高品质iPS细胞的制造方法与流程
本发明涉及ips细胞的品质改善剂、ips细胞的制造方法、通过该制造方法制造的ips细胞、以及ips细胞制造用组合物。
背景技术：
ips(inducedpluripotentstem)细胞(也被称为“人工多能性干细胞”或“诱导多能性干细胞”。)能够通过导入oct3/4、sox2、klf4和c-myc而由体细胞产生(非专利文献1、专利文献1)。这可以通过对亲本细胞的转录网络和表观遗传标记(epigeneticsignature)进行重新编程来实现。ips细胞在基础研究、药品革新和再生医疗中也带来各种利益。可是，生成的ips细胞的细胞组与胚性干细胞(es细胞)细胞组相比品质不均一(heterogeneousquality)，这仍然是个严重的问题。例如，就es细胞的情况而言，各个细胞性质的差异小，大体上任何细胞都能分化成目标细胞，而ips细胞各个细胞性质的差异大，常有细胞不能分化成目标细胞。任何ips细胞均显示无差异的高品质对于基础研究和临床目的是重要的。
为了解决ips细胞的细胞组品质不均一的问题，进行了大量的尝试。例如专利文献2中记载了如下内容：如果将规定量的oct3/4基因、klf4基因、c-myc基因和sox2基因在体细胞中导入规定次数，则能够提高ips细胞的制造效率和稳定性。此外，专利文献3中记载了如下内容：通过在oct3/4基因及其基因产物、sox2基因及其基因产物、klf4基因及其基因产物和c-myc基因及其基因产物的基础上，将prdm14基因及其基因产物、esrrb基因及其基因产物、以及sall4a基因及其基因产物导入体细胞，能够有效地在短时间内制造品质方面优异的人工多能性干细胞(ips细胞)。进而，专利文献4中记载了如下内容：通过在oct3/4基因及其基因产物、sox2基因及其基因产物、klf4基因及其基因产物和c-myc基因及其基因产物的基础上将jarid2突变体基因及其基因产物导入体细胞，能够有效地在短时间内制造品质方面优异的人工多能性干细胞(ips细胞)。可是，ips细胞的品质仍有改善的余地。因此，需要开发品质更高且品质差异更小的ips细胞的制造方法。
另外，为了使连接组蛋白h1家族与连接dna结合而控制基因表达，因此使其产生高级染色质结构。连接组蛋白h1家族的成员包括组蛋白h1a、h1b、h1c、h1d、h1e、h1foo、h1x、h1.0、h1t、h1t2、hils1。连接组蛋白家族的大部分成员由使染色质压缩的体细胞连接组蛋白构成。因此，所述结构一般抑制整体基因转录活性(非专利文献2、3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第4183742号公报
专利文献2：日本特开2011-004674号公报
专利文献3：日本特开2014-217344号公报
专利文献4：日本特开2014-217345号公报
非专利文献
非专利文献1：takahashi,k.&yamanaka,s.inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.cell126,663-676(2006)
非专利文献2：steinbach,o.c.,wolffe,a.p.&rupp,r.a.somaticlinkerhistonescauselossofmesodermalcompetenceinxenopus.nature389,395-399(1997)
非专利文献3：hebbar,p.b.&archer,t.k.alteredhistoneh1stoichiometryandanabsenceofnucleosomepositioningontransfecteddna.thejournalofbiologicalchemistry283,4595-4601(2008)
技术实现要素：
发明所要解决的课题
本发明的课题在于，提供ips细胞的品质改善剂、ips细胞的制造方法、通过所述制造方法制造的ips细胞、以及ips细胞制造用组合物。
用于解决课题的方法
为了改善ips细胞的品质，本发明人等进行了深入研究，结果发现，在将核重编程物质导入体细胞而制造ips细胞的方法中，如果不仅将核重编程物质，而且将“h1foo基因或其基因产物”导入体细胞，则能够制造品质更高而且品质差异更小的ips细胞，从而完成了本发明。通过将“h1foo基因或其基因产物”与核重编程物质并用，能够制造品质更高而且品质差异更小的ips细胞，这对本领域技术人员而言是意料之外的。
即，本发明提供：
(1)一种ips细胞的品质改善剂，其特征在于，包含h1foo基因或其基因产物；
(2)上述(1)中记载的ips细胞的品质改善剂，其特征在于，包含含有h1foo基因的表达载体。
此外，本发明还提供：
(3)一种ips细胞的制造方法，其特征在于，包括将(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物导入体细胞的工序；
(4)上述(3)中记载的ips细胞的制造方法，核重编程物质包括选自由oct基因家族基因、sox基因家族基因、klf基因家族基因、myc基因家族基因、lin基因家族基因、和nanog基因、以及它们的基因产物组成的组的至少一种；
(5)上述(3)或(4)中记载的ips细胞的制造方法，核重编程物质包括oct基因家族基因或其基因产物、sox基因家族基因或其基因产物、以及klf基因家族基因或其基因产物；
(6)上述(3)～(5)中任一项记载的ips细胞的制造方法，核重编程物质包括oct3/4基因或其基因产物、sox2基因或其基因产物、以及klf4基因或其基因产物；
(7)上述(3)～(5)中任一项记载的ips细胞的制造方法，核重编程物质包括oct3/4基因或其基因产物、sox2基因或其基因产物、klf4基因或其基因产物、以及l-myc基因或其基因产物。
进而，本发明还提供：
(8)一种ips细胞，其通过上述(1)～(7)中任一项记载的ips细胞的制造方法制造；
(9)一种ips细胞制造用组合物，其特征在于，包含(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物。
发明效果
本发明能够提供ips细胞的品质改善剂、ips细胞的制造方法、通过所述制造方法制造的ips细胞、以及ips细胞制造用组合物。根据本发明，能够制造品质更高而且品质差异更小的ips细胞。
附图说明
图1为利用显微镜得到的表达外源性(小鼠)h1foo的c57bl/6j小鼠尾部成纤维细胞(以下简称为“小鼠成纤维细胞”)的图像。图1a的“bf”、“dapi”、“h1foo”和“merge”图像分别表示相位差图像、dapi荧光染色图像、h1foo荧光染色图像和将前述3种图像重合而得的图像。图1b左右的图像分别表示h1foo荧光染色2维和2.5维图像。图1c左右的图像分别表示对照细胞(小鼠成纤维细胞)和表达外源性h1foo的小鼠成纤维细胞的电子显微镜图像。
图2中，图2a为表示将3种核重编程物质(小鼠oct3/4、sox2和klf4基因[osk基因])、osk基因和连接组蛋白h1基因(osk+h1c基因)、或osk基因和h1foo基因(osk+h1foo基因)导入小鼠成纤维细胞，分析alp阳性es样细胞(ips细胞)集落形成效率而得的结果的图；图2b为表示分析导入osk基因或osk+h1foo基因而产生的ips细胞(以下分别称为“osk-ips细胞”和“osk+h1foo-ips细胞”)中3种多能性标志物(oct3/4、nanog和ssea1)的表达而得的结果的图；图2c表示分析导入osk基因、或osk基因、和c-myc基因(oskm基因)后第1～5天内源性h1foo的表达而得的结果的图，图2c中的“mef+h1foo”表示分析导入h1foo基因的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)而得的结果。
图3为表示将oskm基因、oskm基因和h1foo基因(oskm+h1foo基因)、osk基因、或osk+h1foo基因导入表达nanog-gfp的成纤维细胞，分析nanog-gfp阳性es样细胞(ips细胞)的比例而得的结果的图。
图4中，图4a为表示在osk+h1foo-ips细胞与es细胞之间比较全基因转录组图谱而得的结果的图；图4b为表示在osk+h1foo-ips细胞与osk-ips细胞之间比较全基因转录组图谱而得的结果的图。
图5为分析osk-ips细胞和osk+h1foo-ips细胞的ig-dmr(图5a)、和gtl2-dmr(图5b)的dna甲基化水平而得的结果的图。图中的“es”和“mef”分别表示分析es细胞和mef细胞而得的结果。
图6为表示分析由osk-ips细胞和osk+h1foo-ips细胞形成的胚胎样体(eb)的形态而得的结果的图。
图7为表示分析由osk-ips细胞和osk+h1foo-ips细胞形成的eb的凋亡细胞的比例而得的结果的图。
图8为表示分析由osk-ips细胞和osk+h1foo-ips细胞形成的eb中两种细胞增殖标志物(ki67和pcna)的表达而得的结果的图。
图9为表示分析osk-ips细胞和osk+h1foo-ips细胞的嵌合体形成能力而得的结果的图。
图10为表示分析来自osk-ips细胞和osk+h1foo-ips细胞的嵌合小鼠的生殖系统转移能力而得的结果的图。
图11为表示oskl+h1foo-ips细胞(导入oct3/4、sox2、klf4、l-myc和h1foo基因而产生的ips细胞)和oskl-ips细胞(导入oct3/4、sox2、klf4和l-myc基因而产生的ips细胞)中，对srf基因(图11a)、actg2基因(图11b)进行定量rt-pcr分析而得的结果的图。图中横轴1～4的数值表示克隆编号。
图12为表示oskl+h1foo-ips细胞和oskl-ips细胞中，对oct3/4基因进行定量rt-pcr分析而得的结果的图。图中横轴1～4的数值表示克隆编号。
图13为表示对oskl+h1foo-ips细胞和oskl-ips细胞分化诱导培养，在5天时间时的细胞存活数的图。图中横轴1～4的数值表示克隆编号。
图14为表示对oskl+h1foo-ips细胞和oskl-ips细胞分化诱导培养，在5天时间时对oct3/4基因进行定量rt-pcr分析而得的结果的图。图中横轴1～4的数值表示克隆编号。
具体实施方式
1.ips细胞的制造方法
本发明的ips细胞的制造方法至少包括将(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物导入体细胞的工序(以下也简单地表示为“导入工序”。)，根据需要，可以进一步包括其他工序。
＜导入工序＞
