细胞活力实验来评估msn-fol/gps-btz的毒性/功效(参见材料和方法)。与对照相比，在用msn-fol/gps-btz处理的hela(fr阳性)细胞中仅1天后观察到生长明显停止。然后在治疗的第二天以及尤其是第三天将抑制细胞效应转化为细胞毒性效应(图14a)。在确认毒性仅仅是由于存在btz的情况下，作为进一步阴性对照的合成中间体msn-fol和msn-fol/gps显示在任何考虑的时间内对细胞增殖没有显著影响(图14a)。

相反，相对于对照或用msn-fol和msn-fol/gps处理的样品，使用msn-fol/gps-btz处理后，均为fr阴性株的mcf-7乳腺癌细胞和正常hek293胚胎肾细胞没有显示出对生长有抑制作用(图14b和14c)(morellic.,marisp,siscid,perrottae,brunellie,perrottai,pannoml,tagarellia,versacec,casulamf,testaf,andòs,nagyjb,pasqual.peg-templatedmesoporoussilicananoparticlesexclusivelytargetcancercells.nanoscale.2011年8月；3(8):3198-207)。

所获得的数据显示，我们的介孔二氧化硅纳米颗粒是药物控制释放领域的潜在载体，因为它们只能被表达fr的肿瘤细胞选择性识别和内化，而不被fr阴性细胞(例如大多数正常细胞)识别和内化。这将允许药物在溶酶体内(ph4-5)释放并且仅在靶细胞内起作用，由此使得由于非选择性系统分布而导致的副作用的显著降低。

材料和方法

细胞系和培养条件

将hela人子宫颈腺癌细胞(americantypeculturecollection，atcc，美国)和正常hek293胚胎肾细胞在补充有10％胎牛血清(fbs)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)中培养；将mcf-7人乳腺癌细胞(interlabcelllinecollection，iclc，genoa，意大利)在含有5％fbs的dmem:f12中繁殖。

将100iuml^-1的青霉素、100μgml^-1的链霉素和0.2mm的l-谷氨酰胺加入到两种培养基中。培养基和试剂从(thermofisherscientificinc.)获得。

透射电子显微镜检查(tem)

将细胞接种在60mm直径的细胞培养培养皿中，并在37℃用msn-fol孵育。孵育1小时后，将细胞洗涤，收集在磷酸盐缓冲液盐水(pbs，invitrogen，意大利)中，并以14,000rpm离心。然后立即将得到的小球在带有3％戊二醛的pbs(ph7.4)中固定2小时，然后再转移到3％的四氧化锇溶液中达另外2小时，经丙酮梯度脱水，最后嵌入araldite中(fluka，buchs，瑞士)。使用切片机，在300目铜网格上分层得到超薄切片，将其与柠檬酸铅和乙酸铀酰对比，然后使用“zeissem900”电子显微镜观察。

细胞活力实验

使用台盼蓝排除法评估与硼替佐米(btz)缀合的msn对细胞增殖的效应，台盼蓝是能够穿透受损细胞或死细胞膜(排除在计数外)但不穿透完整细胞的膜(计数)的染色剂。然后将指数生长阶段的细胞接种到12孔多孔中的培养基中，量为10⁵个细胞/孔，并允许生长过夜。在第二天，将细胞在无血清培养基(sfm)中同步，以获得在循环中处于相同阶段的细胞群体，从而避免细胞之间生长的差异。24小时后将3μg/10⁵个msn-fol、msn-fol/gps和msn-fol/gps-btz细胞加入细胞达1小时；然后用新鲜培养基替换原培养基，向其中加入5％的fbs，并通过胰蛋白酶消化在1、2或3天后收获细胞，并在0.5％的台盼蓝溶液中在环境温度孵育10分钟。通过使用血细胞计数器(burker，brand，德国)对未染色的细胞(活细胞)进行计数来显微测定细胞活力。