上述导入工序为至少将(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物导入体细胞的工序。通过不仅将核重编程物质、而且将h1foo基因或其基因产物导入体细胞，能够更多地制造品质高的ips细胞。本说明书中，基因产物是指由基因转录的mrna(信使rna)和/或由该mrna翻译的蛋白质。此外，上述h1foo基因是指编码h1foo蛋白质的多核苷酸。其中，h1foo基因或其基因产物能够用作ips细胞的品质改善剂。此外，包含后述h1foo基因的载体也能够用作ips细胞的品质改善剂。
(h1foo基因)
作为上述h1foo基因的来源没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如人、小鼠、大鼠、牛、羊、马、猴子等任意哺乳动物。上述h1foo基因的序列信息可以由公知的数据库获得，例如，genbank中，可通过登录号bc047943(人)、ay158091(人)、bc137916(小鼠)获得。将人h1foo基因(bc047943)的核苷酸序列示于序列编号1，将人h1foo蛋白质(bc047943的h1foo基因编码的蛋白质)的氨基酸序列示于序列编号2。将人h1foo基因(ay158091)的核苷酸序列示于序列编号59，将人h1foo蛋白质(ay158091的h1foo基因编码的蛋白质)的氨基酸序列示于序列编号60。此外，将小鼠h1foo基因(bc137916)的核苷酸序列示于序列编号3，将小鼠h1foo蛋白质(bc137916的h1foo基因编码的蛋白质)的氨基酸序列示于序列编号4。
上述h1foo基因的核苷酸序列、其mrna的核苷酸序列可以与野生型h1foo基因的核苷酸序列、其mrna的核苷酸序列相同，也可以包含突变。作为包含所述突变的核苷酸序列，可列举：“野生型h1foo基因的核苷酸序列(例如序列编号1或59或3所示的核苷酸序列)或其mrna的核苷酸序列中1～30个、优选为1～20个、更优选为1～15个、进一步优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个核苷酸缺失、替换、插入或添加的核苷酸序列，其编码具有h1foo活性的蛋白质”、“翻译成蛋白质的部分的核苷酸序列中，与野生型h1foo基因的核苷酸序列(例如序列编号1或59或3所示的核苷酸序列)或其mrna的核苷酸序列的序列相同性为70％以上、优选为80％以上、更优选为85％以上、进一步优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上的核苷酸序列，其编码具有h1foo活性的蛋白质”等。
上述h1foo蛋白质的氨基酸序列可以与野生型h1foo蛋白质的氨基酸序列(例如序列编号2或60或4所示的氨基酸序列)相同，也可以包含突变。作为包含所述突变的蛋白质，可列举：“在野生型h1foo蛋白质的氨基酸序列(例如序列编号2或60或4所示的氨基酸序列)中，由通过缺失、替换、插入或添加1～30个、优选为1～20个、更优选为1～15个、进一步优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个氨基酸得到的氨基酸序列构成，且具有h1foo活性的蛋白质”、“包含与野生型h1foo蛋白质的氨基酸序列(例如序列编号2或60或4所示的氨基酸序列)的序列相同性为70％以上、优选为80％以上、更优选为85％以上、进一步优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上的氨基酸序列，且具有h1foo活性的蛋白质”。本说明书中，“具有h1foo活性的蛋白质”是指，在与核重编程物质一起导入体细胞的情况下，与仅将该核重编程物质导入体细胞的情况相比，能够更多地制造品质高的ips细胞的蛋白质。
(核重编程物质)
本说明书中，“核重编程物质”是指，能够通过将该物质单独、或将该物质与其他物质的组合导入体细胞的细胞内，将体细胞诱导成ips细胞的物质(组)。作为所述核重编程物质，只要是能够由体细胞诱导出ips细胞的物质(组)，则可以为基因(包括插入于表达载体的形态)或其基因产物、或者低分子化合物等任何物质。作为核重编程物质的基因是指，编码作为核重编程物质的蛋白质的多核苷酸。核重编程物质为基因或其基因产物的情况下，可以列举选自由oct基因家族基因、sox基因家族基因、klf基因家族基因、myc基因家族基因、lin基因家族基因和nanog基因、以及它们的基因产物组成的组的至少一种(wo2007/69666；日本专利第5696282号；science,2007,318:1917-1920)，其中，优选列举从所述组中选择的2个以上，更优选列举3个以上，此外，优选列举在从所述组中选择的2～4个的范围内，更优选列举3个或4个。以下列举这些家族基因及其组合的具体例子。其中，以下虽然仅记载了基因的名称，但也包括使用其基因产物的情况。
(a)包括oct基因家族基因的一种核重编程物质；
(b)包括oct基因家族基因和sox基因家族基因的两种核重编程物质的组合；
(c)包括oct基因家族基因和klf基因家族基因的两种核重编程物质的组合；
(d)包括oct基因家族基因和nanog基因的两种核重编程物质的组合；
(e)包括oct基因家族基因、sox基因家族基因和klf基因家族基因的3种核重编程物质的组合；
(f)包括oct基因家族基因、klf基因家族基因和myc基因家族基因的3种核重编程物质的组合。
(g)包括oct基因家族基因、sox基因家族基因、klf基因家族基因和myc基因家族基因的4种核重编程物质的组合；以及
(h)包括oct基因家族基因、sox基因家族基因、lin基因家族基因和nanog基因的4种核重编程物质的组合；
或者，也可以为在上述(a)～(h)中的任意核重编程物质或其组合中进一步追加其他核重编程物质(基因或其基因产物)的组合。具体记载如下：
(a’)包含由oct基因家族基因组成的一种核重编程物质的核重编程物质的组合；
(b’)包含由oct基因家族基因和sox基因家族基因组成的两种核重编程物质的核重编程物质的组合；
(c’)包含由oct基因家族基因和klf基因家族基因组成的两种核重编程物质的核重编程物质的组合；
(d’)包含由oct基因家族基因和nanog基因组成的两种核重编程物质的核重编程物质的组合；
(e’)包含由oct基因家族基因、sox基因家族基因和klf基因家族基因组成的3种核重编程物质的核重编程物质的组合；
(f’)包含由oct基因家族基因、klf基因家族基因和myc基因家族基因组成的3种核重编程物质的核重编程物质的组合。
(g’)包含由oct基因家族基因、sox基因家族基因、klf基因家族基因和myc基因家族基因组成的4种核重编程物质的核重编程物质的组合；以及
(h’)包含由oct基因家族基因、sox基因家族基因、lin基因家族基因、和nanog基因组成的4种核重编程物质的核重编程物质的组合；
更具体而言，例示以下的组合，但不限定于这些组合。
(1)oct3/4基因、klf4基因、c-myc基因；
(2)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因(这里，sox2基因可以用sox1基因、sox3基因、sox15基因、sox17基因或sox18基因替换。此外，klf4基因可以用klf1基因、klf2基因或klf5基因替换。进而，c-myc基因可以用t58a(活性型突变体)基因、n-myc基因、l-myc基因替换。)；
(3)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因、fbx15基因、nanog基因、eras基因、ecat15-2基因、tcli基因、β-catenin(活性型突变体s33y)；
(4)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因、htert基因、sv40largetantigen(以下的sv40lt)基因；
(5)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因、htert基因、hpv16e6基因；
(6)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因、htert基因、hpv16e7基因；
(7)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因、htert基因、hpv6e6基因、hpv16e7基因；
(8)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因、htert基因、bmil基因；
(关于上述(1)～(8)的组合，参照wo2007/069666(其中，关于上述(2)的组合中，由sox2基因向sox18基因的替换、由klf4基因向klf1基因或klf5基因的替换，参照naturebiotechnology,26,101-106(2008))。关于“oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因”的组合，也参照cell,126,663-676(2006)；cell,131,861-872(2007)等。关于“oct3/4基因、sox2基因、klf2(或klf5)基因、c-myc基因”的组合，也参照nat.cellbiol.,11,197-203(2009)。关于“oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因、htert基因、sv40lt基因”的组合，也参照nature,451,141-146(2008)。)
(9)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因(参照naturebiotechnology,26,101-106(2008))；
(10)oct3/4基因、sox2基因、nanog基因、lin28基因(参照science,318,1917-1920(2007))；
(11)oct3/4基因、sox2基因、nanog基因、lin28基因、htert基因、sv40lt基因(参照stemcells,26,1998-2005(2008))；
(12)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因、nanog基因、lin28基因(参照cellresearch(2008)600-603)；
(13)oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因、sv40lt基因(也参照stemcells,26,1998-2005(2008))；
(14)oct3/4基因、klf4基因(参照nature454:646-650(2008)；cellstemcell,2:525-528(2008)))；
(15)oct3/4基因、c-myc基因(参照nature454:646-650(2008))；
(16)oct3/4基因、sox2基因(参照nature,451,141-146(2008)；wo2008/118820)；
(17)oct3/4基因、sox2基因、nanog基因(参照wo2008/118820)；
(18)oct3/4基因、sox2基因、lin28基因(参照wo2008/118820)；
(19)oct3/4基因、sox2基因、c-myc基因、esrrb基因(这里，essrrb基因可以用esrrg基因替换。参照nat.cellbiol.,11,197-203(2009))；
(20)oct3/4基因、sox2基因、esrrb基因(参照nat.cellbiol.,11,197-203(2009))；
(21)oct3/4基因、klf4基因、l-myc基因；
(22)oct3/4基因、nanog基因；
(23)oct3/4基因；
(24)oct3/4基因、klf4基因、c-myc基因、sox2基因、nanog基因、lin28基因、sv40lt基因(参照science,324:797-801(2009))；
上述(1)～(24)的组合中，也可以使用其他oct基因家族的成员基因(例如oct1a、oct6等)代替oct3/4基因。此外，也可以使用其他sox基因家族的成员基因(例如sox7基因等)代替sox2基因(或sox1基因、sox3基因、sox15基因、sox17基因、sox18基因)。进而，也可以使用其他lin基因家族的成员基因(例如lin28b基因等)代替lin28基因。
此外，虽然不是上述(1)～(24)任意组合本身，但包括上述(1)～(24)中任一项的全部构成要素、且进一步包括任意的其他物质(优选为其他核重编程物质)的组合也可包括在本发明中的“核重编程物质”范畴。此外，作为核重编程对象的体细胞处于上述(1)～(24)的组合的任意项中构成要素的一部分以足以用于核重编程的水平内源性表达的条件下，除了该构成要素以外剩下的构成要素的组合也可包括在本发明中的“核重编程物质”范畴。
进一步地，在上述核重编程物质的基础上，还可以组合选自由fbx15基因、eras基因、ecat15-2基因、tcl1基因和β-catenin基因组成的组的一种以上的核重编程物质，并且/或者也可以组合选自由ecat1基因、esg1基因、dnmt3l基因、ecat8基因、gdf3基因、mybl2基因、ecat15-1基因、fthl17基因、sall4基因、rex1基因、utf1基因、stella基因、stat3基因和grb2基因组成的组的一种以上的核重编程物质。关于这些组合，wo2007/69666中有具体说明。
优选的是，作为核重编程物质，列举选自由oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、c-myc基因(或l-myc基因)、lin28基因和nanog基因、以及它们的基因产物组成的组的至少1个、优选为2个以上、更优选为3个以上作为优选核重编程物质的例子。特别优选的是，作为核重编程物质的组合，可以列举(1)oct3/4基因或其基因产物、sox2基因或其基因产物、以及klf4基因或其基因产物、(2)oct3/4基因或其基因产物、sox2基因或其基因产物、klf4基因或其基因产物、以及c-myc基因或其基因产物、(3)oct3/4基因或其基因产物、sox2基因或其基因产物、klf4基因或其基因产物、以及l-myc基因或其基因产物，其中，可以优选列举oct3/4基因或其基因产物、sox2基因或其基因产物、以及klf4基因或其基因产物的组合、oct3/4基因或其基因产物、sox2基因或其基因产物、klf4基因或其基因产物、以及l-myc基因或其基因产物的组合，其中，可以更优选列举oct3/4基因、sox2基因、以及klf4基因的组合、oct3/4基因、sox2基因、klf4基因、以及l-myc基因的组合。
作为本发明中使用的核重编程物质的一种，可以使用c-myc基因或其基因产物，但优选不使用c-myc基因或其基因产物。因为有报告称，c-myc降低nanog-gfp阳性集落的比例，增加细胞的致癌性(nakagawa,m.,等generationofinducedpluripotentstemcellswithoutmycfrommouseandhumanfibroblasts.naturebiotechnology26,101-106(2008))。
核重编程物质为基因或其基因产物的情况下，作为所述基因的来源没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如人、小鼠、大鼠、牛、羊、马、猴子等任意哺乳动物。
上述各核重编程物质中小鼠和人cdna序列信息可以通过参照wo2007/069666中记载的genbank登录号来取得。其中，nanog基因在该公报中以“ecat4”的名称记载。此外，将上述各核重编程物质中特别优选的3个基因(oct3/4基因、sox2基因、klf4基因)的小鼠和人cdna序列信息如下再次记载。
其中，将人oct3/4基因的cdna序列示于序列编号47，将人oct3/4蛋白质的氨基酸序列示于序列编号48，将人sox2基因的cdna序列示于序列编号49，将人sox2蛋白质的氨基酸序列示于序列编号50，将人klf4基因的cdna序列示于序列编号51，将人klf4蛋白质的氨基酸序列示于序列编号52，将人l-myc基因的cdna序列示于序列编号53，将人l-myc蛋白质的氨基酸序列示于序列编号54。
此外，上述各核重编程物质中，将wo2007/069666中未记载genbank登录号的基因的小鼠和人cdna序列信息记载如下。
本领域技术人员能够基于上述各核重编程物质的小鼠和人cdna序列信息，容易地分离到这些核重编程物质的cdna。
核重编程物质为上述各基因或其mrna的情况下，关于它们的核苷酸序列，只要不损害本发明的效果就没有特别限制，可以仅为上述各基因的各核苷酸序列中翻译成蛋白质的部分，也可以包含除此之外的部分。此外，上述各基因的核苷酸序列、其mrna的核苷酸序列可以与野生型上述各基因的核苷酸序列、其mrna的核苷酸序列相同，也可以包含突变。作为包含所述突变的核苷酸序列，可列举：“野生型上述各基因的核苷酸序列或其mrna的核苷酸序列中1～30个、优选为1～20个、更优选为1～15个、进一步优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个核苷酸缺失、替换、插入或添加的核苷酸序列，且其编码具有前述基因的基因产物的核重编程作用的蛋白质”、“翻译成蛋白质的部分的核苷酸序列中，与野生型上述各基因的核苷酸序列或其mrna的核苷酸序列的序列相同性为70％以上、优选为80％以上、更优选为85％以上、进一步优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上的核苷酸序列，且其编码具有前述基因的基因产物的核重编程作用的蛋白质的”等。
核重编程物质为由上述各基因编码的蛋白质(即由从上述各基因转录的mrna翻译的蛋白质)的情况下，它们的氨基酸序列可以与由野生型上述各基因编码的蛋白质相同，也可以包含突变。作为包含所述突变的蛋白质，可列举：“在野生型上述各基因编码的蛋白质的氨基酸序列中，由通过缺失、替换、插入或添加1～30个、优选为1～20个、更优选为1～15个、进一步优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个氨基酸得到的氨基酸序列构成，且具有核重编程作用的蛋白质”、“包含与野生型上述各基因编码的蛋白质的氨基酸序列的序列相同性为70％以上、优选为80％以上、更优选为85％以上、进一步优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上的氨基酸序列，且具有核重编程作用的蛋白质”。
(体细胞)
作为上述体细胞没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如胚胎期的体细胞、成熟的体细胞等。作为上述成熟的体细胞的具体例子，可列举：间充质系统干细胞、造血干细胞、脂肪组织来源的基质细胞、脂肪组织来源的基质干细胞、神经干细胞、精原干细胞等组织干细胞(体性干细胞)，组织前体细胞，成纤维细胞、上皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞等已分化的细胞等。
作为上述体细胞来自的生物物种没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如人、小鼠、大鼠、牛、羊、马、猴子等任意哺乳动物。此外，上述体细胞来自的生物物种与导入该体细胞的基因来自的生物物种可以不同，但优选为相同。
作为取得上述体细胞的个体没有特别限制，可以根据目的适当选择，将得到的ips细胞用于再生医疗用途的情况下，从排异反应的观点出发，优选个体本身、或mhc型相同或实质上相同的其他个体。这里，上述mhc型实质上相同是指mhc型一致到下述程度：通过使用免疫抑制剂等，在将从上述体细胞来源的ips细胞分化诱导而得到的细胞移植至个体的情况下，移植细胞能够植入。
为了使ips细胞容易选择，上述体细胞可以为重组细胞。作为上述重组体细胞的具体例子，可列举在分化多能性细胞中特异性高表达的基因的基因座上插入了标记基因和抗药性基因中的至少任一个的重组体细胞。作为在上述分化多能性细胞中特异性高表达的基因，可列举例如fbx15基因、nanog基因、oct3/4基因等。作为上述标记基因，可列举例如绿色荧光蛋白(gfp)基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因等。作为上述抗药性基因，可列举杀稻瘟素基因、潮霉素基因、嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因等。
作为上述体细胞的培养条件没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如培养温度约37℃、co2浓度约2％～5％等。作为上述体细胞的培养中使用的培养基没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如含有5质量％～20质量％血清的最低基础培养基(mem)、达尔伯克改良培养基(dmem)、rpmi1640培养基、199培养基、f12培养基等。
(将(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物导入体细胞的方法)
作为将(a)核重编程物质、(b)h1foo基因或其基因产物导入体细胞的方法没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如使用表达载体的方法、使用mrna的方法、使用重组蛋白质的方法等。考虑到导入体细胞的容易性，与以蛋白质的形态导入体细胞相比，核重编程物质较优选以基因的形态、该基因的mrna的形态导入体细胞，更优选以基因的形态导入体细胞。所述基因可以为dna也可以为rna，或者也可以为dna/rna嵌合体，从稳定性的观点出发，优选为dna。此外，该基因可以为双链也可以为单链，优选为双链。优选列举上述各基因的cdna作为核重编程物质，其中，优选列举上述各基因的双链cdna。
同样地，考虑到导入体细胞的容易性，与以蛋白质的形态导入体细胞相比，“h1foo基因或其基因产物”较优选以基因的形态、该基因的mrna的形态导入体细胞，更优选以基因的形态导入体细胞。所述h1foo基因可以为dna也可以为rna，或者也可以为dna/rna嵌合体，从稳定性的观点出发，优选为dna。此外，所述h1foo基因可以为双链也可以为单链，优选为双链。作为“h1foo基因或其基因产物”的优选方式，可列举h1foo基因的cdna，其中，优选列举h1foo基因的双链cdna。
(表达载体)
将核重编程物质以基因的形态导入体细胞的情况下、或者将h1foo基因导入体细胞的情况下，可以适当使用在包含能够在作为宿主的体细胞中发挥功能的启动子的合适的表达载体中插入了核重编程物质、h1foo基因的表达载体。作为用于插入核重编程物质、h1foo基因的表达载体没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如游离载体、人工染色体载体、质粒载体、病毒载体等。
作为上述表达载体中使用的启动子，可列举例如srα启动子、sv40早期启动子、逆转录病毒的ltr、cmv(巨细胞病毒)启动子、rsv(劳斯肉瘤病毒)启动子、hsv-tk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子、ef1α启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子等。此外，也可以将人cmv的ie基因增强子与启动子一起使用。作为一个例子，可以使用cag启动子(包括巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和β-球蛋白基因的多聚a信号部位)。
除了启动子以外，上述表达载体还可以根据期望含有增强子、多聚a添加信号、标记基因、复制起点、编码结合于复制起点而控制复制的蛋白质的基因等。上述标记基因是指能够通过将该标记基因导入细胞来进行细胞的筛选、选择的那样的基因。作为上述标记基因的具体例子，可列举抗药性基因、荧光蛋白基因、发光酶基因、显色酶基因等。它们可以单独使用一种，也可以并用两种以上。作为上述抗药性基因的具体例子，可列举新霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等。作为上述荧光蛋白基因的具体例子，可列举绿色荧光蛋白(gfp)基因、黄色荧光蛋白(yfp)基因、红色荧光蛋白(rfp)基因等。作为上述发光酶基因的具体例子，可列举荧光素酶基因等。作为上述显色酶基因的具体例子，可列举β半乳糖苷酶基因、β葡萄糖酸醛酶基因、碱性磷酸酶基因等。
上述游离载体是能够在染色体外自主复制的载体。使用游离载体的具体方法已在yu等,science,324,797-801(2009)中公开。本发明的一个特别优选实施方式中，可使用在游离载体的复制所必需的载体要素的5’侧和3’侧同向配置有loxp序列的游离载体。游离载体能够在染色体外自主复制，因此，即使不重组入基因组，也能够提供宿主细胞内的稳定表达，一旦ips细胞建立后，希望该载体被迅速除去。通过将游离载体的复制所必需的载体要素夹在2个loxp序列间，使cre重组酶作用于此而将该载体要素切出，能够使游离载体的自主复制能力丧失，能够使该载体在早期从ips细胞脱落。
作为本发明所使用的游离载体，可列举例如包含来源于ebv、sv40等的自主复制所必需的序列作为载体要素的载体。具体而言，作为自主复制所必需的载体要素，可列举复制起点和编码结合于复制起点而控制复制的蛋白质的基因，例如ebv中为复制起点orip和ebna-1基因，sv40中为复制起点ori和sv40lt基因。
此外，作为上述人工染色体载体，可列举yac(yeastartificialchromosome)载体、bac(bacterialartificialchromosome)载体、pac(p1-derivedartificialchromosome)载体等。
此外，作为上述质粒载体，只要是能够在导入的体细胞内表达的质粒载体就没有特别限制，体细胞为哺乳动物的情况下，可列举pa1-11、pxt1、prc/cmv、prc/rsv、pcdnai/neo等动物细胞表达用质粒载体。
作为上述病毒载体，可列举逆转录病毒(包括慢病毒)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、仙台病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、痘病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、西尔维斯病毒载体、弹状病毒载体、副粘病毒载体、正粘病毒载体等。
作为将上述表达载体导入上述体细胞的方法没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如脂质体转染法、显微注射法、deae葡聚糖法、基因枪法、电穿孔法、磷酸钙法等。
其中，使用病毒载体作为导入体细胞的表达载体的情况下，可以使用利用包装细胞得到的病毒粒子。所述包装细胞是导入了编码病毒的结构蛋白的基因的细胞，如果在该细胞中导入插入有目的基因的重组病毒载体，则产生了插入有该目的基因的重组病毒粒子。作为上述包装细胞没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如以人肾脏来源的hek293细胞、小鼠成纤维细胞来源的nih3t3细胞为基础的包装细胞、以表达ecotropicvirus来源包膜糖蛋白的方式设计的plat-e细胞、以表达amphotropicvirus来源包膜糖蛋白的方式设计的plat-a细胞、以表达水疱性口内炎病毒来源包膜糖蛋白的方式设计的plat-gp细胞等。其中，对人体细胞导入重组病毒载体的情况下，在宿主靶向性这点上，优选plat-a细胞、plat-gp细胞。作为病毒载体导入上述包装细胞的方法没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如脂质体转染法、电穿孔法、磷酸钙法等。作为用得到的病毒粒子感染体细胞的方法没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如聚凝胺法。
使用上述表达载体将核重编程物质、h1foo基因导入体细胞的情况下，可以在1个表达载体中插入1个基因，也可以插入2个以上基因。通过在1个载体中插入2个以上基因，能够使这2个以上基因同时表达(以下有时称为“共表达”)。此外，也可以将导入体细胞的所有核重编程物质和h1foo基因插入至1个表达载体。
作为在上述1个载体中插入2个以上基因的方法没有特别限制，可以根据目的适当选择，优选将上述2个以上基因通过连接序列插入。作为所述连接序列没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如编码口蹄疫病毒(picornaviridaeaphthovirus)来源2a肽的基因序列、ires(internalribosomeentrysites)等。
本发明的ips细胞的制造方法中，可以将(a)核重编程物质和(b)h1foo基因的基因产物以mrna的形态导入体细胞。作为将上述mrna(信使rna)导入上述体细胞的方法没有特别限制，可以适当选择并使用公知的方法。可以使用例如lipofectamine(注册商标)messengermax(lifetechnologies公司制)等市售的rna转染试剂等。
此外，本发明的ips细胞的制造方法中，可以将(a)核重编程物质和(b)h1foo基因的基因产物以蛋白质的形态导入体细胞。作为将所述蛋白质导入前述体细胞的方法没有特别限制，可以适当选择并使用公知的方法。作为这样的方法，可列举例如使用蛋白导入试剂的方法、使用蛋白转导结构域(ptd)融合蛋白的方法、显微注射法等。作为蛋白导入试剂，市售有以阳离子性脂质为基础的biopoter(注册商标)蛋白质转移试剂(proteindeliveryreagent)(genetherapysystmes公司制)和pro-jecttm蛋白质转染试剂(proteintransfectionreagent)(pierce公司制)、以脂质为基础的profect-1(targetingsystems公司制)、以膜透过性肽为基础的penetratinpeptide(qbiogene公司制)和chariotkit(activemotif公司制)、利用了hvj包膜(灭活仙台病毒)的genomone(石原产业公司制)等。导入可以按照这些试剂附带的方案进行，一般步骤如下。可以将蛋白质形态的“(a)核重编程物质”、“(b)h1foo基因的基因产物”在适当的溶剂(例如pbs、hepes等缓冲液)中稀释，加入导入试剂，在室温下孵育5～15分钟左右形成复合体，将其添加至更换为无血清培养基的细胞中，37℃孵育1小时～数小时。其后可以将培养基除去，更换为含血清培养基。
作为上述ptd，开发了使用果蝇来源的antp、hiv来源的tat、hsv来源的vp22等蛋白质的细胞通过结构域的融合蛋白。所述ptd可以是：制作插入了“(a)核重编程物质”、“(b)h1foo基因的基因产物”的cdna和ptd序列的融合蛋白表达载体并重组表达，回收融合蛋白而在导入中使用。除了不添加蛋白导入试剂以外，所述融合蛋白的导入可以与上述同样地进行。
上述显微注射法是使蛋白质溶液进入前端直径1μm左右的玻璃针中，穿刺导入细胞的方法，能够切实地将蛋白质导入细胞内。以前，在小鼠和人中，已开发了将蛋白质形态的核重编程物质与聚精氨酸、tat等cpp(cellpenetratingpeptide)一起导入而建立ips细胞的方法，也可以使用这些方法(cellstemcell,4:381-384(2009))。
本发明的ips细胞的制造方法中，“(a)核重编程物质”和“(b)h1foo基因或其基因产物”在体细胞中的导入次数可以为1次，也可以为2次以上。作为其导入时间没有特别限制，可以根据目的适当选择，可以将导入的“(a)核重编程物质”和“(b)h1foo基因或其基因产物”全部在同一时间导入，也可以将一部分或全部在不同的时间导入。上述“h1foo基因或其基因产物”可以是仅使用基因的形态，也可以是仅使用其基因产物的形态，还可以是使用基因和其基因产物两者的形态。上述核重编程物质为基因或其基因产物的情况下，可以是仅使用基因的形态，也可以是仅使用其基因产物的形态，还可以是使用基因和其基因产物两者的形态。此外，上述核重编程物质为基因或其基因产物，且并用两种以上“基因或其基因产物”的情况下，可以是某基因使用基因产物，其他基因使用基因的形态。
作为h1foo基因或其基因产物在体细胞中的导入量，只要是在将(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物导入体细胞时能够制造品质更高而且品质差异更小的ips细胞就没有特别限制。此外，上述核重编程物质为基因或其基因产物的情况下，作为上述基因或其基因产物在体细胞中的导入量，只要能够使所述体细胞进行核重编程就没有特别限制，可以将所使用的全部基因或其基因产物各等量导入，也可以以不同的量导入。作为基因或其基因产物，以使用基因的情况为例，优选oct3/4基因相对于sox2基因、klf4基因或c-myc基因导入更多量、例如约3倍量(pnas106(31):12759-12764(2009)；j.biol.chem.287(43):36273-36282(2012))。
本发明的ips细胞的制造方法中使用的核重编程物质为低分子化合物的情况下，所述低分子化合物与体细胞的接触可以通过下述方法实施：将该低分子化合物以适当的浓度在水性或非水性溶剂中溶解，在适合体细胞培养的培养基(例如含有约5～20％胎牛血清的最低基础培养基(mem)、达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)、rpmi1640培养基、199培养基、f12培养基等)中添加该低分子化合物溶液，以使该低分子化合物的浓度成为体细胞中足以发生核重编程且未发现细胞毒性的范围，将细胞培养一定时间。作为核重编程物质的低分子化合物的浓度根据该所使用的低分子化合物种类的不同而不同，可以在约0.1nm～约100nm的范围内适当选择。接触时间只要是足以实现细胞的核重编程的时间就没有特别限制，通常与培养基共存直至阳性集落出现。
＜其他工序＞
如上所述，本发明的ips细胞的制造方法至少包括将(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物导入体细胞的工序(“导入工序”)，根据需要可以进一步包括其他工序。作为上述其他工序，只要不损害本发明的效果就没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如对导入了上述(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物的体细胞(以下也简单地表示为“导入细胞”。)进行培养的工序(以下也简单地表示为“导入细胞培养工序”。)等。
(导入细胞培养工序)
上述导入细胞培养工序为对导入了上述(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物的体细胞进行培养的工序。作为上述导入细胞的培养条件没有特别限制，可以列举例如适合es细胞培养的条件。作为所述条件，可列举例如培养温度约37℃、co2浓度约2％～5％等。此外，作为上述导入细胞的培养中使用的培养基没有特别限制，可以根据目的适当选择。为小鼠细胞的情况下，在通常的培养基中添加作为分化抑制因子的leukemiainhibitoryfactor(lif)而进行培养。另一方面，为人细胞的情况下，优选代替lif，添加碱性成纤维细胞增殖因子(bfgf)和/或干细胞因子(scf)。此外，细胞通常在作为饲养细胞的、以放射线、抗生素处理而停止了细胞分裂的小鼠胚胎来源的成纤维细胞(mef)的共存下培养。作为mef，通常使用sto细胞等，ips细胞的诱导中常使用snl细胞(mcmahon,a.p.&bradley,a.cell62,1073-1085(1990))等。与饲养细胞的共培养可以从导入(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物前开始，也可以从该导入时开始，或者从比该导入靠后(例如1～10日后)开始。
作为上述导入细胞培养工序的时间没有特别限制，可以根据目的适当选择。
2.ips细胞
通过上述ips细胞的制造方法制造的本发明的ips细胞具有分化多能性和自主复制能力。前述分化多能性意思是全部三胚层系列均能分化。此外，前述自主复制能力意思是能够在保持未分化状态的情况下增殖的能力。
作为确认通过上述ips细胞的制造方法制造的细胞是否为ips细胞的方法没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，作为上述体细胞，使用在分化多能性细胞中特异性高表达的基因(例如fbx15、nanog、oct3/4等，优选为nanog或oct3/4)的基因座插入了标记基因和抗药性基因的至少任一者的重组体细胞的情况下，可以利用上述标记基因、抗药性基因来确认。具体而言，使用绿色荧光蛋白(gfp)基因作为上述标记基因的情况下，可列举例如利用流式细胞仪确认gfp阳性细胞的方法；此外，使用嘌呤霉素抗性基因作为上述抗药性基因的情况下，可以通过对细胞给予嘌呤霉素来确认。
本申请说明书中“品质高的ips细胞”是指，比除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞品质高的ips细胞。此外，本说明书中“品质差异小的ips细胞”是指，比除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞品质差异小的ips细胞。作为该品质，可以为一种，也可以为两种以上。作为“品质高的ips细胞”或“品质差异小的ips细胞”的具体例子，可列举具有选自以下的(a)～(q)的一种或两种以上特性的ips细胞。
(a)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的“osk-ips细胞”或“oskl-ips细胞”)相比，通过后述[胚胎样体(eb)形成]的方法培养了5天时，胚胎样体形成数按比例提高5％以上、优选提高10％以上的ips细胞。
(b)通过后述[胚胎样体(eb)形成]的方法培养了5天时，胚胎样体形成数为78个以上、优选为80个以上的ips细胞。
(c)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的“osk-ips细胞”或“oskl-ips细胞”)相比，通过后述[胚胎样体(eb)形成]的方法培养了5天时，胚胎样体大小(μm2)的差异(σ2)按比例降低25％以上、优选降低40％以上的ips细胞。
(d)通过后述[胚胎样体(eb)形成]的方法培养了5天时，胚胎样体大小(μm2)的差异(σ2)为10000(μm2)以下、优选为8000(μm2)以下的ips细胞。
(e)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的“osk-ips细胞”或“oskl-ips细胞”)相比，通过后述[凋亡检测]的方法测得的生细胞(膜联蛋白v(-)/pi(-)细胞)的比例提高至1.1倍以上、优选提高至1.2倍以上的ips细胞。
(f)通过后述[凋亡检测]的方法测得的生细胞(膜联蛋白v(-)/pi(-)细胞)的比例为68％以上、优选为73％以上的ips细胞。
(g)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的“osk-ips细胞”或“oskl-ips细胞”)相比，通过后述[凋亡检测]的方法测得的凋亡细胞(膜联蛋白v(+)/pi(-)细胞和膜联蛋白v(+)/pi(+)细胞的合计)的比例降低至0.75倍以下、优选降低至0.67倍以下的ips细胞。
(h)通过后述[凋亡检测]的方法测得的凋亡细胞(膜联蛋白v(+)/pi(-)细胞和膜联蛋白v(+)/pi(+)细胞的合计)的比例为30％以下、优选为25％以下的ips细胞。
(i)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的“osk-ips细胞”或“oskl-ips细胞”)相比，通过后述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法测得的ki67基因或pcna基因(两个基因作为细胞增殖标志物而闻名)的表达量提高至1.7倍、优选提高至2.2倍的ips细胞。
(j)通过后述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法测得的ki67基因或pcna基因(两个基因作为细胞增殖标志物而闻名)的表达量与es细胞相比为0.65倍以上、优选为0.73倍以上的ips细胞。
(k)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的“osk-ips细胞”或“oskl-ips细胞”)相比，嵌合体形成能力高的ips细胞。
(l)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的“osk-ips细胞”或“oskl-ips细胞”)相比，性腺移行能力高的ips细胞。
(m)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的”oskl-ips细胞”或“osk-ips细胞”)相比，通过后述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法测得的srf基因(srf基因作为如果有染色体异常则表达量降低的染色体异常标志物而闻名)的表达量提高至1.1倍、优选提高至1.2倍的ips细胞。
(n)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的“oskl-ips细胞”或“osk-ips细胞”)相比，通过后述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法测得的actg2基因(actg2基因作为如果有染色体异常则表达量降低的染色体异常标志物而闻名)的表达量提高至1.2倍、优选提高至1.5倍的ips细胞。
(o)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的”oskl-ips细胞”或“osk-ips细胞”)相比，通过后述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法测得的oct3/4基因(干细胞的未分化标志物)的表达量差异(σ2)按比例降低10％以上、优选降低20％以上的ips细胞。
(p)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的”oskl-ips细胞”或“osk-ips细胞”)相比，通过后述[分化诱导初期细胞生存率的比较]项目中记载的方法测得的存活细胞数提高至1.2倍、优选提高至1.5倍的ips细胞。
(q)与除了未将h1foo基因或其基因产物导入体细胞以外以相同方法制作的ips细胞(优选为后述实施例中的“oskl-ips细胞”或“osk-ips细胞”)相比，通过后述[ips细胞的分化诱导初期的未分化标志物残余量的比较]项目中记载的方法测得的oct3/4基因(干细胞的未分化标志物)的表达量差异(σ2)按比例降低10％以上、优选降低20％以上的ips细胞。
作为上述ips细胞来自的生物物种没有特别限制，可以根据目的适当选择，可列举例如人、小鼠、大鼠、牛、羊、马、猴子等任意哺乳动物。
3.ips细胞的品质改善剂
本发明的ips细胞的品质改善剂至少含有h1foo基因或其基因产物，根据需要可以进一步含有其他构成。h1foo基因或其基因产物是与上述ips细胞的制造方法中记载的基因或其产物同样的。此外，h1foo基因或其基因产物可以包含与上述ips细胞的制造方法中记载的突变同样的突变。此外，作为h1foo基因，可以使用重组入含有能够在成为宿主的体细胞中发挥功能的启动子的上述表达载体的基因。
4.ips细胞制造用组合物
本发明的ips细胞制造用组合物至少含有(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物，根据需要，可以进一步含有其他构成。
＜(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物＞
上述(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物与在上述ips细胞的制造方法中记载的物质是同样的。此外，h1foo基因或其基因产物、作为核重编程物质的基因或其基因产物可以包含与在上述ips细胞的制造方法中记载的突变同样的突变。
作为上述ips细胞制造用组合物中核重编程物质的优选方式，可列举基因重组于载体中的形态、合成mrna的形态、蛋白质(优选为重组蛋白质)的形态等。作为上述载体，可列举与在上述ips细胞的制造方法中记载的物质同样的物质。上述合成mrna、上述蛋白质(优选为重组蛋白质)可以通过公知的方法来制造。
上述ips细胞制造用组合物中，上述(a)核重编程物质、上述(b)h1foo基因或其基因产物可以是分装在单独的容器中，也可以汇合在1个容器中，还可以按任意的数量汇合在容器中。
作为上述ips细胞制造用组合物中的上述(a)核重编程物质、上述(b)h1foo基因或其基因产物的量没有特别限制，可以将全部核重编程物质、h1foo基因或其基因产物设为等量，也可以设为不同的量。
除了上述(a)核重编程物质、上述(b)h1foo基因或其基因产物以外，上述ips细胞制造用组合物也可以含有它们之外的基因或其基因产物等，此外，使用前述病毒载体的情况下，也可以含有例如包装细胞。作为前述各基因及其基因产物以外的基因及其基因产物、前述包装细胞，可列举与在前述ips细胞的制造方法中记载的同样的物质。
本发明中，作为其他方式，还包括：
“一种ips细胞的品质改善方法，其特征在于，包括将h1foo基因或其基因产物导入体细胞的工序”、
“h1foo基因或其基因产物在ips细胞的品质改善剂的制造中的使用”、
“(a)核重编程物质和(b)h1foo基因或其基因产物在ips细胞制造用组合物的制造中的使用”。
上述“ips细胞的品质改善方法”中，将h1foo基因或其基因产物导入体细胞的工序与本发明的ips细胞的制造方法中的导入工序是相同的。通过包括所述工序，能够改善ips细胞的品质，得到高品质的ips细胞。
以下，通过实施例详细地对本发明进行说明，但本发明不限定于这些实施例。其中，以下的全部实验均按照庆应义塾大学的动物和dna实验指南进行，以被庆应义塾大学伦理委员会承认的、美国国立卫生研究院关于实验动物的管理和使用的指南为基准。
实施例
1.材料和方法
[质粒的构建]
将h1foocdna和h1ccdna(teranishi,t.,等rapidreplacementofsomaticlinkerhistoneswiththeoocyte-specificlinkerhistoneh1fooinnucleartransfer.developmentalbiology266,76-86(2004).)分别插入pmxs质粒的限制酶bamh1-sal1部位和ecor1-sal1部位，通过dna测序，确认h1foocdna和h1ccdna的插入。
[小鼠ips细胞的产生和细胞培养方法]
1)小鼠ips细胞的产生按照文献(takahashi,k.,okita,k.,nakagawa,m.&yamanaka,s.inductionofpluripotentstemcellsfromfibroblastcultures.natureprotocols2,3081-3089(2007))中记载的方案进行。不过，本试验中，在前述文献中记载的基因的基础上，还使用了h1foo基因。即，使用包含小鼠oct3/4、sox2、klf4和h1foo基因(序列编号3的核苷酸序列：bc137916)的pmxs逆转录病毒载体，从小鼠成纤维细胞或nanog-gfp-ires-puro转基因小鼠(okita,k.,ichisaka,t.&yamanaka,s.generationofgermline-competentinducedpluripotentstemcells.nature448,313-317(2007))的尾部成纤维细胞(以下简称为“表达nanog-gfp的成纤维细胞”)产生ips细胞。其中，作为对照，代替h1foo基因，使用dsred基因。此外，实验小鼠的管理按照庆应义塾大学的动物和dna实验指南进行。
2)小鼠es细胞(b6j-23utr)(tanimoto,y.,等embryonicstemcellsderivedfromc57bl/6jandc57bl/6nmice.comparativemedicine58,347-352(2008))从筑波大学动物资源中心获得，按照文部科学省的关于人es细胞的分配和使用的指南进行使用。
3)小鼠ips和es细胞株是，在含有20％knockout血清替代品(knockoutserumreplacement)(gibco公司制)、1mmglutamax(gibco公司制)、1mm非必需氨基酸(西格玛奥德里奇公司制)、0.1mm2-巯基乙醇、50u青霉素、50mg/ml链霉素(gibco公司制)和小鼠白血病阻害因子(lif)的dmem(西格玛奥德里奇公司制)培养液(以下称为“ips细胞培养液”)中，在野生型icr小鼠来源的经x射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞(imef饲养细胞)上培养、保持。其中，小鼠ips细胞培养液每2～3天更换，细胞每2～3天用0.5mm胰蛋白酶-edta(gibco公司制)继代。
[胚胎样体(eb)形成]
ips细胞的eb形成通过下述方法进行：将使用1mg/ml胶原酶iv获取的5×104个ips细胞播种在100mm低粘附板(agc公司制)上，在含有20％fbs(gibco公司制)、2mmglutamax(gibco公司制)、0.1mm非必需氨基酸(西格玛奥德里奇公司制)、0.1mm2-巯基乙醇、50u/ml青霉素和50mg/ml链霉素(gibco公司制)的最小必需培养基α-培养基(minimumessentialmediumalphamedium)(gibco公司制)(以下称为“eb形成用培养液”)存在下培养5天。eb形成用培养液每2～3天更换。其中，作为对照，使用es细胞。
[畸胎瘤形成]
ips细胞的畸胎瘤形成能力是：在使用氯胺酮(50mg/kg)、甲苯噻嗪(10mg/kg)和氯丙嗪(1.25mg/kg)的混合物麻醉处理的scid小鼠(日本clea公司制)的精巢中注入ips细胞，约8周后，通过颈椎脱臼将小鼠处死，将注入了ips细胞的组织切片在10％多聚甲醛(pfa)中固定一夜，包埋在石蜡中后，通过苏木素-伊红(he)染色法确认。其中，小鼠的麻醉处理通过监测小鼠的心率、肌肉松弛和感官反射反应(即对捏尾巴无反应)来适当进行。
[免疫组织化学染色法]
将播种在玻璃底培养皿(agc公司制)上的ips细胞和成纤维细胞用pbs洗涤一次，用4％多聚甲醛(武藤化学公司制)在4℃进行15分钟固定处理。将经固定处理的细胞在pbs中用0.5％tritonx-100在室温下透明处理10分钟。其后，用immunoblock(ds制药生物医药公司制)封闭处理20分钟，在4种一
26attorneyno.:p1a175195pct抗(抗oct3/4抗体[oct3/4抗体sc-8629，圣克鲁斯生物技术公司制]、抗nanog抗体[rcab0001p，reprocell公司制]、抗ssea1抗体[sc-21702，圣克鲁斯生物技术公司制]和抗h1foo抗体[hpa037992，西格玛奥德里奇公司制])存在下，室温孵育60分钟，用immunoblock(ds制药生物医药公司制)洗涤，与针对各一抗的二抗(与alexafluor488或alexafluor568[lifetechnologies公司制]偶联的抗兔igg抗体和抗小鼠igg或igm抗体)在室温下孵育60分钟，用6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，lifetechnologies公司制)对细胞核进行染色后，使用具备彩色电荷耦合器件照相机(bz-9000，基恩士公司制)、光学显微镜(ix71，奥林巴斯公司制)和激光共聚焦显微镜(lsm510meta，carlzeiss,jena公司制)的荧光激光显微镜进行荧光观察。
[定量rt-pcr分析]
使用trizol试剂(lifetechnologies公司制)，按照产品附带的说明书，分离总rna试样。rna试样的浓度和纯度用nd-1000分光光度计(赛默飞世尔科技公司制)测定，cdna的制备使用revertraaceqpcrrtmastermix(东洋纺公司制)进行。定量pcr(qt-pcr)使用sybrpremixextaq(宝生物公司制)，利用7500realtimepcrsystem(lifetechnologies公司制)进行。mrna的量根据gapdh的mrna量进行标准化。其中，定量pcr中使用的引物组的核苷酸序列示于以下的表1。
[表1]
[凋亡检测]
对利用eb形成用培养液进行的培养开始后第1天的ips细胞进行胰蛋白酶处理，悬浮于膜联蛋白a5结合缓冲液(宝生物公司制)后，根据产品附带的说明书，用膜联蛋白-a5-fitc和碘化丙啶(pi)(bd公司制)分别对凋亡初期细胞和凋亡后期细胞染色。用70mm孔尼龙膜对细胞进行过滤，使用cellquest软件(bd公司制)，利用facsaria3(bd公司制)流式细胞仪对经荧光染色的细胞进行分析，使用flowjo软件(treestar公司制)测定凋亡细胞的比例。
[dna甲基化分析]
为了使用亚硫酸盐测序(bisulfitesequence)法分析oct3/4和nanog基因的启动子区域中dna的甲基化水平，使用sv基因组dna纯化试剂盒(promega公司制)从细胞试样分离、纯化基因组dna。使用ezdna甲基化黄金试剂盒(zymoresearch公司制)，按照产品附带的说明书将纯化的基因组dna中的非甲基化胞嘧啶(c)替换为尿嘧啶(u)，制备亚硫酸盐pcr用输入dna。使用所述输入dna、引物组和takaraepitaqhs(takara公司制)，在pcr反应条件(98℃10分钟的变性处理：1循环；95℃20秒，55℃30秒、以及72℃60秒的扩增处理：40循环；以及72℃5分钟的最终延伸处理：1循环)下进行亚硫酸盐pcr。其中，亚硫酸盐pcr中使用的引物组的核苷酸序列示于以下的表2。
[表2]
pcr产物纯化后ta克隆至pgem-t载体(promega公司制)，进行测序。此外，为了分析位于dlk1和dlk2基因之间的基因间差异甲基化区域(differentiallymethylatedregion；dmr)(ig-dmr)和gtl2差异甲基化区域(gtl2-dmr)的甲基化状态，如上所述纯化基因组dna，制备亚硫酸盐pcr用输入dna后，使用pyromarkq24(qiagen公司制)，按照产品附带的说明书进行焦磷酸测序(pyrosequence)。其中，焦磷酸测序中使用的引物组的核苷酸序列示于以下的表3。
[表3]
[es细胞和ips细胞的共培养凝集法]
从过量排卵自然交配的icr(cd-1(注册商标))雌性小鼠回收2细胞期的胚，其后，培养至囊胚期。es细胞和ips细胞在共培养凝集之前用0.25％胰蛋白酶解离，使15～20个细胞与除去透明膜的8细胞期卵裂球凝集。将囊胚期嵌合体胚导入2.5dpc(daysofpost-coitus，交配后天数)的icr假孕小鼠的子宫角。
[全基因表达分析]
从ips细胞和es细胞分离总rna，使用快速扩增标记试剂盒(quickamplabelingkit)(安捷伦科技公司制)扩增花菁标记反义rna，利用基因表达杂交试剂盒，在小鼠全基因组寡核苷酸微阵列(安捷伦科技公司制)上杂交，使用安捷伦微阵列扫描仪进行分析。数据用genespringgx12.0软件(安捷伦科技公司制)进行分析。
[统计分析]
图中带误差线的柱状图的值以平均±标准差(sme)的形式显示。数据使用statviewj-4.5软件进行分析。2个组间的比较通过student’st-test进行。组间的比较通过邦弗洛尼事后检验(bonferroni'sposthoctest)按one-wayanova进行。图中的“＊”和“＊＊”表示有显著性(分别为p＜0.05和p＜0.01)。
2.结果
[使用外源性h1foo基因的ips细胞的产生]
调查h1foo对体细胞重新编程的效果。
首先，进行上述[免疫组织化学染色法]项目中记载的方法，确认外源性h1foo仅在细胞核表达(图1a)、其大量局部存在于核周围(图1b)。其中，未观察到外源性h1foo的表达导致的细胞核的膨胀、核膜内侧电子密度高的区域(异染色质)的减少(图1c)。
接下来，按照上述[小鼠ips细胞的产生和细胞培养方法]项目中记载的方法，在小鼠成纤维细胞中导入3种核重编程物质(oct3/4、sox2和klf4基因[osk基因])的基础上，使用逆转录病毒载体将h1foo基因(osk+h1foo基因)导入体细胞，在第20天使用tracp&alpdouble-stainkit(宝生物公司制)进行alp(alkalinephosphatase)染色，测定alp阳性且由es样细胞组成的集落数。alp作为干细胞标志物而闻名。其中，作为对照，进行下述实验：仅导入osk基因的实验；还有代替osk+h1foo基因中的h1foo，导入连接组蛋白h1基因(osk+h1c基因)的实验。其结果表明，如果将osk+h1foo基因导入小鼠成纤维细胞，则与导入osk基因、osk+h1c基因的情况相比，alp阳性es样细胞(ips细胞)集落数显著增加(图2a)。
此外，按照上述[免疫组织化学染色法]项目中记载的方法，分析3种多能性标志物(oct3/4、nanog和ssea1)的表达，结果显示，osk+h1foo-ips细胞与osk-ips细胞同样表达上述多能性标志物(图2b)。另一方面，内源性h1foo在诱导ips细胞的过程、产生的ips细胞中未确认到表达(图2b、c)。
此外，将osk+h1foo基因导入表达nanog-gfp的成纤维细胞，以gfp信号为指标，调查产生的ips细胞(图3a)的品质。其中，nanog-gfp阳性细胞作为高品质干细胞的标志物而闻名。有意思的是，在osk基因的基础上将h1foo基因导入表达nanog-gfp的成纤维细胞的情况下，与导入了osk基因的情况相比，显示出nanog-gfp阳性es样细胞(ips细胞)的集落数增加至约8倍(图3b)。进而，产生的ips细胞集团中nanog-gfp阳性es样细胞(ips细胞)的比例高达90％以上(图3c)。另一方面还表明，导入了osk基因和c-myc基因(oskm基因)的情况、在oskm基因的基础上将h1foo基因(oskm+h1foo基因)导入表达nanog-gfp的成纤维细胞的情况下，与导入了osk+h1foo基因的情况相比，nanog-gfp阳性集落数随然多(图3b)，但产生的ips细胞集团中nanog-gfp阳性细胞的比例低(图3c)。这些结果表明，将osk+h1foo基因导入体细胞的情况下，与作为现有技术的导入了osk基因的情况、或者导入了oskm基因的情况相比，能够产生高品质ips细胞集团。
[osk+h1foo-ips细胞的性质]
详细地对osk+h1foo-ips细胞的性质进行分析。按照上述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法，对4种多能性标志物(oct3/4、sox2、rex1和sall4)的表达进行分析，结果表明，osk+h1foo-ips细胞与osk-ips细胞同样表达上述多能性标志物(表4)。其中，包括h1foo基因的外源性基因的表达被抑制(表5)。此外，还对细胞增殖率进行了分析，结果，osk+h1foo-ips细胞的增殖水平与osk-ips细胞为同等水平。
[表4]
表4为显示对es细胞(es)、3个osk-ips细胞克隆(osk-ips1～3)、3个osk+h1foo-ips细胞克隆(oskh-ips1～3)、和mef细胞(mef)中5种多能性标志物(nanog、oct3/4、sox2、rex1和sall4)的表达进行分析的结果的表。其中，各多能性标志物的表达量显示的是将es细胞的结果作为1时的相对值。
[表5]
表5是显示对es细胞(es)、oskh基因导入mef细胞(mef+oskh)、3个osk-ips细胞克隆(osk-ips1～3)、3个osk+h1foo-ips细胞克隆(oskh-ips1～3)、以及mef细胞(mef)中3种外源性蛋白质(oct3/4、sox2和h1foo)的表达进行分析的结果的表。其中，各多能性标志物的表达量显示的是将oskh基因导入mef细胞的结果作为1时的相对值。
此外，在osk+h1foo-ips细胞与es细胞或osk-ips细胞之间，对全基因转录组图谱进行比较(图4a和b)。其结果表明，osk+h1foo-ips细胞中的基因表达模式与es细胞、osk-ips细胞中的基因表达模式非常类似(0.99的相关函数[r2])。
此外，根据上述[dna甲基化分析]项目中记载的方法，进行基因组dna的甲基化分析。其结果是，osk+h1foo-ips细胞与es细胞、osk-ips细胞同样，两种多能性标志物(oct3/4和nanog)基因的启动子区域、ig-dmr和gtl2-dmr的dna是去甲基化的(图5a和b)。其中，在osk-ips细胞中，克隆(细胞组)间去甲基化水平确认到差异，而在osk+h1foo-ips细胞中，这样的差异的程度低(图5a和b)。
[osk+h1foo-ips细胞来源的eb的性质]
从ips细胞向各种细胞分化诱导时，通常进行的是，首先形成eb，其后通过特异性分化诱导法进一步分化诱导为各种细胞。认为形成的eb的数量、eb大小的均一性影响其后的分化诱导效率，因此认为，优选能够形成大小均一且数量多的eb的ips细胞。因此，对osk+h1foo-ips细胞的eb形成能力进行分析。
按照上述[胚胎样体(eb)形成]项目中记载的方法从osk+h1foo-ips细胞形成eb，结果，所述osk+h1foo-ips细胞来源的eb与osk-ips细胞来源的eb相比，eb的数量多(按比例提高约12％)，且eb的大小(μm2)大(图6a～c)，此外，eb大小(μm2)的差异(σ2)小(按比例降低约50％)(图6d和e)。
此外，按照上述[凋亡检测]项目中记载的方法对凋亡细胞的比例进行分析，结果表明，osk+h1foo-ips细胞来源的eb与osk-ips细胞来源的eb相比，凋亡初期细胞(膜联蛋白v阳性(+)/pi阴性(-)细胞)、凋亡后期细胞(膜联蛋白v(+)/pi(+)细胞和膜联蛋白v(-)/pi(+)细胞)的比例小，活细胞(膜联蛋白v(-)/pi(-)细胞)的比例高(图7a和b)。osk+h1foo-ips细胞来源的eb与osk-ips细胞来源的eb相比，活细胞(膜联蛋白v(-)/pi(-)细胞)的比例提高至约1.2倍。此外，osk+h1foo-ips细胞来源的eb与osk-ips细胞来源的eb相比，凋亡细胞(膜联蛋白v(+)/pi(-)细胞和膜联蛋白v(+)/pi(+)细胞的合计)的比例降低至约0.65倍。
进而，对于开始用eb形成用培养液的培养后第2天的ips细胞，按照上述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法对两种细胞增殖标志物(ki67和pcna)的表达进行分析，结果表明，osk+h1foo-ips细胞来源的eb与osk-ips细胞来源的eb相比，上述细胞增殖标志物的表达量高(提高至约2.4～2.6倍)(图8a和b)。
以上的结果表明，使用osk+h1foo-ips细胞形成eb的情况下，与使用osk形成eb的情况相比，能够产生大小较均一、数量多且死细胞的比例小的eb(高品质eb)。
[osk+h1foo-ips细胞的分化多能性]
对osk+h1foo-ips细胞的分化多能性进行分析。按照上述[es细胞和ips细胞的共培养凝集法]项目中记载的方法，使用osk+h1foo-ips细胞中两种染色体数正常的克隆(oskh1和3)制作嵌合小鼠。此外，作为对照，使用osk-ips细胞中两种染色体数正常的克隆(osk1和2)，按照同样的方法制作嵌合小鼠。其中，本实验中使用的ips细胞、es细胞是由黑色小鼠的体细胞制作的，因此ips细胞、es细胞的嵌合体形成能力越高，则以越高的比例制作出越黑的小鼠。嵌合小鼠制作试验的结果表明，两种osk+h1foo-ips细胞的克隆(oskh1和3)具有与osk-ips细胞的两种克隆(osk1和2)同等或更高的嵌合体形成能力(图9a和b)。尤其是表明，oskh3具有与es细胞同等水平的嵌合体形成能力(图9a和b)。
生殖系统转移能力(germlinetransmissionpotential，也称为性腺移行能)是指，es细胞、ips细胞等多能性干细胞能够分化成生殖细胞、能够通过嵌合体将多能性干细胞来源的基因传递至下一代的能力。该生殖系统转移能力(germlinetransmissionpotential)是作为多能性干细胞的最为严格的特征之一，是表示多能性干细胞为高品质的特征之一。因此，通过体外受精(ivf)调查100％嵌合小鼠来源的生殖系统转移能力。其结果是，4种osk+h1foo-ips细胞来源的嵌合小鼠(oskh1、oskh3-1、oskh3-2和oskh3-3)显示出比两种osk-ips细胞来源的嵌合小鼠(osk2-1和osk2-2)高的生殖能力(图10a)，同时，生产出更多毛带色的幼仔(图10b和c)。需要说明的是，未确认到所述幼仔中表型的异常。
以上的结果表明，osk+h1foo-ips细胞具有高的分化多能性力。
3.方法
[人ips细胞的产生和细胞培养方法]
人ips细胞的产生按照文献(seki,t.,yuasa,s.,fukuda,k.,generationofinducedpluripotentstemcellsfromasmallamountofhumanperipheralbloodusingacombinationofactivatedtcellsandsendaivirus,natureprotocols7,718-728,2012)中记载的方案进行。使用包含人oct3/4、sox2、klf4、l-myc和h1foo基因(序列编号1的核苷酸序列：bc047943)的仙台病毒载体，从人末梢血淋巴细胞或人皮肤成纤维细胞产生ips细胞(oskl+h1foo-ips细胞)。其中，作为对照，使用azami-green基因代替h1foo基因，产生ips细胞(oskl-ips细胞)。此外，本实验按照庆应义塾大学的基因重组实验指南进行。
人ips细胞株是，在用imatrix-511(nippi公司制)包被的培养皿中，在stemfitak02n(味之素公司制)培养液(以下称为“人ips细胞培养液”)中培养、保持。其中，人ips细胞的培养液每2天更换，细胞每5～7天用stemproaccutase(gibco公司制)继代。
4.结果
[反映ips细胞染色体异常的基因表达量的比较]
为了进行按照上述[人ips细胞的产生和细胞培养方法]项目中记载的方法建立的人ips细胞的基因组不稳定性的比较研究，对于如果有染色体异常则表达量降低的srf基因、actg2基因(lamm,n.,kerem,b.,genomicinstabilityinhumanpluripotentstemcellsarisesfromreplicativestressandchromosomecondensationdefectscellstemcell18(2):253-261.2016)，通过定量rt-pcr分析对其表达量进行比较研究。所述定量rt-pcr分析是，使用4个克隆的oskl+h1foo-ips细胞和4个克隆的oskl-ips细胞(对照)，按照上述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法进行。将关于srf基因的定量rt-pcr分析结果示于图11a，将关于actg2基因的定量rt-pcr分析结果示于图11b。
如由图11的a和b的结果可见，oskl+h1foo-ips细胞组中，关于srf基因和actg2基因，均显示出比oskl-ips细胞组(对照)显著高的表达量。由该结果可见，如果在核重编程物质的基础上使用h1foo基因，则ips细胞建立过程中产生的染色体异常受到抑制，能够产生品质更高ips细胞集团。
[ips细胞的未分化标志物表达量的比较]
为了研究按照上述[人ips细胞的产生和细胞培养方法]项目中记载的方法建立的ips细胞是否维持了稳定的未分化状态，通过定量rt-pcr分析对oct3/4基因(干细胞的未分化标志物)的表达量进行比较研究。所述定量rt-pcr分析是，使用4个克隆的oskl+h1foo-ips细胞和4个克隆的oskl-ips细胞(对照)，按照上述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法进行。将所述定量rt-pcr分析结果示于图12。
如由图12的结果可见，与oskl-ips细胞组(对照)相比，oskl+h1foo-ips细胞组中，oct3/4基因(干细胞的未分化标志物)表达量的克隆间差异显著减小。由该结果可见，如果在核重编程物质的基础上使用h1foo基因，则可维持更稳定的未分化状态，能够产生品质差异更小的ips细胞集团。
[分化诱导初期细胞生存率的比较]
为了对按照上述[人ips细胞的产生和细胞培养方法]项目中记载的方法建立的人ips细胞的分化诱导初期细胞存活数进行比较研究，在播种一定数量的细胞(1×106细胞/孔)后，从ips细胞培养液更换为rpmi-1640(西格玛奥德里奇公司制)+b27添加剂(b27supplement)(gibco公司制)培养液，第二天回收细胞，使用台盼蓝溶液算出存活细胞数而进行比较。对4个克隆的oskl+h1foo-ips细胞和4个克隆的oskl-ips细胞(对照)进行所述性细胞数的计算，将其结果示于图13。
如由图13的结果可见，与oskl-ips细胞组(对照)相比，oskl+h1foo-ips细胞组中，分化诱导后的存活细胞数显著多，确认到在分化诱导环境下适应能力高的倾向。由该结果表明，如果在核重编程物质的基础上使用h1foo基因，则能够产生分化诱导后的存活细胞数更多、在分化诱导环境下的适应能力更高的、品质更高ips细胞集团。
[ips细胞的分化诱导初期的未分化标志物残余量的比较]
进行按照上述[人ips细胞的产生和细胞培养方法]项目中记载的方法建立的人ips细胞的分化诱导初期oct3/4基因(干细胞的未分化标志物)的残余量的比较。具体而言，在各孔中播种一定数量的细胞(1×106细胞/孔)后，从ips细胞培养液更换至分化诱导培养液[dmemf12ham(西格玛奥德里奇公司制)+fbs(gibco公司制)+glutamax(gibco公司制)+penstrep(gibco公司制)+2巯基乙醇(西格玛奥德里奇公司制)]，在更换培养液后第5天回收细胞，使用定量rt-pcr分析对作为未分化标志物的oct3/4基因的表达量进行比较。所述定量rt-pcr分析是，使用4个克隆的oskl+h1foo-ips细胞和4个克隆的oskl-ips细胞(对照)，按照上述[定量rt-pcr分析]项目中记载的方法进行。将所述定量rt-pcr分析结果示于图14。
如由图14的结果可见，oskl-ips细胞组(对照)中，不管是否用分化诱导培养液培养了5天，未分化标志物(oct3/4)高度残余的克隆(oskl-ips2、oskl-ips4)都存在多个，而oskl+h1foo-ips细胞组中，任何克隆中未分化标志物的表达均低，而且，克隆间未分化标志物的表达差异显著小。由这些结果可见，在核重编程物质的基础上使用h1foo基因制作的ips细胞如果用分化诱导培养液培养，则未分化标志物的表达迅速消失，该消失的差异小。因此表明，如果在核重编程物质的基础上使用h1foo基因，则能够产生品质差异更小的ips细胞集团。
产业可利用性
本发明能够提供ips细胞的品质改善剂、ips细胞的制造方法、通过所述制造方法制造的ips细胞、以及ips细胞制造用组合物。根据本发明，能够制造品质更高而且品质差异更小的ips细胞。
序列表
<110>心脏康复株式会社
<120>高品质ips细胞的制造方法
<130>2016c9493
<150>jp2015-138645
<151>2015-07-10
<160>60
<170>patentinversion3.1
<210>1
<211>624
<212>dna
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<223>发明人:汤浅慎介;福田恵一;国富晃
<400>1
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<211>207
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<213>人
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ilelysalaserserserlysvalserserglnargalagluala
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<210>3
<211>915
<212>dna
<213>小鼠
<400>3
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